半定量RT-PCR检测腺样囊性癌细胞survivin mRNA的表达

目的探讨靶向surv iv in基因阻断后mRNA表达量的变化,以及在体外对肿瘤细胞的抑制作用。方法应用分子克隆技术构建siRNA真核表达载体Pgenesil/sur;通过脂质体转染腺样囊性癌(salivary adeno id cystic carcinom a,SACC)细胞。采用RT-PCR技术检测转染前后surv iv in mRNA表达量以及表达抑制率。结果转染后surv iv in mRNA表达水平x-±s(0.42±0.10)较转染前surv iv in mRNA表达水平(1.56±0.12)明显减低,P<0.05;在mRNA水平其表达抑制率为73.1%。转染空质粒载体Pgenesil-1 surv iv in mRNA表达水平(1.35±0.13)与空白对照组比较无统计学差异(P>0.05)。结论靶向surv iv in siRNA能阻断肿瘤细胞surv iv in基因mRNA表达,并有效抑制体外培养的肿瘤细胞SACC-83的增殖作用。     

RNA干扰survivin基因在EC109细胞中作用的体内实验研究

目的研究RNA干扰survivin基因对EC109细胞体内增殖的影响。方法构建siRNA-survivin真核表达载体，转染EC109细胞，筛选得到稳定细胞克隆。同时设非特异siRNA载体转染为对照；通过裸鼠移植瘤模型的成瘤时间、瘤结节重量，比较各组细胞在体内的增殖速度；免疫组织化学染色检测移植瘤的细胞凋亡。结果siRNA-survivin转染的EC109细胞组在裸鼠体内成瘤时间为（8．86&#177;1．069）d，高于其它各组；平均瘤重为（0．32&#177;0．12）g，低于其它组，均有显著差异（P〈0．05）；TUNEL法细胞凋亡检测，siRNA-survivin转染的EC109细胞组的凋亡指数为（10．52&#177;4．35），高于其它组，具有显著性差异（P〈0．05）；结论RNA干扰survivin基因具有抑制人食管癌EC109细胞体内增殖的作用，诱导细胞的凋亡是其重要作用机制。     

人野生型P53与反义mdm2基因融合体真核表达载体的构建及其在Mc3细胞中的表达

目的构建P^53与反义mdm2 cDNA序列真核表达载体，并探讨其在人黏液表皮样癌高转移细胞株Mc3细胞中的表达。方法应用分子克隆技术，将mdm2 cDNA序列反向插入到含有P^53基因序列pDOR—Neo中的P^53。基因序列下游，构成含有P^53基因与反义mdm2基因融合基因的逆转录病毒表达载体。经酶切分析鉴定后命名为pDOR—Neo—P^53-F mdm2并将重组载体通过脂质体转染Mc3细胞，通过G418筛选转染阳性细胞，并采用Westernblot方法检测P^53蛋白表达。结果酶切鉴定证实重组载体含有P^53与反义mdm2 cDNA片段，实验结果表明：转染后P^53蛋白（1．35&#177;0．14）较对照组P^53蛋白（6．26&#177;0．11）含量显著减低（P〈0．01），转染空载体P^53蛋白（6．24土0．12）与对照组比较无统计学差异（P〉0．05）。结论P^53与反义mdm2基因融合体真核表达载体构建成功，并表达野生型P^53蛋白和封闭mdm2基因，为今后进一步研究打下了基础。     

脑源性神经营养因子对骨髓基质细胞分化过程中致瘤性的影响

目的：观察脑源性神经营养因子对体外培养骨髓基质细胞致瘤性的影响一方法：实验于2003-05／2004-06在南方医科大学临床解剖学研究所及珠江医院神经医学研究所完成。分离培养大鼠骨髓基质细胞，用含有脑源性神经营养因子受体trkB基因的增强型绿色荧光蛋白真核表达载体(pEGFP)-C2-trkB转染骨髓基质细胞。分别收集转染了增强型绿色荧光蛋白真核表达载体-C2-trkB及增强型绿色荧光蛋白真核表达载体．C2的细胞，以未转染的骨髓基质细胞为阴性对照，采用半定量的反转录聚合酶链式反应法测定各组细胞中trkB信使核糖核酸(trkB mRNA)的表达水平。在培养基中加入脑源性神经营养因子，应用双层软琼脂糖培养的方法，观察经过不同处理的细胞的克隆形成率。结果：增强型绿色荧光蛋白真核表达载体-C2-trkB可高效地转染骨髓基质细胞。转染增强型绿色荧光蛋白真核表达载体-C2-trkB组trkB信使核糖核酸表达水平明显高于未转染细胞组及转染增强型绿色荧光蛋白真核表达载体-C2细胞组[13．6073&;#177;1．8957，0．3052&;#177;0．0043，0．3075&;#177;0．0037，(P&;lt;0．05)]。转染增强型绿色荧光蛋白真核表达载体-C2-trkB组克隆形成率明显小于转染增强型绿色荧光蛋白真核表达载体-C2细胞组、未转染细胞组及胶质瘤细胞U251组[0．2347&;#177;0．0389，0．6751&;#177;0．0506，0．7023&;#177;0．0467及7．3381&;#177;0．6813，(P&;lt;0．05)]：结论：脑源性神经营养因子可降低骨髓基质细胞分化过程中的致瘤性，抑制骨髓基质细胞向肿瘤细胞方向分化。     

Snail1外源性过表达诱导HepG2细胞上皮间叶样表型转化的实验研究

目的探讨Snaill蛋白诱导肝癌细胞发生上皮间叶表型转化并增强其侵袭转移能力的效应。方法利用重组腺病毒载体pAdEasy-SNAI1高效感染HepG2肝癌细胞株,诱导外源性Snail1蛋白过表达,以空载腺病毒pAdEasy-GFP作为对照。利用RT-PCR、Westernblot和细胞免疫组织化学的方法,检测转染后HepG2细胞Snail1、E—eadherin、N-eadherin、Vimaentin的mRNA转录和蛋白表达水平。随机运动实验及侵袭实验检测HepG2细胞转染目的基因后运动侵袭能力的改变。结果①pAdEasy-SNAI1高效感染HepG2细胞,与对照组相比SNAI1mRNA和Snail1蛋白表达均显著增强（分别为1．591&#177;0．090、0．414&#177;0．031,0．995&#177;0．009、0．423&#177;0．002。P〈0．01）,Snai1蛋白在胞浆和胞核着色明显强化。②实验组HepG2细胞,在mRNA和蛋白水平E-cadherin表达均显著受到抑制（分别为0．528&#177;0,037、1．668&#177;0．065,0．284&#177;0．003、1．067&#177;0．011,P〈0．01）,N—cadhrein、Vimentin表达则明显上调（N—eadhrein：0．945&#177;0．029、0．600&#177;0．015,0．655&#177;0．007、0．226&#177;0．007,P〈0．01;Vimentin：1．630&#177;0．123、0．291&#177;0．024,0.692&#177;0,009、0．219&#177;0．005,P〈0．01）;③实验组随机运动实验中各观察时相点细胞空白区均小于对照组;侵袭实验中,实验组穿膜细胞数多于对照组（59．4&#177;7．48、23．9&#177;4．15,P〈0．01）。结论外源性Snail1蛋白过表达能诱导HepG2细胞出现EMT样变化,细胞运动、侵袭能力增强。     

人源载体pHrnF9介导的凝血因子Ⅸ基因在肠上皮sw480细胞中的表达

本研究探索肠上皮细胞和人源载体pHrnFⅨ用于血友病B基因治疗的可能性。用含人凝血因子Ⅸ（human coagulation factorⅨ，hFⅨ）基因的人源载体质粒pHrnF9转染肠上皮细胞sw480，用RT-PCR检测mRNA的转录，荧光显微镜观察转染效率，ELISA和一期法检测蛋白表达及凝血活性。结果表明：转染后的细胞中有hFⅨmRNA的转录；荧光显微镜观察到48小时转染效率最高；ELISA法测得转染后24小时细胞上清中的hFⅨ蛋白量为（11．34&#177;0．23）ng／（10^6cells&#183;24h），第48小时hFⅨ蛋白量最高，达（29．34&#177;1．00）ng／（10^6cells&#183;24h），转染后72小时降为（12．45&#177;0．15）ng）／（10^6cells&#183;24h）。一期法结果显示转染pHrnF9的sw480细胞分泌的FⅨ有凝血活性，48小时达峰值（6．07&#177;0、17）％／10^6cells，第72小时降至（1．81&#177;0．06）％／10^6cells。结论：肠上皮细胞sw480转染pHrnF9质粒后可表达有凝血活性的hFⅨ，肠上皮细胞有望成为血友病B基因治疗的靶细胞。     

反义T-STAR基因对A549细胞的调节作用

目的：观察反义T-STAR基因对肺腺癌细胞A549的T-STAR蛋白表达的调节作用。 方法：实验于2002-09／2004-03在西南医院中心实验室完成。①用双酶切定向克隆法．构建T-STAR反义核酸真核表达载体pneo-STAR。②A549细胞分4组用脂质体介导转染法分别转染：A549-STAR细胞组转入正义T-STAR基因真核表达载体pEGFP-C1／T-STAR，A549-asSTAR细胞组转入反义T-STAR基因真核表达载体pneo-STAR，A549-neo细胞组转入空载体质粒pcl-neo，A549细胞组为相同处理下不加任何载体的A549细胞。③用反转录-聚合酶链反应和western blot联合检测以上各组细胞的T-STAR表达情况。 结果：①A549-STAR细胞组的T-STAR蛋白和RNA表达量显著高于A549细胞组[（19434&;#177;219）和（1．280&;#177;0．018），（6922&;#177;113）和（0．323&;#177;0．015），P〈0．05]。②A549-asSTAR细胞组的T-STAR蛋白和RNA表达量[（1122&;#177;97），（0．133&;#177;0．005）]显著低于A549细胞组（P〈0．05）。③A549-neo细胞组的T-STAR蛋白和RNA表达量[（6295&;#177;143），（0．625&;#177;0．085）]与A549细胞组差异无显著性意义（P〉0．05）。 结论：导入正义T-STAR基因后的A549细胞中，T-STAR蛋白及RNA表达增加，导入反义T-STAR基因后的A5．9细胞中，T-STAR蛋白及RNA表达减少，说明反义核酸真核表达载体pneo-STAR可以特异性降低A549细胞中T-STAR基因的表达．为进一步研究T-STAR基因的功能奠定了基础。     

凋亡抑制基因Survivin siRNA真核表达载体的构建

目的构建靶向survivin siRNA真核表达载体,通过RNA干扰技术阻断survivin基因表达。方法针对目的基因survivin序列设计双链DNA(dsDNA),采用DNA重组技术与载体连接,转化感受态细胞经诱导表达筛选阳性克隆子。结果重组质粒经酶切、测序鉴定,证实插入载体目的基因片段大小与插入方向正确,符合其物理图谱。结论靶向survivin siRNA真核表达载体可用于转染肿瘤细胞,阻断survivin基因表达并诱导细胞凋亡的RNAi实验研究,为肿瘤的基因治疗提供一种新的方法。     

RNA干扰技术沉默黏附斑激酶诱导心脏成纤维细胞失巢凋亡

目的：利用短发夹RNA干扰载体介导的RNA干扰技术沉默成年大鼠心脏成纤维细胞中黏附斑激酶，观察细胞增殖和凋亡的变化。方法：实验于2004-12／2005-12在解放军第三军医大学新桥医院中心实验室完成。实验选用10-12周龄清洁级的雄性Wistar大鼠24只，以转染靶向黏附斑激酶的重组RNA干扰质粒的心脏成纤维细胞为干预组，选择未转染细胞和转染空质粒、非特异siRNA的细胞为不同对照组，共4组，各6只。消化法培养大鼠心脏成纤维细胞，设计、构建和鉴定黏附斑激酶RNA干扰载体，western blot法测量黏附斑激酶的沉默效率，四唑盐比色法检测细胞增殖，DNA缺口末端标记技术检测细胞凋亡，流式细胞仪测定B细胞淋巴瘤2和bax的变化。结果：Wistar大鼠24只，全部进入结果分析。①酶切鉴定和测序鉴定表明黏附斑激酶RNA干扰载体构建成功，转染细胞后，Western blot结果表明第二个重组黏附斑激酶RNA干扰载体的RNA沉默效率最高，为72．1％，其余分别为66．2％和55．3％。（2）Pavu6＋27一黏附斑激酶2转染组A。值明显低于未转染细胞和转染空质粒、非特异siRNA组（0．179&;#177;0．017，0．30&;#177;0．002，0．296&;#177;0．006，0．28l&;#177;0．007；t=17．802，16．436，14．993，P〈0．01）：凋亡率较其余各组则明显升高【（22．28&;#177;2．13）％，（472&;#177;1．67）%，（636&;#177;92）％，（8．19&;#177;1．33）％；t=-19．05，-17．31，-15．16，P〈0．01]。（3）Pavu6＋27-黏附斑激酶2转染组bax上升明显，与正常对照组和空质粒转染组比较，差异十分显著（2．15&;#177;058，1．01&;#177;0．04，1．12&;#177;0．04；t=-4．79，-4．318，P〈0．01）；与阴性对照组比较，差异显著（1．19&;#177;0．31,t=-3．59，P〈0．05）。④Pavu6＋27-黏附斑激酶2转染组B细胞淋巴瘤-2表达较正常对照组、空质粒转染组、阴性对照组显著上升（1．62&;#177;0．15，1．04&;#177;0．03，1．09&;#177;0．01，1．23&;#177;0．04；t=-9．39，-8．701，-6．338，P〈0．05）。结论：通过RNA干扰技术沉默心脏成纤维细胞中黏附斑激酶基因的表达，可诱导心脏成纤维细胞凋亡，抑制或降低心脏成纤维细胞中黏附斑激酶表达可能是防治心肌纤维化的一种手段。     

配对免疫球蛋白样受体B在小鼠树突细胞上的表达及其与免疫耐受关系的研究

目的研究配对免疫球蛋白样受体B（PIR—B）在小鼠树突细胞（Dc）上的表达及其与免疫耐受的关系。方法DC2．4为C57BL／6小鼠来源的不成熟的DC株。脂多糖（LPS）刺激48h为成熟DC（mDC）。分别以重组小鼠IL-10（rmlL-10）、重组人转化生长因子β1（rhTGFβ1）诱导DC2．4为耐受性DC（T—DC），体外化学合成PIR—B特异性RNA小干扰分子（siRNA），以Lip2000转染DC2．4（si．Dc），分别用半定量RT—PCR、Westernblot检测maiL-10、rhTGFβ1、LPS及PIR—B特异的siRNA对DC2．4上PIR—B表达的变化。以。H—TdR标记检测同种异体淋巴细胞反应（MLR），ELISA法测定MLR上清中IFN-γ的水平变化。结果RT—PCR、Westernblot结果显示DC2．4表达PIR—BmRNA及蛋白相对值为0．51±0．08和0．58±0．23；mlL-10、rhTGFβ1诱导的T—DC上PIR—B的mRNA及蛋白表达相对水平均明显升高，相对值分别为0．85±0．07和0．87±0．14；0．79±0．10和0．85±0．34（P值均〈0．05），LPS刺激的mDCPIR—BmRNA及蛋白表达则降低（0．35±0．10和0．32±0．04，P〈0．05），转染PIR—B特异性siRNA后DC2．4上PIR—B的mRNA及蛋白表达水平也明显受抑，干扰48h后分别下降了78．9％和74．2％（P〈0．05）。正常DC2．4可以刺激异基因淋巴细胞增殖；LPS—DC刺激异基因淋巴细胞增殖的能力明显增强，其反应体系中的IFN-γ水平明显升高；T—DC刺激淋巴细胞增殖的能力明显受到抑制，其反应体系中的IFN-γ水平明显下降；而转染PIR—BsiRNA后，DC刺激淋巴细胞增殖的能力得到明显恢复，其反应体系中的IFN-γ水平明显回升。结论高度表达免疫抑制性受体PIR—B是小鼠DC获得免疫耐受的共同特征及分子机制之一。