抗藤黄微球菌Rpf结构域单克隆抗体的制备与特性鉴定

目的:克隆、表达藤黄微球菌Rpf结构域多肽,并制备针对该多肽的单克隆抗体(mAb).方法:采用聚合酶链反应(PCR)藤黄微球菌基因组中扩增出藤黄微球菌Rpf结构域基因,用限制性内切酶消化后插入到pUC-19克隆载体中,测序正确后,再亚克隆到融合表达载体pPro-EXHT中,转化大肠杆菌DH5α,目的基因经IPTG诱导,由T7启动子调控表达了氨基端带6个连续组氨酸残基的Rpf结构域基因多肽,在变性条件下纯化目的蛋白.用纯化的目的蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠,进行细胞融合、克隆化制备抗Rpf domain单抗(mAb),用ELISA法初步鉴定其特异性和相对亲和力.结果:在变性条件下用Ni2 -NTA亲和色谱柱纯化目的融合蛋白,纯化获得的蛋白纯度大于90%.用该融合蛋白免疫小鼠后,获得了3株抗Rpf domain mAb,这3株mAb均特异性识别Rpf domain多肽.结论:所获得的抗Rpf domain mAb特异性强、效价高,对进一步研究Rpf domain在结核病免疫预防中的作用提供了有力的工具.     

pCD-Em10对泡球蚴感染小鼠免疫应答的影响

目的：探讨pCD-Em10免疫对泡球蚴感染小鼠免疫应答的影响。方法：将pCD-Em10肌肉注射免疫BALB/c鼠,免疫后8周用Em原头节进行攻击感染,感染后18周剖杀小鼠,计算减蚴率;取脾并分离脾细胞,流式细胞仪检测脾CD4^＋和CD8^＋T淋巴细胞亚群的百分比;用EmAg或ConA刺激培养脾细胞,收集脾细胞培养上清液,用试剂盒检测脾细胞培养上清液的IL-2、IFN-γ、TNF-α和IL-4水平;流式细胞仪检测脾细胞的凋亡发生率,同时设有BCG和PBS对照。结果：pCD-Em10免疫组的减蚴率为71.17%,脾CD4^＋T细胞亚群显著增加,IFN-γ和TNF-α水平升高,IL-4水平降低,脾细胞凋亡发生率明显低于PBS对照组。结论：pCD-Em10可诱导泡球蚴感染小鼠产生一个保护性的免疫反应。     

颗粒性HBV多CTL表位基因诱导BALB/c小鼠的免疫应答研究

目的：研究含HBV多CTL表位的杂合HBc基因免疫BALB/c小鼠所诱导的免疫应答.方法：构建以HBV多CTL表位取代MIR区基因的杂合HBc基因疫苗（pHBcMep）并以肌肉注射方式免疫BALB/c小鼠,ELISA、流式细胞术、LDH释放法等分别检测血清特异性抗体与淋巴细胞分泌的IFN-γ水平、CD4^＋/CD8^＋T细胞比例变化及特异性CTLs活性等免疫应答指标.结果：颗粒性杂合HBc基因疫苗pHBcMep免疫BALB/c小鼠诱导明显抗体应答,末次免疫后2周,特异性抗preS2抗体阳性率达100%（12/12）,最高效价1∶1 000,同时诱导淋巴细胞分泌IFN-γ能力增强和刺激CTLs活化,其杀伤活性达16 IU30,CD4^＋/CD8^＋T细胞比例明显升高,且诱导明显回忆反应.结论：颗粒性HBV多CTL表位基因疫苗pHBcMep具有良好免疫原性,能迅速诱导高活性体液和细胞免疫应答及回忆反应.     

肝再生增强因子对外原性抗原引起机体免疫应答影响的研究

目的 研究rALR对HBsAg及BSA免疫大鼠产生抗体、细胞因子和对脾脏细胞增殖的影响.方法 甲醇诱导表达rALR,测定活性并进行以下研究.①rALR对HBsAg免疫的影响:实验分为:生理盐水、HBsAg20 μg/只、HBsAg20 μg rALR100 μg/kg、HBsAg20 μg rALR 25 μg*kg、HBsAg20 v pPIC9K表达上清、HBsAg20 μg CsA10mg/kg,共6组;②rALR对BSA免疫的影响:实验分为:生理盐水、BSA25 μg/只、BSA25 μg rALR100 μg/kg、BSA25 μg pPIC9K表达上清、BSA25 μg CsA10 mg/kg,共5组.以上均皮下注射免疫大鼠,1次/周×4次,ELISA检测血清中相应抗体、IL-2和IFN-γ.③rALR对大鼠脾细胞增殖的影响:Wisar大鼠先皮下注射HBsAg(20 μg/只)1次,2周后处死,分离脾单核细胞,种板,再加HBsAg 1 μg/孔和/或相应处理因素(rALR、空质粒表达产物等),48h后加3H-TdR,12 h后收集细胞,检测cpm值.结果 rALR100 μg/kg HBsAg组的8只动物中,有2只出现抗HBs的抗体,空质粒对照组和单用HBs Ag组8只动物均出现抗HBs.rALR 100 μg/kg BSA组的8只动物中,有3只出现抗BSA抗体,空质粒对照组和单用BSA组8只动物均出现抗BSA的抗体.rALR 100μg/kg能明显抑制细胞因子IL2及IFN-γ的产生.rALR4μg体外能明显抑制脾细胞的增殖.结论 rALR能抑制HBsAg和BSA诱导大鼠产生相应抗体及IL-2、IFN-γ的产生;体外能抑制经体内致敏的脾细胞的增殖,说明rALR有免疫抑制作用.     

多房棘球绦虫重组Bb-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗诱导小鼠细胞因子变化的研究

目的:研究多房棘球绦虫重组Bb-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗对原头蚴攻击小鼠细胞因子变化的影响.方法:将重组Bb-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗分别通过皮下注射、肌肉注射、鼻腔黏膜接种和口服接种免疫BALB/c小鼠12周后, 用50个多房棘球绦虫原头蚴腹腔注射进行攻击, 攻击感染后18周剖杀小鼠, 取脾脏制备淋巴细胞悬液体外培养, 分别以多房棘球绦虫抗原(EmAg)、 刀豆素A(ConA)刺激诱生白细胞介素12(IL-12)、白细胞介素10(IL-10)和干扰素γ(IFN-γ);以脂多糖(LPS)刺激诱生肿瘤坏死因子α(TNF-α).常规ELISA测定脾细胞培养上清液中IL-12、 IL-10、 IFN-γ和TNF-α水平.结果:与对照组相比,疫苗免疫组IFN-γ、 IL-12、 TNF-α水平增加, IL-10水平降低, EmAg刺激组和ConA或LPS刺激组细胞因子水平明显高于相应的原液组.结论:多房棘球绦虫重组Bb-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗可诱导攻击感染小鼠产生Th1型细胞免疫应答, 增强宿主抗多房棘球绦虫感染的保护性免疫反应.     

藤黄微球菌Rpf及其结构域蛋白对结核分枝杆菌生长的影响

目的 表达纯化藤黄微球菌(Micrococcus luteus)复活促进因子(Rpf)及结构域(domain)蛋白,研究其对结核分枝杆菌牛长的影响.方法 诱导表达含有藤黄微球菌Rpf及其结构域基因的融合表达载体pPro-EXHT-Rpf和pPro-EXHT-Rpf domain,在变性条件下对目的 蛋白进行纯化.用不同浓度的纯化蛋白刺激不可培养状态结核分枝杆菌的生长.结果 获得藤黄微球菌Rpf及其结构域融合蛋白的纯度分别为95%和93%,相对分子质量(Mr)大小分别为30×103和12×103,蛋白质含量分别为471 mg/L和337 mg/L.Western blot证实,获得的蛋白为我们所需要的目的 蛋白.所获得的藤黄微球菌Rpf及其结构域融合蛋白能够促进不可培养状态的结核分枝杆菌的生长,而抗藤黄微球菌Rpf结构域的单克隆抗体可以明显抑制结核分枝杆菌的生长.结论 表达的藤黄微球菌Rpf及其结构域融合蛋白可以促进结核分枝杆菌的生长,而且藤黄微球菌Rpf蛋白与Rpf结构域蛋白具有一致的生物活性.     

藤黄微球菌Rpf及其结构域蛋白对结核分枝杆菌生长的影响

目的 表达纯化藤黄微球菌(Micrococcus luteus)复活促进因子(Rpf)及结构域(domain)蛋白,研究其对结核分枝杆菌牛长的影响.方法 诱导表达含有藤黄微球菌Rpf及其结构域基因的融合表达载体pPro-EXHT-Rpf和pPro-EXHT-Rpf domain,在变性条件下对目的 蛋白进行纯化.用不同浓度的纯化蛋白刺激不可培养状态结核分枝杆菌的生长.结果 获得藤黄微球菌Rpf及其结构域融合蛋白的纯度分别为95%和93%,相对分子质量(Mr)大小分别为30×103和12×103,蛋白质含量分别为471 mg/L和337 mg/L.Western blot证实,获得的蛋白为我们所需要的目的 蛋白.所获得的藤黄微球菌Rpf及其结构域融合蛋白能够促进不可培养状态的结核分枝杆菌的生长,而抗藤黄微球菌Rpf结构域的单克隆抗体可以明显抑制结核分枝杆菌的生长.结论 表达的藤黄微球菌Rpf及其结构域融合蛋白可以促进结核分枝杆菌的生长,而且藤黄微球菌Rpf蛋白与Rpf结构域蛋白具有一致的生物活性.     

藤黄微球菌Rpf及其结构域蛋白对结核分枝杆菌生长的影响

目的 表达纯化藤黄微球菌(Micrococcus luteus)复活促进因子(Rpf)及结构域(domain)蛋白,研究其对结核分枝杆菌牛长的影响.方法 诱导表达含有藤黄微球菌Rpf及其结构域基因的融合表达载体pPro-EXHT-Rpf和pPro-EXHT-Rpf domain,在变性条件下对目的 蛋白进行纯化.用不同浓度的纯化蛋白刺激不可培养状态结核分枝杆菌的生长.结果 获得藤黄微球菌Rpf及其结构域融合蛋白的纯度分别为95%和93%,相对分子质量(Mr)大小分别为30×103和12×103,蛋白质含量分别为471 mg/L和337 mg/L.Western blot证实,获得的蛋白为我们所需要的目的 蛋白.所获得的藤黄微球菌Rpf及其结构域融合蛋白能够促进不可培养状态的结核分枝杆菌的生长,而抗藤黄微球菌Rpf结构域的单克隆抗体可以明显抑制结核分枝杆菌的生长.结论 表达的藤黄微球菌Rpf及其结构域融合蛋白可以促进结核分枝杆菌的生长,而且藤黄微球菌Rpf蛋白与Rpf结构域蛋白具有一致的生物活性.     

藤黄微球菌Rpf及其结构域蛋白对结核分枝杆菌生长的影响

目的 表达纯化藤黄微球菌(Micrococcus luteus)复活促进因子(Rpf)及结构域(domain)蛋白,研究其对结核分枝杆菌牛长的影响.方法 诱导表达含有藤黄微球菌Rpf及其结构域基因的融合表达载体pPro-EXHT-Rpf和pPro-EXHT-Rpf domain,在变性条件下对目的 蛋白进行纯化.用不同浓度的纯化蛋白刺激不可培养状态结核分枝杆菌的生长.结果 获得藤黄微球菌Rpf及其结构域融合蛋白的纯度分别为95%和93%,相对分子质量(Mr)大小分别为30×103和12×103,蛋白质含量分别为471 mg/L和337 mg/L.Western blot证实,获得的蛋白为我们所需要的目的 蛋白.所获得的藤黄微球菌Rpf及其结构域融合蛋白能够促进不可培养状态的结核分枝杆菌的生长,而抗藤黄微球菌Rpf结构域的单克隆抗体可以明显抑制结核分枝杆菌的生长.结论 表达的藤黄微球菌Rpf及其结构域融合蛋白可以促进结核分枝杆菌的生长,而且藤黄微球菌Rpf蛋白与Rpf结构域蛋白具有一致的生物活性.     

藤黄微球菌Rpf及其结构域蛋白对结核分枝杆菌生长的影响

目的 表达纯化藤黄微球菌(Micrococcus luteus)复活促进因子(Rpf)及结构域(domain)蛋白,研究其对结核分枝杆菌牛长的影响.方法 诱导表达含有藤黄微球菌Rpf及其结构域基因的融合表达载体pPro-EXHT-Rpf和pPro-EXHT-Rpf domain,在变性条件下对目的 蛋白进行纯化.用不同浓度的纯化蛋白刺激不可培养状态结核分枝杆菌的生长.结果 获得藤黄微球菌Rpf及其结构域融合蛋白的纯度分别为95%和93%,相对分子质量(Mr)大小分别为30×103和12×103,蛋白质含量分别为471 mg/L和337 mg/L.Western blot证实,获得的蛋白为我们所需要的目的 蛋白.所获得的藤黄微球菌Rpf及其结构域融合蛋白能够促进不可培养状态的结核分枝杆菌的生长,而抗藤黄微球菌Rpf结构域的单克隆抗体可以明显抑制结核分枝杆菌的生长.结论 表达的藤黄微球菌Rpf及其结构域融合蛋白可以促进结核分枝杆菌的生长,而且藤黄微球菌Rpf蛋白与Rpf结构域蛋白具有一致的生物活性.     

藤黄微球菌Rpf及其结构域蛋白对结核分枝杆菌生长的影响

目的 表达纯化藤黄微球菌(Micrococcus luteus)复活促进因子(Rpf)及结构域(domain)蛋白,研究其对结核分枝杆菌牛长的影响.方法 诱导表达含有藤黄微球菌Rpf及其结构域基因的融合表达载体pPro-EXHT-Rpf和pPro-EXHT-Rpf domain,在变性条件下对目的 蛋白进行纯化.用不同浓度的纯化蛋白刺激不可培养状态结核分枝杆菌的生长.结果 获得藤黄微球菌Rpf及其结构域融合蛋白的纯度分别为95%和93%,相对分子质量(Mr)大小分别为30×103和12×103,蛋白质含量分别为471 mg/L和337 mg/L.Western blot证实,获得的蛋白为我们所需要的目的 蛋白.所获得的藤黄微球菌Rpf及其结构域融合蛋白能够促进不可培养状态的结核分枝杆菌的生长,而抗藤黄微球菌Rpf结构域的单克隆抗体可以明显抑制结核分枝杆菌的生长.结论 表达的藤黄微球菌Rpf及其结构域融合蛋白可以促进结核分枝杆菌的生长,而且藤黄微球菌Rpf蛋白与Rpf结构域蛋白具有一致的生物活性.     

藤黄微球菌Rpf及其结构域蛋白对结核分枝杆菌生长的影响

目的 表达纯化藤黄微球菌(Micrococcus luteus)复活促进因子(Rpf)及结构域(domain)蛋白,研究其对结核分枝杆菌牛长的影响.方法 诱导表达含有藤黄微球菌Rpf及其结构域基因的融合表达载体pPro-EXHT-Rpf和pPro-EXHT-Rpf domain,在变性条件下对目的 蛋白进行纯化.用不同浓度的纯化蛋白刺激不可培养状态结核分枝杆菌的生长.结果 获得藤黄微球菌Rpf及其结构域融合蛋白的纯度分别为95%和93%,相对分子质量(Mr)大小分别为30×103和12×103,蛋白质含量分别为471 mg/L和337 mg/L.Western blot证实,获得的蛋白为我们所需要的目的 蛋白.所获得的藤黄微球菌Rpf及其结构域融合蛋白能够促进不可培养状态的结核分枝杆菌的生长,而抗藤黄微球菌Rpf结构域的单克隆抗体可以明显抑制结核分枝杆菌的生长.结论 表达的藤黄微球菌Rpf及其结构域融合蛋白可以促进结核分枝杆菌的生长,而且藤黄微球菌Rpf蛋白与Rpf结构域蛋白具有一致的生物活性.     

藤黄微球菌Rpf及其结构域蛋白对结核分枝杆菌生长的影响

目的 表达纯化藤黄微球菌(Micrococcus luteus)复活促进因子(Rpf)及结构域(domain)蛋白,研究其对结核分枝杆菌牛长的影响.方法 诱导表达含有藤黄微球菌Rpf及其结构域基因的融合表达载体pPro-EXHT-Rpf和pPro-EXHT-Rpf domain,在变性条件下对目的 蛋白进行纯化.用不同浓度的纯化蛋白刺激不可培养状态结核分枝杆菌的生长.结果 获得藤黄微球菌Rpf及其结构域融合蛋白的纯度分别为95%和93%,相对分子质量(Mr)大小分别为30×103和12×103,蛋白质含量分别为471 mg/L和337 mg/L.Western blot证实,获得的蛋白为我们所需要的目的 蛋白.所获得的藤黄微球菌Rpf及其结构域融合蛋白能够促进不可培养状态的结核分枝杆菌的生长,而抗藤黄微球菌Rpf结构域的单克隆抗体可以明显抑制结核分枝杆菌的生长.结论 表达的藤黄微球菌Rpf及其结构域融合蛋白可以促进结核分枝杆菌的生长,而且藤黄微球菌Rpf蛋白与Rpf结构域蛋白具有一致的生物活性.     

藤黄微球菌Rpf及其结构域蛋白对结核分枝杆菌生长的影响

目的 表达纯化藤黄微球菌(Micrococcus luteus)复活促进因子(Rpf)及结构域(domain)蛋白,研究其对结核分枝杆菌牛长的影响.方法 诱导表达含有藤黄微球菌Rpf及其结构域基因的融合表达载体pPro-EXHT-Rpf和pPro-EXHT-Rpf domain,在变性条件下对目的 蛋白进行纯化.用不同浓度的纯化蛋白刺激不可培养状态结核分枝杆菌的生长.结果 获得藤黄微球菌Rpf及其结构域融合蛋白的纯度分别为95%和93%,相对分子质量(Mr)大小分别为30×103和12×103,蛋白质含量分别为471 mg/L和337 mg/L.Western blot证实,获得的蛋白为我们所需要的目的 蛋白.所获得的藤黄微球菌Rpf及其结构域融合蛋白能够促进不可培养状态的结核分枝杆菌的生长,而抗藤黄微球菌Rpf结构域的单克隆抗体可以明显抑制结核分枝杆菌的生长.结论 表达的藤黄微球菌Rpf及其结构域融合蛋白可以促进结核分枝杆菌的生长,而且藤黄微球菌Rpf蛋白与Rpf结构域蛋白具有一致的生物活性.     

藤黄微球菌Rpf及其结构域蛋白对结核分枝杆菌生长的影响

目的 表达纯化藤黄微球菌(Micrococcus luteus)复活促进因子(Rpf)及结构域(domain)蛋白,研究其对结核分枝杆菌牛长的影响.方法 诱导表达含有藤黄微球菌Rpf及其结构域基因的融合表达载体pPro-EXHT-Rpf和pPro-EXHT-Rpf domain,在变性条件下对目的 蛋白进行纯化.用不同浓度的纯化蛋白刺激不可培养状态结核分枝杆菌的生长.结果 获得藤黄微球菌Rpf及其结构域融合蛋白的纯度分别为95%和93%,相对分子质量(Mr)大小分别为30×103和12×103,蛋白质含量分别为471 mg/L和337 mg/L.Western blot证实,获得的蛋白为我们所需要的目的 蛋白.所获得的藤黄微球菌Rpf及其结构域融合蛋白能够促进不可培养状态的结核分枝杆菌的生长,而抗藤黄微球菌Rpf结构域的单克隆抗体可以明显抑制结核分枝杆菌的生长.结论 表达的藤黄微球菌Rpf及其结构域融合蛋白可以促进结核分枝杆菌的生长,而且藤黄微球菌Rpf蛋白与Rpf结构域蛋白具有一致的生物活性.