抗原负载树突状细胞对胃癌患者自身肿瘤细胞体外杀伤作用研究

目的探讨用冻融的自身胃癌抗原冲击树突状细胞(DC),体外观察其对自身细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)对自身肿瘤细胞杀伤作用的研究。方法从胃癌手术切除肿瘤周围转移引流淋巴结,提取单个核细胞,将贴壁生长的细胞用细胞因子基因重组粒巨集落和生长因子(rhGM-CSF)、基因重组白介素4(rhIL-4)、以及基因重组α-肿瘤坏死因子(rhTNF-α)联合诱导培养DC,然后用经冻融制备的自身肿瘤细胞抗原冲击DC并作用CIK细胞,最后检测CIK细胞体外杀伤三种靶细胞(自身胃癌细胞、K562和SGC-7901细胞)的活性。结果经细胞因子联合诱导培养后,DC含量明显增高,CD1a/CD14和CD80/CD86阳性细胞比刚分离的单个核细胞明显增多。DC和CIK细胞共同培养后,CIK细胞高表达CD3+CD56+。负载胃癌抗原冲击的引流淋巴结DC活化的CIK细胞,杀伤自身肿瘤细胞活性达78.6%,而单纯CIK细胞为35.2%,两者比较有显著性差异p<0.01;而对K562和SGC-7901细胞杀伤活性二者间无明显差异。结论肿瘤周围转移引流淋巴结贴壁细胞在体外能定向诱导扩增出大量DC;胃癌抗原负载的DC和CIK细胞共同培养,可明显提高CIK细胞对自身肿瘤细胞的杀伤活性。     

利用CRISPR/Cas9技术构建人TCRP1基因敲除慢性髓系白血病K562细胞系及其生物学功能检测

目的选取人慢性髓系白血病(CML)细胞K562为实验对象, 利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术构建稳定敲除舌癌耐药相关蛋白1(TCRP1)基因的CML细胞系K562/TCRP1-KO, 通过细胞增殖、细胞凋亡、药物敏感性等功能试验比较K562/TCRP1-KO与对照细胞(K562/cas9-CTL)的表型差异, 初步探讨TCRP1基因参与CML发病的可能机制。方法在特定位点设计针对TCRP1的小向导RNA(sgRNA), 寡核苷酸片段退火后与线性化的Cas9表达载体重组, 慢病毒包装系统转染293T细胞, 收集纯化病毒感染K562细胞, 嘌呤霉素加压筛选阳性多克隆, 有限稀释法进一步筛选出单克隆K562/TCRP1-KO, Sanger测序和Western blot检测成功敲除的稳定细胞株, 同时构建转染lentiCRISPR载体的K562细胞作为对照细胞株(K562/cas9-CTL), 采用细胞计数法、CCK8法及伊马替尼(IM)梯度稀释法、流式细胞术分别对K562/TCRP1-KO和K562/cas9-CTL进行细胞增殖、药物敏感性及细胞凋亡分析。结果成功构建了用...     

急性淋巴细胞白血病患儿骨髓间充质干细胞对K562细胞株药物耐受性的影响

目的 研究急性淋巴细胞白血病患儿骨髓间充质干细胞（MSCs）对K562细胞药物耐受性的影响,并初步探讨其机制.方法 从白血病患儿骨髓中分离、培养并鉴定MSCs;建立K562细胞株与MSCs共培养的体系,观察MSCs对K562细胞生长的影响;AnnexinV-FITC检测一定浓度的阿霉素（ADM）对K562细胞凋亡的影响;流式细胞仪测定不同培养条件下的K562细胞周期;RT-PCR检测K562细胞的Bcl-2和Bax基因.结果 和单独培养的K562细胞相比,与MSCs黏附共培养的K562细胞生长较为缓慢,未见明显的对数生长期.单独培养组细胞早期凋亡率为（9.19±0.53）%,而黏附培养组为（4.00±0.37）%,差异具有统计学意义（P＜0.05）.黏附共培养组K562细胞,G0-G1期细胞比例为（80.95±3.83）%,显著高于单独培养组（50.2±2.26）%（P＜0.05）;而S期细胞比例为（17.40±1.50）%,显著低于单独培养组（37.03±3.50）%（P＜0.05）.相对于单独悬浮培养的K562细胞,黏附共培养的K562细胞Bcl-2基因相对表达明显增强,Bcl-2/Bax显著增高.结论 白血病患儿MSCs能抑制白血病细胞株K562生长,改变细胞周期而逃避药物的促凋亡作用,K562对阿霉素产生耐药性可能与黏附共培养后Bcl-2基因表达增强有关.     

结肠癌HT29细胞干细胞诱导的树突状细胞-细胞因子诱导的杀伤细胞对结肠癌干细胞的体外杀伤实验研究

目的研究结肠癌干细胞(CSC)经RNA转染或全细胞裂解诱导树突状(DC)细胞,与细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)共培养,对结肠癌HT29细胞及其CSC的杀伤作用,为结肠癌的治疗提供依据。方法提取健康人单个核细胞,培养DC和CIK细胞,用结肠癌HT29细胞干细胞的RNA转染或全细胞裂解诱导DC细胞,然后与CIK细胞共培养,形成CSC-RNA-DC-CIK、CSC-裂解物-DC-CIK以及HT29细胞RNA-DC-CIK、HT29细胞裂解物-DC-CIK,用LHD法检测其对HT29细胞及其干细胞的杀伤效果。用SPSS 18.0统计软件进行方差分析。结果 CSC-RNA-DC-CIK组、CSC-裂解物-DC-CIK组、HT29-RNA-DC-CIK组和HT29-裂解物-DC-CIK组的CIK免疫表型(CD3、CD8、CD56)和DC免疫表型(CD40、CD80、CD86、HLA-DR)成熟表达率均明显高于CIK组和DC-CIK组,差异均有统计学意义(P0.05)。但CSCRNA-DC-CIK组、CSC-裂解物-DC-CIK组、HT29-RNA-DC-CIK组和HT29-裂解物-DC-CIK组之间,差异无统计学意义(P0.05)。随着效靶比的增加,CIK、DC-CIK、CSC-RNA-DC-CIK、CSC-裂解物-DC-CIK、HT29-RNA-DC-CIK和HT29-裂解物-DC-CIK作为效应细胞对HT29细胞及其干细胞的杀伤作用也逐渐增强,各效靶比中,CSC-RNA-DC-CIK组、CSC-裂解物-DC-CIK组、HT29-RNA-DC-CIK组和HT29-裂解物-DC-CIK组的杀伤率高于CIK组和DC-CIK组,差异均有统计学意义(P0.05);DC-CIK组高于CIK组,差异有统计学意义(P0.05);但CSC-RNA-DC-CIK组、CSC-裂解物-DCCIK组、HT29-RNA-DC-CIK组和HT29-裂解物-DC-CIK组之间,差异无统计学意义(P0.05)。结论利用CSC经RNA转染或全细胞裂解诱导DC细胞,与CIK细胞共培养,强于常规DC-CIK细胞对结肠癌HT29细胞及其CSC的杀伤作用,为今后的肿瘤患者提供了新免疫治疗的方法。     

负载肺癌A549抗原的树突状细胞对细胞因子诱导的杀伤细胞特异性激活研究

目的 观察负载肺癌A549抗原的树突状细胞(DC)对细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)特异性肿瘤杀伤活性的作用.方法 由正常人富含淋巴细胞白膜分离、细胞因子诱导制备DC细胞和CIK细胞.用流式细胞术分析DC细胞和CIK细胞的表型.经混合淋巴反应和体外细胞毒性实验观察负载A549抗原的DC对CIK具有特异性激活作用.结果 表型分析显示,CIK细胞以CD3 CD56 自然杀伤细胞为主,成熟DC细胞高表达CD40、CD80、CD86和HLA-DR,并可刺激CIK细胞的增殖诱导混合淋巴反应,而负载A549抗原的DC细胞能显著增强CIK细胞特异性杀伤靶细胞的能力(P＜0.05).小鼠注射CIK、DCCIK和Ag·DC·CIK后的肿瘤直径分别为(65.34±12.33)、(70.17±13.26)和(36.79±9.19)mm,后者的抗肿瘤作用较高(P＜0.05).结论 抗原负载的DC细胞可活化CIK细胞,并使其具有特异性杀伤肿瘤细胞的能力.     

硒化壳聚糖逆转K562/ADM细胞耐药与PI-3K/Akt信号通路的关系

目的研究硒化壳聚糖对体外培养多药耐药白血病细胞株K562/ADM的耐药逆转作用,探讨其与PI-3K/Akt信号通路的关系。方法 K562/ADM细胞培养于含0.6μg/ml阿霉素的培养液中维持其耐药性,应用MTT法检测硒化壳聚糖对K562/ADM细胞增殖的作用,计算逆转倍数;应用流式细胞法检测细胞凋亡;应用免疫印迹法检测磷酸化Akt(p-Akt)和P糖蛋白(P-gp)表达的改变。结果 K562/ADM细胞对阿霉素(ADM)耐药,硒化壳聚糖可有效抑制K562/ADM细胞增殖,呈一定的剂量和时间效应关系(P0.05,P0.01);硒化壳聚糖能够对K562/ADM细胞耐ADM产生一定的逆转作用,明显增强ADM对K562/ADM细胞的诱导凋亡作用(P0.05,P0.01),下调p-Akt和P-gp水平(P0.01)。结论硒化壳聚糖对耐药白血病细胞株K562/ADM可产生增殖抑制和多药耐药逆转作用,其部分逆转机制可能是通过诱导细胞凋亡,抑制细胞P-gp表达,阻断细胞PI-3K/Akt信号通路而实现。     

宫颈癌细胞冻融抗原负载树突状细胞激发细胞毒性T淋巴细胞杀伤宫颈癌细胞的体外研究

目的研究HeLa、SiHa两种宫颈癌细胞株冻融抗原负载的树突状细胞(dendritic cells,DC)诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)体外抗原特异性杀伤官颈癌细胞的能力.方法利用免疫磁珠分离法(MACS)分离纯化脐血CD34 细胞并在体外诱导分化为DC,用反复冻融法分别从两种宫颈癌细胞株(HeLa利SiHa)中提取可溶性冻融抗原并负载DC.流式细胞学检测负载两种抗原后DC表面分子的表达,ELISA法检测DC上清中IL-12的表达,MLR测定DC刺激T细胞增殖的能力,MTT法检测DC经抗原负载后激活的CTL分别对HeLa和SiHa细胞的杀伤作用.结果与未经抗原负载的DC相比,经HeLa和SiHa冻融抗原负载的DC能更好的表达各种DC分化相关抗原(CD1a、CD83、CD80、HLA-DR以及CD54),刺激T淋巴细胞增殖和IL-12分泌的能力也显著加强(P＜0.05).与未经抗原负载相比,两种宫颈癌细胞冻融抗原负载DC后激发的CTL在体外对官颈癌细胞的杀伤能力也明显加强.此外,HeLa细胞抗原负载DC诱导的CTL在体外对HeLa细胞的杀伤率为72.2%,显著高于它对SiHa细胞的杀伤率(22.3%);而SiHa细胞抗原负载DC诱导的CTL对SiHa细胞的杀伤率为69.5%,也明显高于它对HeLa细胞的杀伤率(28.1%),具有显著的抗原特异性.结论经宫颈癌细胞冻融抗原负载DC激活的CTL在体外具有更强的增殖能力,并具有抗原特异性杀伤宫颈癌细胞的作用.     

慢性乙型肝炎患者CIK细胞生物学特性的研究

目的探讨慢性乙型肝炎外周血CIK细胞的生物学特性,寻求治疗乙型肝炎的一种新方法。方法提取20例慢性乙型肝炎患者和20例健康人外周血单个细胞与IFN-γ、IL-1β、抗CD3mAb和IL-2共同培养诱导CIK细胞,用流式细胞仪检测细胞表型特征和细胞增殖倍数,用LDH酶释放法检测细胞的杀伤活性;同时设立CIK和CD3AK细胞在增殖和杀伤活性作比较。结果慢性乙型肝炎患者CIK细胞的增殖及杀伤活性均低于正常对照组(P<0·01),但较培养前明显增高,于培养后12~24d达高峰。CIK细胞与CD3AK细胞在增殖倍数上无明显差异(P>0·05),但杀伤活性前者比后者有显著提高(P<0·01)。结论慢性乙型肝炎患者CIK细胞的增殖倍数、杀伤活性均低于正常人,但明显高于培养前。诱导12~24d后CIK细胞增殖及杀伤活性均达到高峰,此时期的CIK细胞适合临床应用;CIK细胞其体外杀瘤活性明显优于CD3AK细胞,CIK可作为继CD3AK细胞之后过继免疫治疗乙型肝炎的一种新方法。     

褐藻糖胶对人白血病细胞株K562凋亡的影响

目的探讨海带提取物褐藻糖胶对体外培养的人髓系白血病细胞株K562生长的影响．从细胞凋亡角度研究其抗肿瘤机制。方法采用肿瘤细胞体外培养、单细胞凝胶电泳、凋亡细胞DNA琼脂糖凝胶电泳和流式细胞技术．观察不同剂量褐藻糖胶对体外培养的白血病细胞株K562细胞的影响。结果噻唑蓝（MTT）实验结果显示，褐藻糖胶对K562细胞均具有较强的杀伤作用，尤其以1g／L剂量组为明显。单细胞凝胶电泳实验结果表明，褐藻糖胶对肿瘤细胞DNA有明显损伤作用．尤其以1g／L剂量组的影响最为明显。DNA琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪检测结果显示．经褐藻糖胶处理后，肿瘤细胞洲亡率上升，其中1g／L剂量组较为明显。提示褐藻糖胶可能通过诱导肿瘤细胞凋亡而发挥抗肿瘤作用。结论褐藻糖胶可通过诱导肿瘤细胞凋亡，从而达到抗肿瘤的目的。     

酒精对体外培养人红白血病细胞活性影响的研究

目的 了解长期饮酒对人体组织细胞损伤的可能原因。方法 采用不同浓度酒精加入体外培养的人红白血病(K562)细胞中,用荧光显微镜和倒置光显微镜观察细胞形态学变化,用琼脂糖凝胶电泳的方法检测细胞DNA裂解。结果 1％酒精能有效诱导K562细胞凋亡,且随剂量增大凋亡时间缩短。5％酒精作用30h则可引起细胞坏死。结论 长期饮酒者血液中有核细胞数量减少,可能与其促凋亡作用有关。     

Germ cells and pluripotent stem cells in the mouse

For many years, attempts to achieve long-term culture of mouse primordial germ cells (PGCs) proved unsuccessful, even when feeder layers were used and individual growth factors were added to the medium. However, when three growth factors were added simultaneously to the medium, some of the cells continued to proliferate indefinitely. Similar to embryonic stem cell lines, these embryonic germ (EG) cell lines were capable of giving rise to embryoid bodies in vitro, and colonizing all cell lineages in chimeras, including the germline. Initially, EG cells were made from PGCs before migration, 8.5 days post coitum (dpc), and after entry into the genital ridge, 11.5 and 12.5 dpc. New EG cell lines from 9.5 dpc (migrating) and 11.5 dpc PGCs, carrying either a LacZ or GFP transgene, are described here. The developmental potential of the new EG cell lines in vitro, in vivo in chimeras, and in tissue aggregates in organ culture was studied. The EG cells were compared with PGCs at the stage from which the EG cells were derived. The two cell types show several similarities, but also some differences in gene expression and cell behaviour, which require further exploration.     

Comparison of neurosphere cells with cumulus cells after fusion with embryonic stem cells: reprogramming potential

Embryonic stem cells (ESCs) are the pluripotent cells that also have the capacity to induce the genomic reprogramming of differentiated somatic cells. The progressively restricted genomic potential of somatic cells observed during embryonic development can be reverted to a pluripotent state by the formation of cell hybrids with ESCs. To assess the reprogramming potential of ESCs, we investigated the reprogramming of one of two different somatic cell populations, neurosphere cells (NSCs) and cumulus cells (CCs), after fusion with ESCs. Specifically, hybrid cells were produced by cell fusion of E14 ESCs with either NSCs or CCs containing the neo/lacZ and Oct4-GFP transgenes. The first reprogramming event, observed by the presence of Oct4-GFP in the hybrid cells, could be identified on Day 2, at approximately 45 h after fusion in both ESC-NSC and ESC-CC hybrids. In addition, the two ESC-somatic cell hybrids exhibit a similar reprogramming rate and share characteristics with the E14 ESC line: (1) expression of pluripotent markers (Oct4, Rex-1 and nanog); (2) inactivation of differentiated tissue-specific gene expression; and (3) the capacity to differentiate into all three germ layers. Taken together, our results suggest that the ESC-somatic cell hybrids have fully acquired ESC characteristics and that somatic cells of different tissue origin have the same potential to be reprogrammed after fusion with ESCs.     

用彗星试验区别凋亡细胞与普通DNA链断裂损伤细胞

应用彗星试验对地塞米松诱导的小鼠胸腺凋亡细胞与重铬酸钾诱导的普通DNA链断裂损伤细胞进行了比较研究。结果发现 :在彗星形态上 ,凋亡细胞具有明显的特征 ;在相同电泳条件下 ,凋亡细胞的彗星出现时间早 ;在剂量 反应关系上 ,凋亡细胞表现为凋亡指数增加 ,而DNA链断裂损伤细胞为彗星尾长增加 ;在修复的时效关系上 ,凋亡继续发展 ,普通DNA链断裂损伤有明显修复。研究表明 ,彗星试验不仅能敏感地检测DNA链断裂 ,而且可以了解DNA链断裂损伤的性质 ,对于研究肿瘤的发生、发展和转归具有重要意义。     

Adult stem cells

One of the fields of medicine that has created the greatest expectations in recent years is cellular therapy with stem cells. The isolation of human embryo cells, the apparent and unexpected potential of adult stem cells, and the development of gene therapy lead us to imagine a hopeful future for a significant number of diseases that are at present incurable. In the following pages we offer a sketch of the panorama of research with stem cells, describing the main achievements in this field as well as some of the questions awaiting answers. In spite of the great expectations, it is essential that we maintain a critical and realistic spirit when it comes to analysing the scientific advances in this area.     

树突状细胞激活效应细胞作用的初步研究

目的探讨树突状细胞（DC）对肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）和小鼠脾淋巴细胞（小鼠脾LC）的最佳激活作用比例.方法联合应用GM-CSF、IL-4和小鼠H22肝癌细胞全细胞性抗原致敏从荷瘤小鼠四肢长骨提取的DC,依据不同的激活比例用致敏DC体外激活TIL和小鼠脾LC,采用乳酸脱氢酶（LDH）4小时释放法测定、观察被不同程度激活的TIL和小鼠脾LC对小鼠H22肝癌细胞的杀伤活性.结果当E/T为1：400和1：200时,所激活的TIL或小鼠脾LC的杀伤活性较弱,线性关系不明显,P＞0.05;当E/T为1：100时,杀伤活性有较明显的提高,与前两者比较,P＜0.05;当E/T=1：50时,杀伤活性徒增,与前三者比较均有显著性差异;而当E/T=1：25,1：12.5和1：6.25时,杀伤活性与E/T=1：50时基本没变化,P＞0.05.结论当E/T=1：50时,DC能使小鼠脾LC和TIL充分激活,显著提高其对小鼠H22肝癌细胞的体外杀伤活性.     

肝实质细胞和肝非实质细胞及非肝细胞的共培养

生物人工肝有望成为肝衰竭患者有效的体外肝支持治疗手段,而建立生物人工肝的前提是要获得足够数量高活性和良好功能的肝细胞.大量研究发现,肝细胞共培养能明显增强肝细胞功能,保持肝细胞的表型.此文就近年来肝细胞和非实质细胞、非肝细胞共培养的效果、方法和可能的机制作了综述.     

Cancer stem cells

There are two hypotheses that explain tumor progression. The first one, the stochastic hypothesis, assumes that any cell within a tumor has the capacity to form and maintain the tumor mass. The second, the so-called hierarchical hypothesis, suggests the existence of a group of cells with a stem phenotype which, like in normal tissues, preserves tumors through a continuous production of progeny. These stem cells are in a particular niche, have a higher resistance to chemotherapy and radiotherapy, and are also capable of invading and migrating to other tissues. This review describes the cancer stem cells (CSCs), their function inside a tumor and the current knowledge about these cells.     

人子宫内膜细胞原代培养与间质细胞MTS比较

目的探究原代人子宫在位内膜细胞分离及培养的简易方法,比较分离培养单一间质细胞和混合培养间质细胞之间的差异。方法采用单纯胰蛋白酶,分段消化人子宫内膜组织,经过两次筛网过滤、离心纯化技术,分离、纯化人子宫内膜间质细胞(ESC)和腺上皮细胞(EEC),采用免疫荧光方法对细胞进行鉴定,采用Cell Titer96~ Aqueous One Solution Reagent(MTS)方法监测细胞之间增长速度。结果间质细胞多呈梭形或多角形,纯度可达97%以上。腺上皮细胞多似蝌蚪形或多角形,纯度可达93%以上。混合培养细胞比单一培养细胞增殖能力强。结论采用单纯胰蛋白酶分段消化法和二次筛网过滤法可成功分离子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞,具有获得细胞成活率高、生长稳定的优点,混合培养间质细胞,保留细胞间整体性,可为进一步研究子宫内膜细胞提供一定的实验基础。