衣原体感染

肺炎衣原体感染与冠心病关系探讨；沙眼衣原体与生殖道感染免疫损伤机制的研；究进展；鹦鹉热衣原体HSP60基因克隆及其表达产物；抗原性的实验研究；     

奶牛流产鹦鹉热衣原体ompA基因的克隆与原核表达

目的表达奶牛源鹦鹉热衣原体ompA基因,探索其作为诊断抗原的可能性。方法采用套式PCR方法扩增出了奶牛源鹦鹉热衣原体ompA基因完整片段,此扩增产物经过双酶切后克隆到表达载体pGEX-4T-1中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后采用SDS-PAGE和Western-blot检测重组目的蛋白的表达结果。结果重组蛋白经奶牛衣原体阳性血清鉴定正确。结论ompA基因在原核表达系统中得到正确表达。     

恶性疟原虫网状细胞结合蛋白同源体5F1段的克隆、表达及初步鉴定

目的克隆表达恶性疟原虫网状细胞结合蛋白同源体5(PfRh5)F1片段,并评价其抗原性。方法 PCR扩增目的基因片段,克隆到表达载体pET28a(+)中,构建PfRh5F1/pET28a原核表达载体。IPTG诱导表达目的基因,SDS-PAGE电泳分析表达产物,并用WesternBlot检测其抗原性。结果成功构建了PfRh5F1/pET28a原核表达系统,并在大肠杆菌中以包涵体形式高效表达,表达产物能被恶性疟原虫感染患者血清识别,而不能被间日疟原虫感染患者及正常人血清识别。结论恶性疟原虫PfRh5F1段在大肠杆菌中获得高效表达且表达产物具有良好的抗原性。     

肺炎支原体热休克蛋白HSP70的表达、纯化及其免疫原性分析北大核心CSCD

目的构建肺炎支原体(MP)热休克蛋白HSP70重组原核表达质粒,纯化并鉴定其免疫原性。方法以肺炎支原体ATCC 29342为模板,利用搭桥PCR扩增HSP70全序列,胶回收纯化后测序验证。使用BamH1和Xho1双酶切PCR产物,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-HSP70,转入大肠埃希菌BL21中,经IPTG诱导目的蛋白表达,对表达产物进行12.5%SDS-PAGE和质谱鉴定。利用AKTA explore 100蛋白纯化仪纯化重组HSP70,以此为抗原与MP感染者血清进行Western blot,检测其免疫反应性。结果搭桥PCR成功完成HSP70基因A1728G突变,重组质粒pGEX-4T-1-HSP70构建正确,转化BL21后经IPTG诱导表达分子质量单位92 ku含GST标签的重组HSP70,纯化蛋白经Western blot检测能与感染Ⅰ型和Ⅱ型MP菌株患儿血清发生特异性反应。结论获得重组HSP70完整蛋白,纯化产物具有免疫反应性,为制备高效防治肺炎支原体感染的基因工程疫苗及研究HSP70蛋白的免疫学功能奠定了基础。     

中华按蚊热激蛋白40(HSP40)cDNA序列的全长扩增

目的 为获取中华按蚊感染约氏疟原虫后24 h的高表达基因热激蛋白40(HSP40)cDNA的全长序列. 方法 运用抑制性消减杂交技术(suppression substractive hybridization,SSH)构建中华按蚊感染约氏疟原虫后24 h的差异表达基因文库,从高表达文库中获得长度为363 bp的HSP40基因的cDNA片段,运用RACE技术对其cDNA序列进行全长扩增. 结果 获得中华按蚊HSP40 cDNA的全长序列,总长度为1 159 bp,开放阅读框为1 014 bp,编码337个氨基酸. 结论 获得了中华按蚊HSP40 cDNA的全长序列.     

中华按蚊热激蛋白40(HSP40)cDNA序列的全长扩增

目的 为获取中华按蚊感染约氏疟原虫后24 h的高表达基因热激蛋白40(HSP40)cDNA的全长序列. 方法 运用抑制性消减杂交技术(suppression substractive hybridization,SSH)构建中华按蚊感染约氏疟原虫后24 h的差异表达基因文库,从高表达文库中获得长度为363 bp的HSP40基因的cDNA片段,运用RACE技术对其cDNA序列进行全长扩增. 结果 获得中华按蚊HSP40 cDNA的全长序列,总长度为1 159 bp,开放阅读框为1 014 bp,编码337个氨基酸. 结论 获得了中华按蚊HSP40 cDNA的全长序列.     

中华按蚊热激蛋白40(HSP40)cDNA序列的全长扩增

目的 为获取中华按蚊感染约氏疟原虫后24 h的高表达基因热激蛋白40(HSP40)cDNA的全长序列. 方法 运用抑制性消减杂交技术(suppression substractive hybridization,SSH)构建中华按蚊感染约氏疟原虫后24 h的差异表达基因文库,从高表达文库中获得长度为363 bp的HSP40基因的cDNA片段,运用RACE技术对其cDNA序列进行全长扩增. 结果 获得中华按蚊HSP40 cDNA的全长序列,总长度为1 159 bp,开放阅读框为1 014 bp,编码337个氨基酸. 结论 获得了中华按蚊HSP40 cDNA的全长序列.     

流行性乙型脑炎病毒SA14-14-2株E蛋白基因在原核细胞中的高效表达及其表达产物的抗原性分析

目的　获得JEVE蛋白基因并使其在E coli中高效表达 ,以研究其抗原活性 ,为进一步研制ELISA早期诊断试剂盒奠定基础。方法　根据已发表的JEVSA - 14 - 14 - 2减毒株序列 ,设计一对特异性引物 ,通过RT -PCR扩增出E蛋白基因的cDNA片段 ,并将其克隆入 pET - 32a(+)表达载体中 ,构建重组融合表达载体pET -E ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3)后 ,利用IPTG诱导获得高效表达。结果　扩增的E蛋白基因片段长 1113bp ,编码 371个氨基酸残基 ,该基因片段与国内发表的减毒株SA14 - 14 - 2碱基序列同源性为 10 0 %。表达产物分子量约为 6 2kD ,经Westernblotting分析表明表达产物具有较好的抗原性。结论　通过序列分析表明 ,我国的JEVSA - 14 - 14 - 2减毒株未发生基因突变。表达产物的稳定高效表达及其抗原特异性分析为今后ELISA早期诊断试剂盒的研制提供了依据。     

肠出血性大肠杆菌O157∶H7 TccP基因克隆、表达及其抗原性鉴定

目的克隆表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7 Tir细胞骨架偶联蛋白(TccP)基因,并研究其抗原性。方法采用PCR法自EHEC O157∶H7 Sakai菌株基因组扩增TccP基因,构建TccP原核表达载体并在大肠杆菌中诱导表达。表达产物经初步纯化后,免疫新西兰白兔,制备兔抗TccP多克隆抗体。抗体效价及特异性用ELISA法和Western blotting法进行测定和分析。结果从EHEC O157∶H7 Sakai菌株中克隆出了1014bp的TccP基因。构建的重组质粒pET28a-TccP在大肠杆菌中获得了高效表达;以TccP免疫家兔获得了高效价多克隆抗体,Western blotting分析此抗体能与TccP发生特异性抗原抗体反应。结论在大肠杆菌中成功克隆表达了TccP基因,所获TccP具有良好的抗原性,为进一步研究TccP在EHEC O157∶H7致病机制中的作用奠定基础。     

肺炎衣原体Cpn0147基因的克隆、表达与定位及其重组蛋白的生物信息学分析

目的重组表达肺炎衣原体Cpn0147基因,并对表达的内源性蛋白进行细胞内定位,对重组蛋白进行生物信息学分析。方法使用PCR方法从肺炎衣原体菌株AR39基因组中扩增第0147段开放读码区基因,使用限制性内切酶BamHⅠ和NotⅠ酶切目的片段和载体PGEX-6P2,T4连接酶连接后转化入大肠埃希菌感受态XL-Blue,并诱导表达融合蛋白GST-Cpn0147。用融合蛋白免疫小鼠,制备抗体,应用IFA方法对衣原体感染细胞内Cpn0147基因表达的内源性蛋白进行定位。利用软件Expasy对重组蛋白进行生物信息学分析。结果克隆出肺炎衣原体基因Cpn0147,全长450 bp,编码蛋白分子质量单位为14.727 ku,表达的融合蛋白GST-Cpn0147分子质量单位约为43 ku;用制备的抗体做IFA,显示现该蛋白定位于肺炎衣原体包涵体膜上。生物信息学分析该蛋白含2个抗原决定簇,具有良好的抗原性和亲水性。结论肺炎衣原体Cpn0147基因编码蛋白为一包涵体膜蛋白,抗原性和亲水性较好。     

肝片吸虫谷胱甘肽S-转移酶基因的克隆表达及活性分析

目的克隆和表达肝片吸虫谷胱甘肽S-转移酶基因(FhGST)以研究重组蛋白免疫学特性。方法参考Gen-Bank上发表的FhGST基因序列设计一对特异性引物,利用RT-PCR法扩增FhGST基因,将扩增产物克隆入pET-30a(+),构建重组表达载体。经PCR、双酶切和序列测定鉴定后转入E.coliBL21(DE3)宿主菌,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting对该重组蛋白进行分析和鉴定。结果成功获得肝片吸虫GST基因全长为657bp的编码序列,SDS-PAGE结果表明重组蛋白分子量为31.3kDa,以包涵体形式表达。Western blotting结果证实重组蛋白能被其免疫的SD大鼠血清识别,表明其具有免疫原性;并且能与感染肝片吸虫的绒山羊血清发生反应,表明重组蛋白具有免疫反应性。结论成功的克隆了肝片吸虫谷胱甘肽S-转移酶基因,实现了在原核表达系统中高效表达重组蛋白,并具有良好的免疫学活性。     

猪肺炎支原体168株黏附因子基因的克隆与表达

目的表达猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae)168株黏附因子(P97),探索其作为诊断抗原的可能性。方法采用PCR方法,从猪肺炎支原体168株基因组DNA中扩增到黏附因子(P97)基因的抗原决定簇序列(R1区),产物经双酶切后克隆到表达载体pET-32a(+)中,具有正确阅读框架的重组表达质粒pET-32a(+)-P97(R1)转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后采用SDS-PAGE和Western-blotting检测重组质粒目的基因表达。结果(1)获得Mhp168株黏附因子基因R1区长约270bp的DNA片段,测序证明重组质粒pET-32a(+)-P97(R1)的外源基因序列与已报告的Mhp232及J株黏附因子基因序列基本一致;(2)SDS-PAGE检测表达产物,在相对分子量26.5kDa处有阳性表达条带,融合蛋白约占细菌蛋白总量的23.3%,主要以可溶性蛋白形式存在;(3)免疫印迹显示,该蛋白条带与兔抗猪肺炎支原体高免血清有阳性反应。结论Mhp168株黏附因子基因在大肠杆菌中获得了高效表达,重组蛋白具有免疫反应性。     

肺炎支原体ORF6区基因的克隆与表达

目的表达肺炎支原体ORF6区基因,探索其作为诊断抗原的可能性。方法采用PCR方法,从肺炎支原体FH株基因组中扩增ORF6区基因,用TA克隆的方法克隆该片断,并以该重组质粒为模板,扩增ORF6区基因,此扩增产物经过双酶切后克隆到表达载体pET-32a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后采用SDS-PAGE和Western-blotting检测重组质粒目的蛋白的表达结果。结果获得肺炎支原体ORF6区基因长为1003bp的DNA片段,SDS-PAGE检测表达产物,在相对分子量56.8kDa处有阳性表达条带。免疫印迹显示,该蛋白带能与肺炎支原体阳性血清反应。结论ORF6区基因在大肠杆菌中获得高效表达,重组蛋白具有免疫反应性。     

华支睾吸虫组织蛋白酶D样天冬氨酸蛋白酶基因的克隆表达和重组蛋白的免疫学分析

目的对新发现的华支睾吸虫(Clonorchis sinensis)的组织蛋白酶D样天冬氨酸蛋白酶基因进行克隆、表达和免疫学初步研究。方法将华支睾吸虫组织蛋白酶D样天冬氨酸蛋白酶基因(去除了信号肽编码序列)克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,在大肠杆菌BL-21/DE3中用IPTG诱导表达,表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,纯化的重组蛋白免疫SD大鼠制备抗血清。用蛋白印迹(Western blotting)进行免疫学分析。结果PCR、双酶切及DNA测序结果均表明pET-28a(+)-组织蛋白酶D样天冬氨酸蛋白酶重组质粒构建成功。SDS-PAGE结果表明目的基因在大肠杆菌BL-21/DE3中获得高效表达,经亲和层析获得了高纯度蛋白。重组蛋白可被其免疫的SD大鼠血清识别,表明其具有免疫原性;并且能识别感染了华支睾吸虫的SD大鼠血清,表明具有免疫反应性。结论华支睾吸虫组织蛋白酶D样天冬氨酸蛋白酶基因可在原核表达系统中获得具有免疫原性的高效表达,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。     

产单核细胞李斯特菌plcB基因的克隆与原核表达

目的克隆并原核表达产单核细胞李斯特菌plcB基因。方法利用PCR技术从产单核细胞李斯特菌基因组中扩增不含编码信号肽的plcB基因。采用T-A克隆构建pGEM-T-plcB重组质粒,BamHI、XhoI双酶切pGEM-T-plcB获得plcB片段后再插入pGEX-6p-1原核表达载体,获得pGEX-6p-1-plcB重组表达质粒并在表达宿主菌BL21中诱导表达。对表达产物进行纯化和SDS-PAGE、Western-blotting、磷脂酶活性实验分析。结果克隆的plcB基因长834bp,与GenBank上公布的序列完全相同;表达的与GST标签蛋白融合的广谱磷脂酶C蛋白(GST-PC-PLC)具有磷脂酶生物活性和免疫原性。结论成功构建产单核细胞李斯特菌plcB基因的原核表达质粒,并在大肠杆菌中得到有效表达,这为进一步研究PC-PLC蛋白的致病与免疫机理奠定了基础。     

恙虫病东方体47kDa蛋白基因部分片段的克隆与表达

目的　表达恙虫病东方体 (Orientiatsutsugamushi,Ot) 4 7kDa保护性抗原蛋白。 方法　采用PCR方法 ,从OtKarp株基因组DNA中扩增出 4 7kDa蛋白基因片段 ,鉴定后将该片段克隆于原核表达载体 pBV2 2 0 ,构建成重组质粒pBV -4 7。用该重组质粒转化E coli,转化子在 4 2℃诱导表达并对其鉴定。结果　 (1)获得长约 14 30bp的PCR片段 ,序列分析结果与已知 4 7kDa基因序列相同 ;(2 )SDS -PAGE检测表达产物 ,在相对分子量 4 0× 10 3 处有表达带 ;(3)经薄层扫描分析 ,目的蛋白占全菌蛋白的 19% ;(4)免疫印迹实验证明其具有免疫反应性。结论　获得了 4 7kDa基因片段 ,并在大肠杆菌中实现了表达 ,表达产物具有免疫反应性。     

马链球菌兽疫亚种中国株的类M蛋白基因抗原表位片段的克隆与表达

目的　构建马链球菌兽疫亚种 (Streptococcusequisubsp zooepidemicus)中国株的类M蛋白基因抗原表位片段的重组表达质粒 (pET -Szp) ,并检测表达产物的免疫反应性。 方法　根据GenBank登录的马链球菌兽疫亚种纽约分离株w6 0类M蛋白基因序列设计和合成引物 ,以该菌中国分离株ATCC35 2 4 6的基因组DNA为模板 ,扩增类M蛋白基因 5’端第 5 83～ 10 6 8bp片段 ,并按正确的阅读框架定向克隆到表达载体pET - 32a(+)中 ,将重组质粒转化大肠杆菌BL2 1株 ,用IPTG诱导表达 ,并通过SDS -PAGE和免疫印迹对表达蛋白进行初步分析。结果　扩增出 4 86bp的马链球菌兽疫亚种ATCC35 2 4 6的类M蛋白基因片段 ,该基因在大肠杆菌表达系统中经诱导 ,得到分子量为 5 0 0 0 0的表达产物 ,免疫印迹表明该产物具有特异的免疫反应性。结论　成功构建了表达马链球菌兽疫亚种中国株类M蛋白片段的重组表达质粒 ,并实现在大肠杆菌中表达 ,为重组类M蛋白亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

亚洲牛带绦虫磷脂酰肌醇转移蛋白α基因的克隆表达和免疫学分析

目的原核克隆表达亚洲牛带绦虫成虫磷脂酰肌醇转移蛋白α基因(Ta PITPα),探索其应用前景。方法将亚洲牛带绦虫成虫PITPα克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,在大肠埃希菌BL-21/DE3中用IPTG诱导表达,表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,纯化的重组蛋白用蛋白印迹(Western Blotting)进行免疫学分析。结果PCR、双酶切及DNA测序结果均表明pET-28a(+)-Ta PITPα重组质粒构建成功。SDS-PAGE结果表明目的基因在大肠埃希菌BL-21/DE3中获得高效表达,经亲和层析获得了高纯度蛋白。重组蛋白可被其免疫的SD大鼠血清和感染了亚洲牛带绦虫的猪血清识别,表明其具有免疫活性。结论亚洲牛带绦虫成虫磷脂酰肌醇转移蛋白α基因可在大肠埃希菌BL-21/DE3中获得具有免疫活性的高效表达,为进一步的功能研究奠定了基础。     

Ⅰ型登革病毒ns1基因克隆及其表达产物的免疫原性研究

目的克隆并表达Ⅰ型登革病毒非结构蛋白1(NS1)基因,初步鉴定其免疫原性。方法登革热Ⅰ型病毒标准株感染C6/36细胞后,抽提病毒RNA,经RT-PCR方法扩增出NS1全长基因片段,经T-A克隆后,在QIA表达系统中表达,表达产物用Ni柱亲和层析纯化后,用兔抗Ⅰ型登革病毒免疫血清及登革热患者血清对重组蛋白进行Western Blot及ELISA鉴定。结果构建的重组质粒pQE-30/DV1NS1经IPTG诱导,重组蛋白NS1高效表达并纯化成功,经Western Blot及ELISA证实重组蛋白NS1可以被免疫血清和病人血清特异识别。结论Ⅰ型登革病毒非结构蛋白NS1表达载体在大肠杆菌M15中高效表达。纯化产物具有较强的免疫原性,为进一步研究NS1的生物学特性和血清学检测奠定了基础。     

华支睾吸虫F0-ATP合酶b亚基基因的克隆表达和重组蛋白的免疫原性分析

目的 对华支睾吸虫F₀-ATP合酶b亚基（CsF₀-ATP-synt_B）基因进行克隆、表达及重组蛋白的免疫原性分析。 方法 以华支睾吸虫成虫cDNA文库中含有F₀-ATP合酶b亚基基因的质粒为模板，扩增该基因（去除线粒体靶向序列的成熟肽基因），将其克隆到原核表达质粒pET-28a（+）中，转化大肠埃希菌BL21（DE3），异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达，经亲和层析获得的纯化表达产物免疫SD大鼠，制备抗血清。蛋白质印迹（Western blotting）分析重组蛋白的免疫原性。 结果 华支睾吸虫F₀-ATP合酶b亚基成熟肽基因的编码区含813个碱基，编码271个氨基酸，相对分子质量（Mr）为31 171.9。经亲和层析获得的重组蛋白可被其免疫的大鼠血清识别。 结论 华支睾吸虫F₀-ATP合酶b亚基基因可在原核表达系统中获得具有免疫原性的高效表达。