六味地黄丸入血成分增效自杀基因杀伤肝癌细胞的缝隙连接机制

【目的】探讨六味地黄丸主要入血成分处理的淋巴上清对大鼠肝癌细胞CBRH7919缝隙连接功能的影响,以期阐明其增强自杀基因疗法杀伤肝癌细胞效应的作用机制。【方法】取大鼠脾淋巴细胞,加入六味地黄丸的5种主要入血成分,体外培养后取含药淋巴上清,采用流式细胞术结合荧光示踪法分析其对细胞缝隙连接通讯功能(GJIC)的影响;利用Western blot法检测含药淋巴上清对大鼠肝癌CBRH7919细胞Cx43蛋白表达的影响;利用GJ阻滞剂甘草次酸(GA)观察阻滞GJIC后,含药淋巴细胞上清联合tk/GCV系统对细胞杀伤作用的影响。【结果】流式细胞术结合荧光示踪法结果表明,占培养液15%(体积分数)的含药淋巴上清能促进大鼠肝癌CBRH7919细胞的GJIC功能;Western blot法结果显示,含药淋巴细胞上清能提高大鼠肝癌CBRH7919细胞Cx43蛋白的表达水平;GA阻断GJIC功能后,含药淋巴细胞上清联合tk/GCV系统对细胞杀伤作用降低。【结论】六味地黄丸入血成分处理的淋巴上清可通过缝隙连接机制发挥对自杀基因杀伤大鼠肝癌细胞的增效作用。     

六味地黄丸通过干预缝隙连接通讯功能调控树突状细胞抗原交叉提呈能力研究

【目的】探讨六味地黄丸是否通过提高缝隙连接通讯功能(GJIC)增强树突状细胞(DC)抗原交叉提呈能力,并对其机制进行相关探索。【方法】采用Western Blot实验、免疫荧光法观察六味地黄丸含药血清对黑色素瘤细胞(B16)缝隙连接蛋白43(Cx43)表达及膜定位的影响;采用钙黄绿素(Ca-AM)/DiI荧光示踪实验观察六味地黄丸含药血清对B16细胞GJIC功能的影响;采用流式细胞术观察GJIC在六味地黄丸含药血清增强DC抗原提呈能力中的作用;采用碘化丙啶(PI)/Hoechst染色实验观察CD8⁺T淋巴细胞的免疫杀伤效果。【结果】Western Blot及免疫荧光实验结果显示,六味地黄丸含药血清上调Cx43表达;荧光示踪实验证明,六味地黄丸含药血清显著增强B16细胞GJIC功能;流式细胞术分析表明,六味地黄丸含药血清增强DC抗原提呈能力;PI/Hoechst染色结果显示,六味地黄丸含药血清干预B16-OVA后CD8⁺T细胞的免疫杀伤效果更加显著。【结论】六味地黄丸通过上调黑色素瘤细胞Cx43表达,改善GJIC功能,进而增强DC的交叉提呈能力...     

六味地黄丸含药血清调控黑色素瘤B16细胞株缝隙连接蛋白表达的作用

[目的] 观察六味地黄丸含药血清调控小鼠黑色素瘤B16细胞株缝隙连接蛋白(Cx)表达的作用.[方法]采用SD大鼠灌胃8 d制备六味地黄丸含药血清(药物荆量为32 g·kg-1·d-1)和对照血清(灌胃等容积生理盐水);选择对B16细胞生长和形态影响不大的血清浓度 (体积分数为10%) 作为大鼠血清的工作浓度;采用Western blot技术和间接免疫荧光法及流式荧光法检测六味地黄丸含药血清对黑色素瘤B16细胞株缝隙连接蛋白(Cx26/30/32)表达的影响.[结果]Westem blot检测显示空白组 (无鼠血清) 3种Cx几乎不表达,而对照血清和六味地黄丸各浓度含药血清均能提高Cx蛋白的表达,但含药血清的作用更为明显且有显著的量效关系;间接免疫荧光法和流式荧光法检测显示类似的结果:对照血清组和中、高剂量含药血清组的Cx蛋白荧光强度均较空白组显著增加(P<0.01),但与对照血清组比较,只有高剂量含药血清组荧光强度显著增加(P<0.05),低剂量舍药血清组Cx蛋白表达反而下降(P<0.01).[结论]六味地黄丸含药血清具有调控小鼠黑色素瘤B16细胞株缝隙连接蛋白表达的作用.     

自杀基因系统联合六味地黄丸对肝癌细胞杀伤的协同作用

[目的]观察六味地黄丸含药血清协同HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统杀伤大鼠肝癌CBRH7919细胞的作用,探讨建立自杀基因联合中药方药的肿瘤基因治疗联合方案的可行性.[方法]构建HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统,确定丙氧鸟苷(GCV)工作浓度(39.2 μmol/L);选用SD大鼠灌胃制备六味地黄丸含药血清和空白血清,并观察含药血清和空白血清对肿瘤细胞生长的影响.设空白对照组、GCV对照组、自杀基因治疗对照组,以上3组均为无大鼠血清的对照组.空白血清组、GCV加空白血清组、自杀基因系统加空白血清组、含药血清组、GCV加含药血清组、自杀基因系统联合含药血清组中,所有大鼠的空白血清和含药血清再分为体积分数5%和7.5%2种浓度,每组设6个复孔.将大鼠肝癌细胞CBRH7919/tk 和CBRH7919/tk-混合,使tk 细胞的比例分别占0%、5%、10%,按3×103个/孔细胞分别接种到96孔板,用完全培养基培养细胞24 h后,相应加入体积分数5%或7.5%的大鼠空白血清和含药血清,孵育J2 h,加入GCV,培养60 h,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞存活率,用Q值(实测药效与理论药效的比值)分析自杀基因系统与含药血清联合的相互作用是否具有协同性(0.85≤Q＜1.15为相加作用,Q≥1.15为协同作用).[结果]空白血清和含药血清浓度在体积分数20%以下时未显示明显细胞毒性;血清浓度为体积分数5%和7.5%时,自杀基因系统联合含药血清组与单独含药血清组及自杀基因系统加空白血清组比较,联合组对肿瘤细胞的杀伤作用均强于其他非联合组,细胞存活率均有显著性差异(P＜0.01),而且自杀基因系统联合含药血清的作用具有明显的协同性(Q＞1.15).[结论]HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统联合六味地黄丸对杀伤肿瘤细胞具有协同增效作用.     

六味地黄丸增强黑色素瘤自杀基因系统旁观者效应的体外研究

【目的】探讨六味地黄丸含药血清对单纯疱疹病毒核苷激酶/丙氧鸟苷(HSV-tk/GCV)系统杀伤小鼠黑色素细胞瘤B16细胞株的增效作用,为提高临床基因治疗肿瘤疗效提供新思路。【方法】构建并鉴定恶性黑色素瘤B16细胞HSV-tk/GCV治疗系统,制备六味地黄丸含药血清及对照血清,将B16、B16/tk细胞按20%(1:4)的比例混合制成细胞悬浮液接种于96孔培养板上,分为对照血清组、含药血清组、对照血清联合GCV组、含药血清联合GCV组,其中含药血清组及含药血清联合GCV组按血清体积分数计又分高(10%)、中(5%)、低(2.5%)3组,GCV的终浓度为25μmol/L,按分组添加相应的含药血清,每孔培养液总体积200μL,37℃、体积分数5%的CO2培养箱培养。48h后采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测杀伤效应。采用金正钧Q值法分析六味地黄丸含药血清与自杀基因治疗系统联合作用对旁观者效应是否具有协同性。【结果】MTT实验表明联合用药组对B16细胞的抑制率明显高于其他组,六味地黄丸含药血清对B16细胞株HSV-tk/GCV系统的增效作用存在量效关系:2.5%、5%、10%含药血清联合20%tk/GCV组的实际抑制率(48.75%、59.39%、69.28%)显著高于理论抑制率(38.13%、38.67%、39.92%),金正钧Q值分别为1.28、1.54、1.74,均大于1.15,具有协同增效作用。【结论】六味地黄丸含药血清对B16细胞株HSV-tk/GCV系统旁观者效应有明显的增效作用,且具有一定的量效关系。     

六味地黄丸对自杀基因系统杀伤肝癌细胞增效作用的量效关系

[目的]观测六味地黄丸含药血清对自杀基因HSV-tk/GCV系统杀伤大鼠肝癌CBRH7919细胞的增效作用,探讨建立自杀基因联合中药方药的肿瘤基因治疗联合方案的可行性.[方法]构建HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统,并确定丙氧鸟苷(GCV)的工作浓度(39.2 μmol/L);制备SD大鼠4 d和8 d六味地黄丸(剂量为32g·kg-1·d-1)灌胃含药血清和生理盐水灌 胃空白血清;用大鼠肝癌细胞CBRH7919/tk-或tk-与tk-1:9比例混合细胞按3×103个/孔铺96孔板,分为空白血清组、GCV加空白血清组、10%tk+/GCV加空白血清组、含药血清组、GCV加含药血清组及10%tk+/GCV联合含药血清组;含药血清又再分为低剂量组、中剂量组和高剂量组,每组6个复孔,用完全培养基培养24 h后,各组分别加入相应空白血清或含药血清,孵育12 h,加入终浓度39.2 μmol/L的GCV,培养60 h,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞活性,Q值法分析自杀基因系统与含药血清联合的相互作用是否具有协同性.[结果]空白血清组、含药血清组、GCV加空白血清组、GCV加含药血清组细胞均未显示明显的细胞毒性.10%tk+/GCV加空白血清组及10%tk+/GCV联合不同浓度的含药血清组均具有显著杀伤作用(与空白血清组比较,P<0.05),联合组存活率显著低于10%tk+/GCV加空白血清组(P<0.05);含药血清中剂量和高剂量组的联合作用具有协同性(Q>1.15),且有浓度依赖性.给药4 d血清和给药8 d血清结果无显著性差异(P>0.05).[结论]六味地黄丸含药血清对自杀基因系统10%tk+/GCV杀伤大鼠肝癌CBRH7919细胞具有协同增效作用,且有一定的量效关系.     

吴茱萸碱对大鼠肝癌细胞缝隙连接细胞通讯功能及连接蛋白表达的影响

目的探讨吴莱萸碱抗肿瘤的作用机制。方法用终浓度为0．1,0．2,0．3μmol／L的吴茱萸碱作用于CBRH7919细胞,同时设不加吴茱萸碱的空白对照组。采用划痕标记染料示踪技术检测各组细胞缝隙连接细胞通讯（gap junctional intercellular communication,GJIC）功能;异硫氰酸荧光素间接免疫荧光法检测连接蛋白（connexin,Cx）26、Cx32表达的变化。结果与空白对照组相比,吴莱萸碱各浓度组CBRH7919细胞Cx26、Cx32表达显著增加,GJIC功能增强,并呈一定的剂量效应依赖关系。结论吴茱萸碱上调CBRH7919细胞Cx26和Cx32的表达及促进CBRH7919细胞的GJIC功能,可能是其抗肿瘤的机制之一。     

不同作用机制的镇痛药对细胞缝隙连接通道蛋白Cx43的作用

 【目的】 探讨不同作用机制的镇痛药对细胞缝隙连接通道功能的作用&#65377;【方法】 天然表达Cx43的小鼠睾丸支持细胞TM4实验前用细胞诱导培养液培养使其表达形成有效的细胞缝隙连接(GJ),细胞接种荧光示踪法测定镇痛药对表达Cx43的TM4细胞GJ功能的影响, 同时Western blot检测细胞缝隙连接通道蛋白之一Cx43的表达&#65377;【结果】 吗啡不影响TM4细胞中Cx43的GJ功能,曲马多和凯纷均抑制TM4细胞中Cx43的的GJ功能,但均不影响Cx43的表达&#65377; 【结论】 曲马多和凯纷均抑制由Cx43组成的细胞缝隙连接功能,提示了一个新的镇痛机制:即曲马多和凯纷可能通过抑制中枢神经元的GJ产生镇痛作用&#65377;     

木犀草素增强Cx32/Cx26组成的细胞缝隙连接功能

【目的】 体外观察木犀草素对转染并稳定表达缝隙连接蛋白32/ 26(Cx32/Cx26)的Hela细胞缝隙连接通讯功能(GJIC)和Cx26蛋白表达水平的影响。【方法】 用SRB法检测不同浓度木犀草素对Hela细胞的毒性;用细胞接种荧光示踪法观察不同浓度木犀草素对GJIC的影响;用western blotting 研究木犀草素在影响GJIC功能浓度范围内对Cx26表达的影响。【结果】 木犀草素在0 ~ 1 μmol/L浓度时对Hela细胞无毒性作用;木犀草素(0.01 ~ 1 μmol/L)能浓度依赖性地增强GJIC及Cx26蛋白表达量。【结论】木犀草素增强转染并稳定表达Cx32/Cx26的Hela细胞GJIC;这种增强作用可能与其增加Cx26蛋白表达水平有关。     

红花黄色素对阿霉素心肌损伤小鼠缝隙连接蛋白的影响

【目的】探讨红花黄色素对阿霉素心肌损伤模型中缝隙连接蛋白(Cx43)的影响。【方法】选用SPF级昆明小鼠随机分为5组,正常对照组每天腹腔注射生理盐水,其他各组均腹腔注射阿霉素(ADR)3 mg/kg,隔日1次。同时每日给药:模型组腹腔注射生理盐水,中药高、中、低剂量组腹腔注射红花黄色素(剂量分别为10、5、2.5 g·kg-1·d-1)。第15天解剖取小鼠左心室组织,观察各组心肌组织病理变化,采用免疫组织化学法检测心肌Cx43蛋白表达水平。【结果】在阿霉素心肌损伤模型组中,心肌损伤明显,心肌Cx43的表达水平显著降低,与正常对照组比较差异有统计学意义(P0.05)。中药中、高剂量组对阿霉素心肌损伤具有保护作用,均能显著增加心肌Cx43表达水平(P0.05),而中药低剂量红花黄色素抗阿霉素心肌损伤的作用不明显。【结论】红花黄色素对阿霉素心肌损伤具有一定的保护作用,其作用机制可能与上调心肌缝隙连接蛋白的表达有关。     

三氯化镧对大鼠肝癌细胞株CBRH-7919细胞生长的影响

目的：研究三氯化镧(LaCl₃)对大鼠肝癌细胞生长的影响。 方法：以体外培养大鼠肝癌细胞株CBRH-7919为研究对象,给予LaCl₃(0.01、0.10及1.00 mmol•L^-1)培养不同时间(1、3和5 d)后,观察CBRH-7919细胞生长、集落形成及细胞学变化。同时,运用流式细胞术检测CBRH-7919细胞周期变化。 结果：0.10 mmol•L^-1 LaCl₃组培养3 d,对CBRH-7919生长具有明显的抑制作用（P<0.01）,随着LaCl₃剂量增加和培养时间延长,对该细胞生长的抑制作用明显增强（P<0.01）;0.1、1.00 mmol•L^-1 LaCl₃组的集落形成抑制率同对照组相比,差异均有显著性（P<0.01）。CBRH-7919细胞经LaCl₃作用后,G₀/G₁期细胞百分数增加,0.01、0.10和1.00 mmol•L^-1 LaCl₃组与对照组相比,差异均有显著性（P<0.01）;S期细胞百分数减少,0.10、1.00 mmol•L^-1 LaCl₃组与对照组相比,差异均有显著性（P<0.05）。 结论：LaCl₃对CBRH-7919细胞生长具有明显的抑制作用。     

Optimization of the assembly efficiency for lidamycin chromophore bound to its apoprotein: a case study using orthogonal array

Objective Lidamycin (LDM) can be dissociated to an apoprotein (LDP) and an active enediyne chromophore (AE).The detached AE can reassemble with its LDP‐containing fusion protein to endow the latter with potent antitumor activity.However,the reassembly of AE with LDP is affected by several factors.Our aim was to optimize the assembly efficiency of the AE with a LDP‐containing fusion protein and investigate the influence of several factors on the assembly efficacy.Methods A method based on RP‐HPLC was develop...     

Cx43沉默抑制机械应力诱导的小鼠软骨细胞凋亡

目的：探讨缝隙连接蛋白43(connexin 43,Cx43)沉默对机械应力诱导的软骨细胞凋亡的影响。方法：将小鼠软骨细胞ATDC5分为空白组、机械应力组、Cx43 siRNA转染组、scramble siRNA转染组、机械应力+scramble组、机械应力+siCx43组。用Flexcell FX-5000系统对体外培养的ATDC5细胞加载机械应力;用定量RT-PCR(quantitative RT-PCR,RT-qPCR)和Western印迹分别检测细胞Cx43 mRNA和蛋白表达水平;用细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)法检测细胞活性;用流式细胞术检测细胞凋亡情况;用比色法检测caspase-3活性;用Western印迹检测Bcl-2,Bax,p-JNK和JNK的蛋白表达。结果：经机械应力诱导后,ATDC5细胞Cx43 mRNA和蛋白的表达显著升高(均P<0.05)。转染Cx43 siRNA显著降低细胞Cx43 mRNA和蛋白水平(均P<0.05)。在机械应力刺激下,ATDC5细胞活性显著降低,凋亡增多,caspase-3活性和Bax蛋白表达上调,Bcl-2蛋白表达和Bcl-2/Bax降低(均P<0.05)。而Cx43沉默显著增加机械应力下ATDC5细胞活性,减少凋亡,降低caspase-3活性和Bax蛋白表达,升高Bcl-2蛋白表达和Bcl-2/Bax(均P<0.05)。此外,Cx43 siRNA显著抑制机械应力诱导的p-JNK蛋白的表达(P<0.05)。结论：Cx43沉默可能通过调节JNK信号通路,抑制机械应力作用下小鼠软骨细胞凋亡。     

缝隙连接蛋白在心房纤颤患者心房肌的表达及其信号转导途径

目的探讨缝隙连接蛋白在心房纤颤(房颤)心房肌的表达及其信号转导机制.方法 63例接受开胸手术患者(包括慢性房颤、阵发性房颤、窦性心律患者),手术时取心房组织,应用逆转录-聚合酶链反应技术检测心房肌钙调磷酸酶调节亚单位(Calcineurin B)、丝裂原激活的蛋白激酶磷酸酶-1(MKP-1)mRNA表达量,采用Western印迹方法,检测细胞外调节激酶1(ERK1)、磷酸化细胞外调节激酶1(P-ERK1)、缝隙连接蛋白40(Cx40)、缝隙连接蛋白43(Cx43)蛋白表达量的改变.结果慢性房颤、阵发性房颤患者左心房与右心耳组织Cx40蛋白表达量(左心房2.2±0.8,2.2±0.6;右心耳2.1±0.5,2.0±0.8 ), 与窦性心律组相比,差异有显著意义(P<0.05).慢性房颤、阵发性房颤患者Cx43蛋白仅在左房组织表达高于窦性心律瓣膜病组(3.1±0.6,2.8±0.7 vs 1.0±0.2,P均<0.05).Calcineurin B mRNA、 MKP-1 mRNA、P- ERK1蛋白在慢性房颤、阵发性房颤患者各组的表达水平均明显高于窦性心律组(P<0.05).免疫组化显示慢性房颤、阵发性房颤患者Cx40、Cx43均分布紊乱,聚集于细胞的侧边、胞浆或核周.结论房颤患者心房肌Cx40、Cx43 蛋白基因表达增高且分布异常,可能与ERK1及一些磷酸酶的异常激活、调控失衡有关.     

Mechanism of Regulatory Effect of MicroRNA-206 on Connexin 43 in Distant Metastasis of Breast Cancer

Background:

MicroRNA-206 (miR-206) and connexin 43 (Cx43) are related with the distant metastasis of breast cancer. It remains unclear whether the regulatory effect of miR-206 on Cx43 is involved in metastasis of breast cancer.

Methods:

Using quantitative real-time polymerase chain reaction and Western blot, the expressions of miR-206 and Cx43 were determined in breast cancer tissues, hepatic and pulmonary metastasis (PM), and cell lines (MCF-10A, MCF-7, and MDA-MB-231). MCF-7/MDA-M-231 cells were transfected with lentivirus-shRNA vectors to enhance/inhibit miR-206, and then Cx43 expression was observed. Cell counting kit-8 assay and Transwell method were used to detect their changes in proliferation, migration, and invasion activity. The mutant plasmids of Cx43-3’ untranslated region (3’UTR) at position 478–484 and position 1609–1615 were constructed. Luciferase reporter assay was performed to observe the effects of miR-206 on luciferase expression of different mutant plasmids and to confirm the potential binding sites of Cx43.

Results:

Cx43 protein expression in hepatic and PM was significantly higher than that in the primary tumor, while no significant difference was showed in messenger RNA (mRNA) expression. MiR-206 mRNA expression in hepatic and PM was significantly lower than that in the primary tumor. Cx43 mRNA and protein levels, as well as cell proliferation, migration, and invasion capabilities, were all significantly improved in MDA-MB-231 cells after reducing miR-206 expression but decreased in MCF-7 cells after elevating miR-206 expression, which demonstrated a significantly negative correlation between miR-206 and Cx43 expression (P = 0.03). MiR-206 can drastically decrease Cx43 expression of MCF-7 cells but exerts no effects on Cx43 expression in 293 cells transfected with the Cx43 coding region but the lack of Cx43-3’UTR, suggesting that Cx43-3’UTR may be the key in Cx43 regulated by miR-206. Luciferase expression showed that the inhibition efficiency was reduced by 46.80% in position 478–484 mutant, 16.72% in position 1609–1615 mutant; the inhibition was totally disappeared in double mutant (P = 0.02).

Conclusions:

MiR-206 can regulate the expression of Cx43, the cytobiological activity, and the metastasis of breast cancer through binding to the two binding sites in Cx43-3’UTR: position 478–484 and position 1609–1615.     

山奈酚对大鼠肝癌细胞CBRH7919的增殖抑制及诱导凋亡作用

[目的]观察山奈酚对大鼠肝癌细胞CBRH7919增殖抑制、诱导凋亡和细胞周期的影响.[方法]选用CBRH7919肝癌细胞株,传代培养24 h后,加入不同浓度山奈酚处理,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞存活率,4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色观察细胞凋亡形态,彗星电泳技术和流式细胞术检测药物对细胞DNA的作用.[结果]山奈酚体外能抑制大鼠肝癌细胞CBRH7919的增殖,以6.25、12.5、25、50、100 μmoL/L浓度的山奈酚处理细胞72 h,对CBRH7919细胞的增殖抑制率显著升高,呈明显的剂量效应关系.用50、100μmol/L浓度的山奈酚作用于细胞24、48、72、96 h,对细胞的增殖抑制作用显著增强,呈明显的时间效应关系,即药物作用时间越长,抑制作用越强.DAPI染色显示不同浓度山奈酚组的细胞均有明显的细胞凋亡特征.彗星电泳显示30、60、120μmol/L浓度的山奈酚作用于细胞72 h后,细胞后面均呈现长度不等的拖尾,平均光密度值较空白对照组显著降低(P<0.01),彗星尾距较空白对照组显著增加(P<0.01),且两者改变与药物浓度相关.流式细胞仪检测结果显示30、60、120μmol/L浓度的山奈酚作用于细胞72 h出现亚二倍体凋亡峰,细胞周期被阻滞于S期,不同浓度山奈酚组凋亡率较空白对照组均明显增高.[结论]山奈酚可能通过抑制大鼠肝癌细胞CBRH7919的增殖及诱导其凋亡而产生抗肿瘤作用.     

间隙连接蛋白Cx43在卵巢癌中的表达及意义

目的：探讨间隙连接蛋白Cx43（connexin43,Cx43）在上皮性卵巢癌中的表达及意义。方法：对10例正常卵巢上皮，38例不同分化程度的卵巢浆液性囊腺癌的石蜡包埋切片，用免疫组织化学SP法和计算机图像分析系统检测Cx43蛋白的表达，结果：正常卵巢上皮及卵巢癌组织中Cx43蛋白定位于细胞膜和细胞质中；不同分化程度卵巢癌组织中Cx43阳性表达的相对面积和平均吸光度值均显著低于正常卵巢表面上皮细胞（P＜0．01），而且随着卵巢癌细胞分化程度的下降而显著降低（P＜0．01）。结论：Cx43蛋白表达下降与上皮性卵巢癌的发生发展密切相关。