六味地黄丸增强黑色素瘤自杀基因系统旁观者效应的体外研究

【目的】探讨六味地黄丸含药血清对单纯疱疹病毒核苷激酶/丙氧鸟苷(HSV-tk/GCV)系统杀伤小鼠黑色素细胞瘤B16细胞株的增效作用,为提高临床基因治疗肿瘤疗效提供新思路。【方法】构建并鉴定恶性黑色素瘤B16细胞HSV-tk/GCV治疗系统,制备六味地黄丸含药血清及对照血清,将B16、B16/tk细胞按20%(1:4)的比例混合制成细胞悬浮液接种于96孔培养板上,分为对照血清组、含药血清组、对照血清联合GCV组、含药血清联合GCV组,其中含药血清组及含药血清联合GCV组按血清体积分数计又分高(10%)、中(5%)、低(2.5%)3组,GCV的终浓度为25μmol/L,按分组添加相应的含药血清,每孔培养液总体积200μL,37℃、体积分数5%的CO2培养箱培养。48h后采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测杀伤效应。采用金正钧Q值法分析六味地黄丸含药血清与自杀基因治疗系统联合作用对旁观者效应是否具有协同性。【结果】MTT实验表明联合用药组对B16细胞的抑制率明显高于其他组,六味地黄丸含药血清对B16细胞株HSV-tk/GCV系统的增效作用存在量效关系:2.5%、5%、10%含药血清联合20%tk/GCV组的实际抑制率(48.75%、59.39%、69.28%)显著高于理论抑制率(38.13%、38.67%、39.92%),金正钧Q值分别为1.28、1.54、1.74,均大于1.15,具有协同增效作用。【结论】六味地黄丸含药血清对B16细胞株HSV-tk/GCV系统旁观者效应有明显的增效作用,且具有一定的量效关系。     

六味地黄丸对体外培养的黑素细胞的抑制作用

目的 :研究六味地黄丸对体外培养的黑素细胞的抑制作用。方法 :采用MTT法测定细胞增殖情况 ;NaOH裂解法测定黑素合成 ;Takahashi法测定酪氨酶含量。结果 :六味地黄丸对黑素细胞的增殖有抑制作用 ,能使细胞数明显减少 (P<0 .0 5 ) ,并能使黑素合成显著下降 (P <0 .0 1) ,使酪氨酸酶活性逐渐减弱 (P <0 .0 1)。结论 :六味地黄丸能抑制黑素细胞增殖、黑素合成、酪氨酸酶活性 ,这可能是临床应有六味地黄丸治疗皮肤色素性疾病的机制。     

六味地黄丸对自杀基因系统杀伤肝癌细胞增效作用的量效关系

[目的]观测六味地黄丸含药血清对自杀基因HSV-tk/GCV系统杀伤大鼠肝癌CBRH7919细胞的增效作用,探讨建立自杀基因联合中药方药的肿瘤基因治疗联合方案的可行性.[方法]构建HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统,并确定丙氧鸟苷(GCV)的工作浓度(39.2 μmol/L);制备SD大鼠4 d和8 d六味地黄丸(剂量为32g·kg-1·d-1)灌胃含药血清和生理盐水灌 胃空白血清;用大鼠肝癌细胞CBRH7919/tk-或tk-与tk-1:9比例混合细胞按3×103个/孔铺96孔板,分为空白血清组、GCV加空白血清组、10%tk+/GCV加空白血清组、含药血清组、GCV加含药血清组及10%tk+/GCV联合含药血清组;含药血清又再分为低剂量组、中剂量组和高剂量组,每组6个复孔,用完全培养基培养24 h后,各组分别加入相应空白血清或含药血清,孵育12 h,加入终浓度39.2 μmol/L的GCV,培养60 h,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞活性,Q值法分析自杀基因系统与含药血清联合的相互作用是否具有协同性.[结果]空白血清组、含药血清组、GCV加空白血清组、GCV加含药血清组细胞均未显示明显的细胞毒性.10%tk+/GCV加空白血清组及10%tk+/GCV联合不同浓度的含药血清组均具有显著杀伤作用(与空白血清组比较,P<0.05),联合组存活率显著低于10%tk+/GCV加空白血清组(P<0.05);含药血清中剂量和高剂量组的联合作用具有协同性(Q>1.15),且有浓度依赖性.给药4 d血清和给药8 d血清结果无显著性差异(P>0.05).[结论]六味地黄丸含药血清对自杀基因系统10%tk+/GCV杀伤大鼠肝癌CBRH7919细胞具有协同增效作用,且有一定的量效关系.     

六味地黄丸治疗卵巢早衰的实验研究

目的:观察六味地黄丸对大鼠卵巢早衰的作用。方法:造成大鼠早衰模型,然后检测六味地黄丸对β-内啡肽、血清雌、孕激素含量以及对卵巢、子宫组织形态学的影响。结果:六味地黄丸能够提高β-内啡肽含量,增加大鼠阴道脱落细胞涂片内角化上皮细胞和表层细胞。结论:六味地黄丸具有雌激素样作用,可能通过调理下丘脑—垂体—卵巢轴的功能,使卵巢功能恢复。     

六味地黄丸通过干预缝隙连接通讯功能调控树突状细胞抗原交叉提呈能力研究

【目的】探讨六味地黄丸是否通过提高缝隙连接通讯功能(GJIC)增强树突状细胞(DC)抗原交叉提呈能力,并对其机制进行相关探索。【方法】采用Western Blot实验、免疫荧光法观察六味地黄丸含药血清对黑色素瘤细胞(B16)缝隙连接蛋白43(Cx43)表达及膜定位的影响;采用钙黄绿素(Ca-AM)/DiI荧光示踪实验观察六味地黄丸含药血清对B16细胞GJIC功能的影响;采用流式细胞术观察GJIC在六味地黄丸含药血清增强DC抗原提呈能力中的作用;采用碘化丙啶(PI)/Hoechst染色实验观察CD8⁺T淋巴细胞的免疫杀伤效果。【结果】Western Blot及免疫荧光实验结果显示,六味地黄丸含药血清上调Cx43表达;荧光示踪实验证明,六味地黄丸含药血清显著增强B16细胞GJIC功能;流式细胞术分析表明,六味地黄丸含药血清增强DC抗原提呈能力;PI/Hoechst染色结果显示,六味地黄丸含药血清干预B16-OVA后CD8⁺T细胞的免疫杀伤效果更加显著。【结论】六味地黄丸通过上调黑色素瘤细胞Cx43表达,改善GJIC功能,进而增强DC的交叉提呈能力...     

六味地黄丸治疗早期糖尿病肾病的研究

目的探讨六味地黄丸对早期糖尿病肾病（DN）的疗效。方法 60例早期糖尿病肾病（DN）患者分成2组：六味地黄丸治疗组与对照组,分别检测治疗前后24h尿微量白蛋白（mALb）和肾功能（BUNCr）变化。结果与治疗前相比,六味地黄丸治疗组治疗后24h尿mALb显著下降,肾功能明显改善;对照组治疗前后无明显改变。结论六味地黄丸治疗早期糖尿病肾病可以减少尿微量白蛋白（mALb）的产生,延缓糖尿病肾病（DN）的发展。     

六味地黄丸含药血清调控黑色素瘤B16细胞株缝隙连接蛋白表达的作用

[目的] 观察六味地黄丸含药血清调控小鼠黑色素瘤B16细胞株缝隙连接蛋白(Cx)表达的作用.[方法]采用SD大鼠灌胃8 d制备六味地黄丸含药血清(药物荆量为32 g·kg-1·d-1)和对照血清(灌胃等容积生理盐水);选择对B16细胞生长和形态影响不大的血清浓度 (体积分数为10%) 作为大鼠血清的工作浓度;采用Western blot技术和间接免疫荧光法及流式荧光法检测六味地黄丸含药血清对黑色素瘤B16细胞株缝隙连接蛋白(Cx26/30/32)表达的影响.[结果]Westem blot检测显示空白组 (无鼠血清) 3种Cx几乎不表达,而对照血清和六味地黄丸各浓度含药血清均能提高Cx蛋白的表达,但含药血清的作用更为明显且有显著的量效关系;间接免疫荧光法和流式荧光法检测显示类似的结果:对照血清组和中、高剂量含药血清组的Cx蛋白荧光强度均较空白组显著增加(P<0.01),但与对照血清组比较,只有高剂量含药血清组荧光强度显著增加(P<0.05),低剂量舍药血清组Cx蛋白表达反而下降(P<0.01).[结论]六味地黄丸含药血清具有调控小鼠黑色素瘤B16细胞株缝隙连接蛋白表达的作用.     

六味地黄丸的药理作用及临床应用研究

1药理、药效学研究 1．1调节机体免疫功能：激活骨髓造血干细胞。高冬等推测六味地黄丸低、中剂量（3．25g／kg、6．5g／kg）药物有激活造血干细胞的作用。另外,DNA检测结果表明,三个剂量均有促进细胞增殖的效果。     

六味地黄丸对小鼠移植性肝癌自杀基因治疗的增效作用

【目的】观察六味地黄丸对小鼠皮下移植性肝细胞癌自杀基因治疗的增效作用,探讨建立中西医结合肿瘤自杀基因联合治疗方案的可行性。【方法】培养病毒包装细胞PT67/tk,病毒上清感染肝细胞癌细胞株H22后用G418筛选2周,获得抗性细胞克隆,命名为H22/tk并进行体外丙氧鸟苷(GCV)杀伤试验;证明杀伤活性后,将H22/tk与野生型H22按1∶4的比例混合后接种于昆明种小鼠皮下组织内造模,分为模型对照组、自杀基因治疗组、六味地黄丸治疗组和联合治疗组(N=20),并设正常对照组(N=10);六味地黄丸治疗从接种第2天起共15 d,GCV治疗从接种第6天起共11 d,观察疗效。【结果】体外实验中GCV对H22/tk肿瘤细胞具有明显的杀伤效应,表明体外病毒感染肝癌细胞成功,病毒携带的外源性自杀基因已表达且具有生物学活性。体内实验中于接种肿瘤细胞后第6天各组能触摸到肿瘤,成瘤率100%。自杀基因联合六味地黄丸治疗对小鼠移植性肝细胞癌生长速度具有明显抑制作用,以瘤块质量计算,其抑瘤率为63.0%(P<0.05);而单纯六味地黄丸治疗和单纯自杀基因治疗抑瘤率分别为46.3%和37.4%,但两者与模型组比较差异均无显著性意义。病理检查:各治疗组肉眼可见肿瘤体积均较模型对照组肿瘤体积小,以联合治疗组更明显。镜下可见各治疗组肿瘤细胞密度相对较低,肿瘤周围有较多纤维结缔组织增生及炎症细胞浸润,联合治疗组更明显,各组间差别以炎症细胞浸润最突出。【结论】六味地黄丸对小鼠移植性肝癌自杀基因治疗具有一定的增效作用,其疗效优于单纯自杀基因疗法或单纯六味地黄丸治疗。     

山奈酚对大鼠肝癌细胞CBRH7919的增殖抑制及诱导凋亡作用

[目的]观察山奈酚对大鼠肝癌细胞CBRH7919增殖抑制、诱导凋亡和细胞周期的影响.[方法]选用CBRH7919肝癌细胞株,传代培养24 h后,加入不同浓度山奈酚处理,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞存活率,4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色观察细胞凋亡形态,彗星电泳技术和流式细胞术检测药物对细胞DNA的作用.[结果]山奈酚体外能抑制大鼠肝癌细胞CBRH7919的增殖,以6.25、12.5、25、50、100 μmoL/L浓度的山奈酚处理细胞72 h,对CBRH7919细胞的增殖抑制率显著升高,呈明显的剂量效应关系.用50、100μmol/L浓度的山奈酚作用于细胞24、48、72、96 h,对细胞的增殖抑制作用显著增强,呈明显的时间效应关系,即药物作用时间越长,抑制作用越强.DAPI染色显示不同浓度山奈酚组的细胞均有明显的细胞凋亡特征.彗星电泳显示30、60、120μmol/L浓度的山奈酚作用于细胞72 h后,细胞后面均呈现长度不等的拖尾,平均光密度值较空白对照组显著降低(P<0.01),彗星尾距较空白对照组显著增加(P<0.01),且两者改变与药物浓度相关.流式细胞仪检测结果显示30、60、120μmol/L浓度的山奈酚作用于细胞72 h出现亚二倍体凋亡峰,细胞周期被阻滞于S期,不同浓度山奈酚组凋亡率较空白对照组均明显增高.[结论]山奈酚可能通过抑制大鼠肝癌细胞CBRH7919的增殖及诱导其凋亡而产生抗肿瘤作用.     

六味地黄丸(浓缩丸)微波干燥工艺的验证

目的对六味地黄丸(浓缩丸)的微波干燥工艺进行验证。方法采用同步验证,以干燥药丸的水分、溶散时限、微生物限度为指标,考察其干燥、灭菌效果的稳定性。结果微波干燥后,不同取样位置的药丸微生物限度指标良好。干燥后药丸的水分和溶散时限均符合质量标准,但是水分和溶散时限指标却存在差异。结论微波干燥工艺的灭菌效果稳定、可靠。应采取一定措施改善干燥药丸的水分、溶散时限指标的差异。     

基于网络药理学的六味地黄丸治疗冠心病的分子机制研究*

目的运用网络药理学分析六味地黄丸治疗冠心病的分子机制。方法 从中药系统药理学分析平台（TCMSP）获得与六味地黄丸中6味中药相关的所有化学成分和作用靶点,运用 Cytoscape 3.2.1软件构建化合物靶点相互作用网络图,利用TTD、Drugbank、DisGeNET数据库筛选冠心病相关的疾病靶点,将冠心病靶点与药物靶点进行Venn分析,筛选出二者的共同靶点,应用STRING平台构建蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络模型。通过DAVID （Version 6.8）数据库对疾病与药物共同靶点进行 Gene Ontology（GO）富集分析、KEGG通路富集分析。结果 共筛选出六味地黄丸的43种主要成分及与治疗冠心病相关的关键靶点85个,靶点主要涉及调节脂多糖代谢、炎症反应、细胞分裂、细胞因子活性、DNA复制及其转录等生物过程,通过参与TNF、HIF-1、PI3K/Akt、Estrogen、TLRs、NF-κB、cGMP-PKG、cAMP等信号通路治疗冠心病。结论 本研究从多角度探索了六味地黄丸治疗冠心病可能的作用机制,揭示了六味地黄丸具有多成分、多靶点和多途径治疗疾病的特点,为其临床应用及进一步研究其药效作用机制奠定基础。     

HPLC测定不同厂家六味地黄丸中丹皮酚的含量

目的建立测定六味地黄丸中丹皮酚含量的HPLC法,测定九个厂家生产的六味地黄丸中丹皮酚的含量,并比较其含量。方法固定相：Diamonsil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm,5μm）;流动相：甲醇-水（70∶30）;流速：1.0 ml/min;检测波长：274 nm。结果丹皮酚在0.4~30μg/ml的浓度范围内,A=123549C＋75111线性关系良好（r=0.9997）;丹皮酚的平均回收率（n=9）分别为91.60%（RSD=0.35%）,99.46%（RSD=1.10%）,95.32%（2.81%）。结论本含量测定方法准确,灵敏,重现性好,可用于六味地黄丸中丹皮酚的含量测定。     

六味地黄滴心丸总糖含量测定

目的建立六味地黄滴心丸总糖含量测定方法。方法以蒽酮-硫酸比色法,检测波长为625 nm,用葡萄糖为对照品对六味地黄滴心丸中总糖的含量进行测定。结果葡萄糖对照品溶液的线性范围为0.005 4～0.026 8 mg/mL（r=0.999 8）,平均回收率为98.30%。结论本研究确定的方法简便,可靠,准确,可用于六味地黄滴心丸中总糖的含量测定。     

六味地黄丸抑制巨噬细胞激活抗肝纤维化作用机制研究

目的?观察六味地黄丸对四氯化碳(CCl₄)小鼠肝纤维化过程中巨噬细胞激活的影响。方法?每周3次腹腔注射CCl₄共6周制备肝纤维化模型,六味地黄丸在CCl₄造模同时灌胃给药。免疫荧光检测α-SMA表达,免疫组化检测巨噬细胞标志物CD68表达,qPCR检测α-SMA、TNF-α、IL-1β、MCP1、CXCR3表达,Western blot检测α-SMA、MCP1和CXCR3。结果?造模6周,α-SMA表达显著升高(P<0.01),六味地黄丸显著抑制α-SMA表达(P<0.01);CCl₄造模后CD68主要分布在纤维间隔呈强阳性表达;与正常组相比,模型组TNF-α、IL-1β、MCP1、CXCR3表达显著升高(P<0.01);与模型组相比,六味地黄丸显著降低CD68及促炎症因子、趋化因子的表达(P<0.01)。结论?六味地黄丸对CCl₄肝纤维化过程中的巨噬细胞激活有显著抑制作用。      

六味地黄丸对糖尿病伴牙周炎大鼠牙周组织中OPG与RANKL的影响

目的通过研究六味地黄丸对糖尿病伴牙周炎大鼠牙周组织中骨保护素(OPG)与核因子-κB受体活化子配体(RANKL)的影响,探索六味地黄丸对牙周炎治疗的作用机制。方法选用清洁级6周龄雄性SD大鼠30只,采用腹腔注射链脲佐菌素(STZ)诱导大鼠糖尿病模型,采用钢丝结扎法建立牙周炎模型。动物模型建立后,随机分成实验组和对照组,实验组进行六味地黄丸灌胃,对照组采用蒸馏水灌胃;并于灌药后8周处死动物,解剖上颌骨,制作3μm厚连续切片,荧光免疫组化检测牙周组织中RANKL、OPG表达。激光共聚焦显微镜(LSCM)采集图像,行灰度值分析,比较OPG和RANKL在糖尿病实验组和对照组大鼠牙周组织中的表达差异。结果灌药后8周,实验组的OPG灰度值比对照组增加,且差异有统计学意义(P0.05),而实验组RANKL灰度值比对照组明显降低,差异有统计学意义(P0.05)。结论六味地黄丸对糖尿病伴牙周炎大鼠的牙周组织炎症有明显抑制作用,六味地黄丸对牙周炎治疗机制可能是通过RANKL-细胞核因子κB受体活化因子(RANK)-OPG系统来实现。     

妈富隆联合归脾丸、六味地黄丸治疗围绝经期功能性子宫出血的临床效果

目的探讨妈富隆（化学名：去氧孕烯炔雌醇片）联合归脾丸、六味地黄丸治疗围绝经期功能性子宫出血的临床效果。方法将120例确诊为围绝经期功能性子宫出血的患者随机分为妈富隆联合归脾丸、六味地黄丸组（实验组）与米非司酮组（对照组）,每组各60例,比较两组患者的止血效果、不良反应,并观察治疗1年后患者自然绝经情况。结果实验组的显效率（63.3%）和总有效率（93.3%）均高于对照组的38.3%、78.3%,差异均有统计学意义（P〈0.05）,出血时间和控制周期均短于对照组,突破性出血和不良反应的发生率也低于对照组,差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论妈富隆联合归脾丸、六味地黄丸治疗围绝经期功能性子宫出血效果显著,不良反应小,临床效果优于米非司酮。     

六味地黄丸对OLETF鼠胰岛素抵抗的影响

目的观察六味地黄丸对自发性2型糖尿病大鼠模型OLETF鼠胰岛素抵抗的影响。方法自发性2型糖尿病大鼠OLETF鼠40只,随机分为六味地黄丸干预组和对照组;LETO鼠10只作为正常对照组。干预组从8周龄起以六味地黄丸2.4mg/(kg.d)灌胃给药,其余两组以等量清水灌胃。定期OGTT试验,监测各组大鼠摄食及体重增长情况,每周称量大鼠体重和摄食量。于8,32和40周龄时分批宰杀大鼠。检测血浆胰岛素。结果对照组和干预组OLETF鼠摄食量显著高于LETO组(P<0.01)。对照组和干预组OLETF鼠体重从第6周开始显著高于LETO组(P<0.05)。干预组血浆胰岛素显著低于对照组(P<0.05),与LETO组相比差异无显著性(P<0.05)。结论六味地黄丸能够显著降低OLETF鼠血糖升高程度,延缓高血糖的出现;六味地黄丸能够显著降低血浆胰岛素。     

近红外光谱法快速测定六味地黄丸中马钱苷

目的 利用近红外光谱（NIRS）法快速测定不同厂家浓缩六味地黄丸中马钱苷。方法 利用HPLC法测定六味地黄丸中马钱苷,运用偏最小二乘法建立NIRS与HPLC测定值之间的多元校正模型。结果 马钱苷定量校正模型的内部交叉验证均方差RMSECV为0.049 3,决定系数R²为96.62,对预测集进行预测,预测值与真实值的相关系数r²＝97.17,预测均方差RMSEP为0.038 9,方法精密度RSD为1.99%,稳定性RSD为1.13%。结论 NIRS法可准确测定马钱苷,为中成药的快速、无损定量分析提供了依据。     

六味地黄丸物质组释放特征研究

[目的]考察不同释放度测定装置、不同转数和不同释放介质对六味地黄丸物质组释放特性的影响及不同批号六味地黄丸物质组释放特性。[方法]运用中药物质(化合物)组释放动力学方法,以紫外吸收光谱法测定并计算各供试品溶液的物质组浓度及释放度。[结果]在溶出度测定条件为浆法,转速100r/min,以脱气蒸馏水为释放介质的情况下,测定...