变异胰岛素基因在HepG2细胞系中的表达

目的了解变异的胰岛素基因(insulin/furin)在HepG2细胞系中表达及活性胰岛素的产生情况。方法构建含有insulin/furin的表达质粒p(G1RE)3BP-11×furin并转染HepG2细胞,RT-PCR和放射免疫分析法从mRNA和蛋白质水平观察转染后HepG2细胞中insulin/furin的表达和胰岛素的产生情况。结果HindⅢ和EcoR V双酶切验证质粒p(G1RE)3BP-11×furin,切下260bp和4700bp两个片段,回收260bp片段测序证实为insulin/furin;RT-PCR检测转染后的HepG2细胞有insulin/furin的表达,DNA测序证实为insulin/furin;培养基中可检测到胰岛素。结论含insulin/furin的真核表达质粒p(G1RE)3BP-11×furin转染HepG2细胞,insulin/furin成功地在HepG2细胞中表达,并产生有生物活性的胰岛素。     

CB-GFP融合基因在COS-7细胞中的表达与定位

目的：构建以绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）为报告基因的重组表达质粒pEGFP-N1-CB，转染体外培养的COS-7细胞，以观察CB重组蛋白在真核细胞中的表达及定位。方法：PCR方法扩增得到去除终止密码的cB融合基因序列，克隆入真核表达载体pEGFP-N1中，构建重组表达载体pEGFP-N1-CB。脂质体法转染体外培养的COST细胞后，以RT-PCR和Western印迹方法验证其mRNA及蛋白的表达，并在活细胞状态下用荧光显微镜、激光共聚焦显微成像技术直接观察CB-GFP融合蛋白在细胞中的分布和定位。结果：RT．PCR及Western印迹结果均证明CB—GFP融合基因表达载体pEGFP-N1-CB在COS．7细胞中获得了表达。荧光显微镜观察显示，在空载体pEGFP-N1转染组中，COST细胞内荧光呈弥散分布；重组质粒pEGFP-N1-CB转染组中，绿色荧光主要聚集在细胞浆中。结论：CB融合基因能在真核细胞COST中得到高效表达，且蛋白表达主要定位于细胞浆中，本试验为CB重组蛋白的提取及进一步功能研究奠定了基础。     

腺病毒介导血管紧张素Ⅱ2型受体基因转染对血管平滑肌细胞生物学行为的影响

为探讨血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）2型受体（AT2R）基因表达对血管平滑肌（VSMC）增殖,迁移和凋亡等生物学行为的影响,用同源重组方法构建带AT2R基因的重组复制缺陷型腺病毒载体（AdCMV-AT2R),体外转染VSMC,用流式细胞仪检测AT2R转染表达率,RT－PCR方法检测AT2RmRNA表达,VSMC增殖用MTT比色法和5－溴脲苷（BrdU)掺入法检测,迁移用改良Boyden趋化小室法检测,细胞凋亡用流式细胞仪、原位末端标记法检测,结果表明,AdCMV-AT2R转染后,VSMC表达率为89．51％,AT2R峰值表达时,MTT吸光度和BrdU掺入量分别降低61．4％和51．6％（P＜0．01）VSMC的跨膜迁移数减少62．2％（P＜0．05）。细胞凋亡增加约3．2倍,bax表达增加76．3％（P＜0．05）。提示AT2R表达可介导报制VSMC的增殖和迁移,并诱导其发生凋亡。     

大鼠c-ski基因siRNA真核表达载体的构建及其在成纤维细胞中的干扰效果观察

目的构建大鼠c-ski基因的特异性siRNA沉默质粒,并评价其在大鼠皮肤原代成纤维中的干扰效果。方法采用pSUPER质粒构建大鼠c-ski基因siRNA的重组真核表达质粒,转染大鼠皮肤成纤维细胞,采用荧光纤维镜观察转染效率,BrdUELISA法检测转染后细胞增殖情况并作为其干扰效果的初步筛选,定量PCR、免疫组化法检测c-ski基因和蛋白的表达变化。结果构建3个c-SkisiRNA沉默质粒,按照质粒(μg)/脂质体(μl)1∶2.5的比例转染时效率最高,约为53.5%。转染c-SkisiRNA沉默质粒后,细胞增殖降低,且抑制效果与转染剂量成正比。定量PCR、免疫组化法结果显示转染后c-ski基因表达下调51%(P<0.01),蛋白表达明显降低。结论c-Ski沉默质粒构建成功,瞬时转染大鼠皮肤原代成纤维细胞后可以显著抑制c-ski基因和蛋白的表达。     

白细胞介素1在多效生长因子对Schlafen2基因负性调控中的作用

目的:在多效生长因子(pleiotrophin,Ptn)基因稳定沉默的小鼠胚胎成纤维细胞Ptn-siRNA B/MEF241中,研究白细胞介素1(interleukin-1,IL-1)在多效生长因子对Schlafen2(Slfn2)基因负性调控中发挥的作用. 方法:本研究用Ptn-siRNA B/MEF241细胞的培养液培养对照NC细胞不同时间,通过Northern杂交检测NC细胞中Slfn2表达水平变化;应用RT-PCR和Western印迹检测外源性PTN因子(终浓度50 ng/μl)作用对Ptn沉默细胞内IL-1表达水平的影响;分别使用重组人白细胞介素1受体拮抗剂(rhIL-1ra)和IL-1α中和抗体阻断IL-1的作用通路,检测Ptn稳定沉默细胞中Slfn2基因表达变化.结果:Ptn沉默细胞培养液可以诱导对照细胞Slfn2表达;外源性PTN能抑制沉默细胞中IL-1α和IL-1f6的表达;IL-1受体拮抗剂(rhIL-1ra) 和IL-1α中和抗体可抑制Ptn沉默细胞中Slfn2表达.结论:Ptn可能部分通过分泌性的细胞因子间接调控Slfn2基因表达,并且鉴定出在此调控过程中IL-1家族是其中一种非常重要的调控因子.     

KGF基因在COS7细胞中的表达及其活性检测

目的：利用COS7细胞表达角质细胞生长因子(KGF)并检测其活性。方法：利用脂质体把KGF基因转入COS7细胞中，再用Western印迹和ELISA方法检测KGF蛋白的表达，然后用MTT法检测其活性。结果：KGF基因在COS7中得到了表达，并对小鼠肠上皮细胞(IEC-6)具有刺激增殖作用。结论：KGF有望成为肠型放射病治疗的新型药物。     

hTERT启动子调控caspase 3基因的特异性表达及其抑癌作用

目的：探讨端粒酶催化亚基(KFERT)启动子调控caspase3(半胱天冬酶-3)基因在端粒酶阳性肿瘤细胞中表达的特异性及在体内外的抑癌作用。方法：构建hTERT启动子调控的caspase3基因的真核表达载体，通过RTPCR、瞬时转染、MTT法、流式细胞术和动物实验方法，检测hTERT启动子调控caspase3基因表达对肿瘤细胞生长的影响。结果：hTERT启动子调控caspase3基因在端粒酶阳性肿瘤细胞HepG2中有明显表达，而在正常人胚肺成纤维细胞(human embryonic lung fibroblast，HEL)中未见表达；caspase3表达能对端粒酶阳性肿瘤细胞HepG2、HeLa、Glc和A549细胞的增殖产生明显抑制作用，抑制率为10．5％-37．9％；同时也可以诱导HepG2、HeLa、Glc和A549细胞发生凋亡，凋亡率为15．39％-35．19％；而对端粒酶阴性的正常细胞HEL没有明显的影响。动物实验结果显示，hTERT启动子调控的caspase3基因转染对HepC2细胞的体内增殖具有抑制作用。结论：hTERT启动子调控的caspase3基因表达载体是一种有应用潜力的肿瘤基因治疗载体。     

携带人Flt3-ligand基因逆转录病毒载体的构建及其在小鼠骨髓基质细胞中的表达

Flt3-ligand(FL)是近年来新发现的一种细胞因子,属于I型穿膜糖蛋白,具有膜结合型和分泌型两种不同的表达形式.FL与IL-3、IL-6、SCF及GM-CSF等细胞因子协同刺激造血干/祖细胞增殖,因而在造血干/祖细胞的体外培养中获得了广泛应用.FL及G-CSF协同作用能够动员造血干/祖细胞进入外周血,另外,FL还具有抗肿瘤的作用.     

基因枪转染IgHV1-GM-CSF基因在树突细胞中的表达

DNA/子弹.基因枪转染的效率为10.5%±2.4%(n=3),电转染方法 为45.2%±5.6%(n=3),而脂质体方法 只有个别DC表达荧光蛋白,三者比较差异有统计学意义(P<0.01).基因枪方法 转染的DC能够保持其特殊细胞形态,细胞表而标志在转染中无明显变化,而电转染后细胞大量死亡.应用基因枪转染方法,基因疫苗质粒IgHV1-GM-CSF/pcDNA3.0在IX;中得到瞬时表达.结论 基因枪颗粒轰击可使基因疫苗在DC中成功表达,是临床细胞免疫治疗中DC转染的一种可行选择.     

HLA—DR基因的克隆及其在小鼠黑色素瘤细胞中的表达

获得表达ＨＬＡ－ＤＲ基因的小鼠墨色素瘤细胞，方法应用ＲＴ－ＰＣＲ技术从人Ｂ淋巴瘤细胞Ｒａｊｉ中克隆了ＨＬＡ－ＤＲ３α和β链ｃＤＮＡ，并经测序证实。将其分别插入至真核表达载体ｐＬＸＳＮ和ｐＣＥＰ４中，用脂质体转上鼠黑色素瘤细胞Ｂ１６，然后用Ｇ４１８和Ｈｙｇ双重筛选。     

细胞凋亡抑制基因Bcl－2对NIH3T3细胞增殖及辐射敏感性的影响

以含Ｂｃｌ－２的重组逆转录病毒转染包装细胞系ＰＡ３１７，经Ｇ４１８抗性筛选，获得单克隆细胞，扩增并收集培养上清感染ＮＩＨ３Ｔ３细胞，进而完成Ｂｃｌ－２基因向ＮＩＨ３Ｔ３细胞的导入。后者软琼脂集落形成率与细胞增殖速率均高于对照组，而辐射敏感性低于对照组。表明Ｂｃｌ－２基因对ＮＩＨ３Ｔ３细胞的增殖和辐射敏感性均具有一定的影响。     

RNA干涉抑制NIH3T3细胞中外源PC-1基因表达

目的：获得能有效抑制PC—1基因表达的RNAi靶标，用RNAi技术研究PC-1基因表达在前列腺癌中的作用。方法：用DNA重组技术构建了可表达短发夹RNA的重组质粒，将重组质粒与表达PC-1-EGFP融合蛋白的质粒共转染NIH3T3细胞，通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达差异，从5个候选靶标中初筛出最合适的RNAi靶标，再通过RT—PCR和Western印迹从mRNA水平和蛋白质水平检测该RNAi靶标抑制PC-1基因表达的效果。结果：利用RNA干涉有效靶点抑制了NIH3T3细胞中外源PC-I基因表达。结论：这一策略适合大量筛选：RNAi有效靶标序列，其结果为研究RNAi技术降低PC-1基因的表达对前列腺癌细胞的影响奠定了基础。     

近日节律基因Period2对紫外线损伤NIH3T3细胞的影响

目的 探讨Period2(Per2)基因对紫外线损伤NIH3T3细胞的影响.方法 将Per2基因插入pcDNA 3.1,构建Per2基因的真核表达质粒,采用脂质体包裹法转导入NIH3T3细胞内.以紫外灯照射Per2基因过表达(pcDNA 3.1-Per2)的NIH3T3细胞、pcDNA 3.1空白组(pcDNA 3.1-vector)细胞和空白对照组细胞;通过流式细胞术和克隆形成试验检测稳定转染Per2阳性表达的NIH3T3细胞的凋亡、生长情况;采用单细胞凝胶电泳技术检测Per2过表达对DNA损伤后修复的影响.结果 紫外线照射后Per2阳性表达的NIH3T3细胞较其对照组细胞增殖速度快、凋亡率减少,单细胞凝胶电泳实验表明紫外线照射后,各组细胞均表现出明显的DNA损伤,但是pcDNA 3.1-Per2转染组均较pcDNA 3.1-vector及空白对照组细胞的彗星细胞出现率和拖尾细胞DNA迁移长度低.结论 节律基因Per2能抑制紫外线对细胞的损伤,其机制可能与Per2促进DNA修复作用有关.     

骨形态发生蛋白4重组腺病毒的构建及其对NIH3T3细胞成骨分化作用的研究

目的:构建骨形态发生蛋白4(BMP4)重组腺病毒,探讨其对NIH3T3成纤维细胞向成骨方向分化的影响。方法:将BMP4基因克隆连接到载体pAdTrack-CMV中,在细菌BJ5183中与pAdEasy腺病毒基因组进行同源重组,得到BMP4重组腺病毒基因组,通过转染HEK293细胞包装出重组腺病毒。利用BMP4重组腺病毒转染NIH3T3细胞,采用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)和western-blot检测BMP4在细胞中的mRNA和蛋白表达。Gomori改良钙钴法检测BMP4重组腺病毒转染后的NIH3T3细胞碱性磷酸酶表达;von kossa染色检测BMP4重组腺病毒转染后NIH3T3细胞的成骨分化情况。结果:获得了BMP4转移质粒pAdTrack-BMP4和BMP4重组腺病毒基因组,并包装出重组腺病毒。BMP4在转染后的NIH3T3细胞中得到表达,表达的BMP4蛋白具有生物学活性。转染后的NIH3T3细胞碱性磷酸酶表达增加。BMP4促进了NIH3T3细胞向成骨方向分化,形成钙结节。结论:本实验成功构建了BMP4重组腺病毒;BMP4重组腺病毒可促进NIH3T3细胞向成骨方向分化。     

TIG2基因在肺癌细胞中表达及启动子区甲基化的研究

 目的 探讨TIG2基因在原发性非小细胞肺癌中的表达及意义.方法 应用RT-PCR法检测TIG2基因在肺癌和正常肺细胞中表达变化,用CpG岛预测软件分析TIG2基因启动子和第一外显子区域CpG岛分布,用甲基化特异PCR法(MSP)检测TIG2基因甲基化.用RT-PCR法检测去甲基化试剂作用后TIG2基因的表达.结果 正常肺细胞和癌旁正常组织中TIG2mRNA呈高表达,而肺癌细胞系和组织中低表达或沉默.TIG2基因的启动子和(或)第一外显子区域存在典型的CpG岛.在肺癌细胞系均发生TIG2甲基化,肺癌组织中常发生甲基化,而肺癌旁组织中未见甲基化.去甲基化试剂作用后TIG2基因恢复表达.5-氮-2'-脱氧胞苷浓度越高,TIG2mRNA表达的强度越大.结论 甲基化是导致TIG2基因转录沉默的重要机制,TIG2可能是一种新的肺癌肿瘤抑制基因.     

白介素-1对正常和受照射的NIH/3T3成纤维细胞增殖的影响

目的　观察ＩＬ１ 对成纤维细胞生长的影响及其作用机理,为从细胞因子角度开展抗纤维化研究提供依据。方法　用ＭＴＴ比色、ＡｇＮＯＲＳ 银染和免疫组化技术,观察正常和受照ＮＩＨ／３Ｔ３ 成纤维细胞（６０Ｃｏγ源一次照射,吸收剂量３０ Ｇｙ）生长增殖活性、ＡｇＮＯＲＳ 和ＤＮＡ合成以及Ⅲ型胶原表达。结果　ＩＬ１ 浓度为１００ ×１０３Ｕ／Ｌ,培养第３ 天时,成纤维细胞数量和增殖活性（Ａ 值） 为对照值的１－４ 和１－３ 倍（照射组Ａ值为对照的１－１ 倍）;ＡｇＮＯＲＳ 颗粒数和Ｓ期细胞比例分别升高至对照值的２－９ 和２－０ 倍;而Ⅲ型胶原表达阳性细胞数为对照值的１－９ 倍。结论　在一定浓度范围内,ＩＬ１ 能促进成纤维细胞的增殖活性,ＤＮＡ 合成和Ⅲ型胶原表达。     

APE1在鼻腔NK/T细胞淋巴瘤中的表达及其意义

目的探讨DNA损伤修复基因脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶（APE1）在鼻腔NK/T淋巴瘤中的表达及其临床意义.方法用免疫组化法对64例鼻腔NK/T细胞淋巴瘤和10例正常淋巴结中APE1的表达及定位进行检测,并通过图像分析系统计算其积分光密度值.同时应用免疫组化SP法和TUNEL法检测细胞增殖和凋亡变化.结果 APE1在淋巴瘤中存在胞质、胞核和胞核/胞质表达,且以胞核表达明显,其中APE1阳性分度在复发/难治组、无复发/难治组、正常对照组鼻腔NK/T细胞中依次降低（P＜0.01）.APE1高表达多伴随着细胞增殖升高和凋亡减少.APE1表达的程度和患者的预后密切相关.结论 APE1基因表达强度与淋巴瘤的疗效有关,APE1基因表达增强可能是NK/T淋巴瘤患者预后不良的指标之一.     

Lack of inverse dose-rate effect on fission neutron induced transformation of C3H/10T1/2 cells

Exponential and density-inhibited cultures of C3H/10T1/2 cells were exposed to a single dose of 0.3 Gy of fission neutrons delivered at rates ranging from 0.005 to 0.1 Gy/min. No discernible effect upon cell survival or transformation was observed by a lowering of the fission neutron dose rate in either exponential or plateau cultures. At the level of 2.3 x 10(-4) transformants per surviving cell, the RBE for neoplastic transformation was three at acute dose rates and ten at the lowest dose rate studied (0.005 Gy/min for neutrons and 0.01 Gy/min for X-rays).     

Bystander effect and adaptive response in C3H 10T(1/2) cells

PURPOSE: To address the relationship between the bystander effect and the adaptive response that can compete to impact on the dose-response curve at low doses. MATERIALS AND METHODS: A novel radiation apparatus, where targeted and non-targeted cells were grown in close proximity, was used to investigate these phenomena in C3H 10T(1/2) cells. It was further examined whether a bystander effect or an adaptive response could be induced by a factor(s) present in the supernatants of cells exposed to a high or low dose of X-rays, respectively. RESULTS: When non-hit cells were co-cultured for 24 h with cells irradiated with 5 Gy alpha-particles, a significant increase in both cell killing and oncogenic transformation frequency was observed. If these cells were treated with 2 cGy X-rays 5 h before co-culture with irradiated cells, approximately 95% of the bystander effect was cancelled out. A 2.5-fold decrease in the oncogenic transformation frequency was also observed. When cells were cultured in medium donated from cells exposed to 5 Gy X-rays, a significant bystander effect was observed for clonogenic survival. When cells were cultured for 5 h with supernatant from donor cells exposed to 2 cGy and were then irradiated with 4 Gy X-rays, they failed to show an increase in survival compared with cells directly irradiated with 4 Gy. However, a twofold reduction in the oncogenic transformation frequency was seen. CONCLUSIONS: An adaptive dose of X-rays cancelled out the majority of the bystander effect produced by alpha-particles. For oncogenic transformation, but not cell survival, radioadaption can occur in unirradiated cells via a transmissible factor(s).