联合检测HBV前S1抗原和核心抗原的临床意义

探讨联合检测血清HBV前s1抗原（preSl）和核心抗原（HBcAg）（均为HBV核酸相关抗原，nucleic acids related antigen，HBV NRAg）的意义及临床价值。方法：采用ELISA法对393份HBsAg、HBV DNA双阳性的血清和612份HBsAg阴性血清进行HBV NRAg检测，所有标本均采用多区段巢式PCR确认阳性、阴性，采用荧光定量PCR法进行HBV DNA定量分析。结果：393份HBsAg、HBV DNA双阳性血清中，HBV NRAg阳性为382份，其阳性率为97．2％；612份HBsAg阴性的血清标本中，609份确认为HBV DNA阴性，其中检出2份HBV NRAg阳性，607份为阴性，其HBV NRAg的阴性率为99．7％（607／609），另3份HBsAg阴性血清HBV DNA阳性者，其HBV NRAg均为阳性。结论：联合检测preSl和HBcAg的HBV NRAg可作为临床HBV感染的筛选及判断HBV复制的有意义的补充项目。     

HBV前S1抗原在乙型肝炎临床诊断中的意义

目的探讨乙型肝炎(乙肝)病毒前S1抗原在乙肝病毒感染中的临床意义。方法分析1088例HBV前S1抗原阳性结果与乙肝5项病毒学指标和HBV DNA结果的关系。结果前S1抗原阳性的乙肝5项病毒学指标结果出现6种模式,其中HBsAg、HBeAg、抗HBc阳性患者的前S1抗原阳性率为88.74%;HBsAg、抗HBe、抗HBc阳性患者前S1抗原阳性率为41.32%,2组间有显著差异(P<0.05),而HBsAg及抗HBc阳性组前S1抗原阳性率介于HBsAg、HBeAg、抗HBc阳性组与HBsAg、抗HBe、抗HBc阳性组之间。HBsAg、HBeAg、抗HBc阳性患者前S1抗原阳性率随着HBV DNA载量的升高而增加(各组间P<0.05)。HBeAg、前S1抗原与HBV DNA三者间有很好的一致性。结论检测前S1抗原是对HBsAg、HBeAg及HBV DNA检测的重要补充。在防止乙肝漏诊、误诊及了解疾病的转归等方面都具有重要的临床意义。     

乙型肝炎病毒核心抗原与前S1抗原融合蛋白诱导小鼠免疫反应的实验研究

采用基因重组技术表达了去除C末端的HBV核心抗原和前S1抗原融合蛋白,经免疫印迹试验表明其具有特异抗原反应 性[1]。进一步用该融合抗原免疫BALB/C小鼠,观察其诱导小鼠特异性体液免疫产生情况。 一、材料与方法 1.重组型HBV核心前S1融合蛋白疫苗(HBV CS1)的     

前S1蛋白与病毒DNA和核心抗原对乙型肝炎病毒复制诊断的对比

目的 分析前S1(Pre-S1)蛋白在诊断慢性乙型病毒性肝炎病毒复制中的作用。 方法 收集慢性乙型病毒性肝炎患者共104例,均经肝活组织检查证实。检测其Pre S1蛋白,HBV标志物与HBV DNA。结果 HBsAg、HBeAg、抗-HBc阳性者29例,HBV DNA与Pre-S1蛋白的检出率均达96.5％,这组患者存在病毒的高复制。HBsAg、抗-HBe和抗-HBc阳性者65例,HBV DNA与Pre-S1蛋白的检出率分别为81.5％和72.3％;HBsAg和抗-HBc阳性者8例,HBV DNA与Pre-S1蛋白的检出率分别为87.5％、75.0％,说明部分HBeAg阴性而抗-HBe阳性/阴性的患者仍存在着病毒复制。以HBV DNA定量>103拷贝/ml为诊断标准,HBV DNA阳性患者HBeAg、Pre-S1蛋白的检出率分别为31.5％(28/89)、80.9％(72/89);两者与HBV DNA的总符合率分别为40.0％(42/104)、82.0％(85/104)。HBV DNA与HBeAg检出率差异有显著性(x2=53.397,P<0.001);HBV DNA与Pre-S1蛋白检出率差异无显著性。 结论Pre-S1蛋白较HBeAg更敏感的反映了HBV复制的情况。     

动态评价联合检测乙肝病毒前S1抗原与核心抗原的临床意义

目的：探讨联合检测乙肝病毒前S1抗原和核心抗原与HBVDNA的关系以及在乙肝诊疗中的意义。方法：对100例慢性乙肝患者的346份系列血清和486例正常对照血清采用实时荧光定量PCR（FQ-PCR）进行DNA定量检测,酶联免疫吸附试验（ELISA）进行乙肝病毒前S1抗原和核心抗原的联合检测（检测结果以HBV NRAg表示）及对乙肝血清标志物进行定性检测。结果：342份HBV DNA（＋）的血清中,有338份HBV NRAg检测为阳性,灵敏度为98．8％（95％CI：0．970-0．995）,HBV NRAg特异度为99．6％（95％CI：0．985-0．999）。45例患者的系列血清HBV NRAg的OD均值随着HBVDNA拷贝数降低而下降,且具有一定的相关性（r=0．721）。其中有两位患者的血清标本出现了HBV DNA阴转。此外在46例不明原因肝功能不良患者中,发现3例HBsAg（-）,HBV DNA（＋）的慢性乙肝患者。结论：联合检测乙肝病毒前S1和HBcAg不仅能反映乙肝患者体内HBV复制情况,而且对抗病毒药物在临床的使用具有一定的指导作用。     

血清乙型肝炎病毒前S1抗原对判定HBV DNA复制的临床价值

目的通过分析HBV Pre-S1抗原与HBeAg和HBV DNA的相关性,以探讨其在诊断HBV复制的临床价值。方法采用ELISA法、荧光定量PCR法检测450例HBsAg阳性及50例健康对照血清标本的HBV Pre-S1抗原、血清HBV标志物、HBV DNA及肝功能。结果在450例HBsAg阳性血清中,HBeAg、Pre-S1抗原和HBV DNA阳性率分别为40.0%、57.3%和61.6%;Pre-S1抗原、HBV DNA阳性率在HBeAg阴性与阳性组间差异有统计学意义（x2=84.2,x2=110.7,P〈0.01）;PreS1抗原与HBeAg和HBV DNA均存在相关性（x2=86.5x,2=272.1,P〈0.01）;Pre-S1抗原阳性组AST、ALT、TBl、γ-GT均高于阴性组（P〈0.01）;当HBV DNA拷贝数的对数值〉2.7lgcopies/ml时,Pre-S1抗原诊断HBV复制的敏感度为87.7%,特异度为91.3%,准确性为89.1%,阳性预测值为94.2%,阳性似然比为10.1,优势比为75.3,而HbeAg则分别为59.2%、90.8%、71.3%、91.1%、6.43和14.2。结论 HBV Pre-S1抗原与HBeAg和HBV DNA均有较好的相关性,可作为一项新的病毒复制的指标。     

HBV前S2蛋白的研究进展

随着现代分子生物学和病毒基因工程技术的广泛应用，有关乙型肝炎病毒颗粒表面的pre S2蛋白的研究己取得了较大进展。本文综述了近年来有关研究的成果，重点对pre S2的基因结构、生物学功能及临床诊断意义等方面的进展进行讨论。     

乙型肝炎病毒前S1蛋白反式激活基因5在酵母细胞中的表达

目的：在真核生物酵母细胞中表达乙型肝炎病毒前S1蛋白反式激活基因5（PS1TP5）。方法：以HepG2细胞来源的mRNA为模板，经RT-PCR法扩增PS1TP5基因，克隆到pGEM-T载体中，并测序鉴定，酶切回收后连接到酵母表达质粒pGBKT7中，并转化酵母AH109，色氨酸缺陷型培养基（SD／-Trp）上筛选阳性菌落，提取酵母蛋白质，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）和Western免疫印迹分析，以明确PS1TP5是否可在其中表达。结果：成功扩增出PS1TP5，测序鉴定符合基因库报告序列，酶切回收的PS1TP5基因片段成功克隆人酵母表达载体pGBKT7，并转化人酵母细胞AH109中，Western免疫印迹显示该基因在酵母细胞中成功表达，表达产物相对分子质量为36950。结论：成功构建了PS1TP5酵母表达载体，并在酵母细胞中表达。     

HBeAg阴性慢性乙肝患者血清前S1抗原与HBV DNA的关系

目的通过分析HBV Pre-S1抗原与HBV DNA的关系,探讨HBeAg阴性慢性乙肝患者血清前S1抗原检测的临床价值。方法采用ELISA法、荧光定量PCR法及生化检测270例HBeAg阴性慢性乙肝患者及50例健康对照血清Pre-S1抗原、HBV DNA及肝功能,并对检查结果进行相关性分析。结果 270例HBeAg阴性血清中,Pre-S1抗原和HBV DNA阳性率分别为39.6%和41.9%,Pre-S1抗原与HBV DNA存在相关性（χ^2=187.0,P〈0.01）;Pre-S1抗原阳性组AST、ALT、TBIL、γ-GT均高于阴性组（P〈0.01）;当HBV DNA拷贝数的对数值〉2.7时,Pre-S1抗原诊断敏感度85.8%,特异度93.6%,准确性90.4%,阳性预测值90.7%,阳性似然比13.4,优势比89.1。结论 HBV Pre-S1抗原与HBV DNA、肝功能均有较好相关性,在HBeAg阴性慢性乙肝患者中,它能够敏感、准确地反映HBV的复制和肝功能状况,可作为乙肝病毒复制的一项新传染性指标。     

乙型肝炎病毒前S2基因酵母表达载体的构建及表达

目的：探讨乙型肝炎病毒（HBV）前S2蛋白的功能。方法：以质粒pCP10 (含有HBV ayw亚型全长序列)为模板，多聚酶链反应（PCR）扩增HBV前S2基因，克隆到pGEM-T载休整 ，测序鉴定、酶切后回收，与酵母表达质粒pGBKT7连接。将重组载体转化酵母细胞AH109，提取酵母蛋白质，进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western免疫印迹分析。结果：成功构建HBV前S2基因酵母表达载体，Western免疫印迹显示HBV前S2蛋白在酵母细胞中表达，表达产物在胞内存在，分子量24kD左右。结论：HBV前S2蛋白在酵母细胞中表达成功。     

乙型肝炎病毒preS1基因真核表达载体的构建及表达

目的：构建含preS1基因真核表达质粒，探讨乙型肝炎病毒preS1基因在HBV入胞机制中的作用。方法：PCR法扩增含EcoR I与Pst I酶切点的preS1基因序列，PAS2-1载体及preS1基因PCR产物双酶切，经T4DNA连接酶将两者连接并转化到大肠杆菌JM105，对重组质粒经序列测定，命名为PAS 2—1—preS1。经乙酸锂转化法将重组质粒转化入酵母茵AH109，Western Blot法证实重组质粒在酵母细胞中的表达。结果：已构建的质粒PAS2—1-preS1经序列测定合有完整的preS1基因片段，转入酵母后经Western Blot证实酵母细胞正确表达preS1-BD融合蛋白。结论：PAS2—1—preS1的构建为通过酵母双杂交体系筛选体内与preS1蛋白相互作用的preS1相关蛋白，为进一步深入探讨preS1在HBV致病机制中的作用奠定了基础。     

Expression and purification of the complete PreS region of hepatitis B Virus

AIM: To express the complete PreS region of HBV in E.coli with good solubility and stability, and to establish an effective method for purification of the recombinant PreS protein. METHODS: The complete PreS region (PreS1 and PreS2) was fused into a series of tags including glutathione S-transferase (GST), dihydrofolate reductase (DHFR), maltose binding protein (MBP), 6× histidine, chitin binding domain (CBD), and thioredoxin, respectively. Expression of recombinant PreS fusion proteins was examined by SDS-PAGE analysis and confirmed by Western blot. Two fusion proteins, thio-PreS, and PreS-CBD, with desirable solubility and stability, were subjected to affinity purification and further characterization. RESULTS: Recombinant PreS fusion proteins could be synthesized with good yields in E.coli. However, most of these proteins except for thio-PreS and PreS-CBD were vulnerable to degradation or insoluble as revealed by SDS-PAGE and Western blot. Thio-PreS could be purified by affinity chromatography with nickel-chelating sepharose as the matrix. However, some impurities were also co-purified. A simple freeze-thaw treatment yielded most of the thio-PreS proteins in solution while the impurities were in the precipitate. Purified thio-PreS protein was capable of inhibiting the binding of HBV virion to a specific monoclonal antibody against an epitope within the PreS1 domain. CONCLUSION: Increased solubility and stability of the complete PreS region synthesized in E.coli can be achieved by fusion with the thioredoxin or the CBD tag. A simple yet highly effective method has been established for the purification of the thio-PreS protein. Purified thio-PreS protein likely assumes a native conformation, which makes it an ideal candidate for studying the structure of the PreS region as well as for screening antivirals.     

慢性乙型肝炎患者血清前S1抗原检测的意义

目的探讨PreS1抗原检测的临床价值。方法采用酶联免疫吸附试验法检测421例慢性乙型肝炎患者血清PreS1抗原和HBV标记物;采用荧光定量PCR法检测HBVDNA。结果在421例慢性乙型肝炎患者中,HBVDNA阳性者367例,其中PreS1Ag阳性者188例(51.2%),HBeAg阳性者119例(32.4%),后两者有显著性差异(P0.01);在高HBVDNA载量(105～107copies/ml和107copies/ml)组患者中,PreS1Ag阳性率(60.2%,60.0%)显著高于HBVDNA阴性组(33.3%)和低载量(103～105copies/ml)组(41.9%,P0.01);但在421例患者中,PreS1Ag阳性率(48.9%)低于HBVDNA(87.2%,P0.01)。结论 PreS1Ag能够较HBeAg更好地反映HBV在体内的复制状态,但尚不能代替HBVDNA的检测。     

慢性乙型肝炎病毒感染者前S1抗原和抗体检测的临床意义

目的 探讨前S1抗原(PreS1Ag)与前S1抗体（抗-PreS1）在慢性HBV感染者中的检出情况及其临床意义。方法 收集慢性HBV感染者428例,检测HBV血清学标志物、HBV DNA及PreS1Ag、抗-PreS1,分析PreS1Ag、抗-PreS1在慢性HBV感染不同转归人群[即e抗原阳性慢性乙型肝炎(CHB)组、e抗原阴性CHB组、非活动性HBsAg携带组、HBsAg血清学转换组]的检出情况及临床意义;同时分析PreS1Ag、抗-PreS1与HBV标志物、HBV DNA的关系。用SPSS13.0软件进行统计学处理。计数资料采用四格表或配对x2检验,计量资料采用独立样本t检验或秩和检验进行数据分析。结果 PreS1Ag阳性率e抗原阳性CHB组为95.7％(67/70)、e抗原阴性CHB组为82.8％ (24/29)、非活动性HBsAg携带组为13.2％(7/53)、HBsAg转换组为2.2％ (1/46),四组人群PreS1Ag阳性率依次下降,x2=141.7,P＜0.05,总体比较差异有统计学意义,可见PreS1Ag阳性率随病毒复制活跃程度下降而降低。抗-PreS1在四组间检出率差异无统计学意义。将HBsAg阳性的前三组（即e抗原阳性CHB组、e抗原阴性CHB组、非活动性HBsAg携带组）合并为一组,再与HBsAg血清学转换组比较,抗-PreS1阳性率分别为0.9％(14/152)和23.9％0 (14/46),x2 =6.919,P＜0.05,差异有统计学意义。PreSl Ag的吸光度值的平均秩次在高复制组为179.30,低复制组为133.80,高复制组明显高于低复制组,Z=-3.86,P＜0.05,差异有统计学意义;虽两组抗-PreS1的吸光度值平均秩次差异无统计学意义,但低复制组(23.86)较高复制组(21.08)有升高趋势。通过配对计数X2检验分析抗-HBs与抗-PreS1的吻合性,x2=0.262,P＞0.05,两者检出率差异无统计学意义。血清PreS1Ag、HBeAg、肝组织内HBcAg与HBV DNA有关联性,x2值分别为33.840、24.159、4.854,P值均＜0.05。血清PreS1Ag与HBV DNA的关联程度(r=0.628)高于HBeAg(r=0.563)。 结论PreS1Ag较HBeAg更敏感的反映了HBV复制的情况,抗-PreS1可能参与了HBV的清除,预示着慢性乙型肝炎的恢复。     

乙型肝炎病毒PreS1抗原含量分析的临床应用

近年的研究结果显示,HBV前S1(PreS1)抗原在乙型肝炎发病机制、HBV感染与复制等方面具有重要临床意义.     

乙型肝炎病毒前-S1蛋白反式激活蛋白3基因的克隆化研究

目的应用抑制性消减杂交技术(SSH)及生物信息学技术(bioinformatics)筛选并克隆乙型肝炎病毒(HBV)前-S1蛋白(Pre-S1)反式激活新型靶基因，进一步阐明HBV感染相关疾病的发病机制。方法以HBV前-S1蛋白表达质粒pcDNA3．1(-)-PreS1转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照，提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。并应用分子生物学技术，结合生物信息学技术，克隆HBV前-S1反式激活作用的新的靶基因。结果对于所获基因片段序列分析表明，其中之一为新型基因片段。从HepG2细胞提取总RNA，以逆转录多聚酶链反应(RT—PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列，并测序证实，因其可以被前-S1蛋白反式激活，故命名为前-S1反式激活蛋白3(PSITP3)，已在GenBank中注册，注册号：AY446274。PSITP3基因的编码序列全长为1173个核苷酸(nt)，编码产物由390个氨基酸残基(aa)组成。结论HBV前-S1蛋白在HBV进入宿主细胞的过程中起着重要的作用，最近的研究表明前-S1蛋白还具有反式激活的作用，上调宿主细胞某些基因的表达，从而改变宿主正常的免疫应答水平，引起病变。HBV前-S1反式激活新靶基因的发现，为进一步研究HBV前-S1蛋白的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础。     

母婴传播后母子体内乙型肝炎病毒前S/S基因变异研究

目的 通过经母婴传播获得乙型肝炎病毒(HBV)感染的慢性无症状乙型肝炎表面抗原携带者(ASC)母子体内HBV PreS/S基因序列研究,了解来源相同的HBV在不同程度病毒血症情况下PreS/S基因变异的特点。方法 选择15对母孕前为HBV感染、未接种过乙型肝炎疫苗且均未使用过抗HBV药物的ASC母子。应用T-A克隆技术构建重组质粒pGEM-PreS/S、双酶切进行鉴定,每个患者选2个酶切鉴定正确的克隆测序并进行分析。结果 选择15对ASC母子,根据HBV病毒血症高低分为3组,每组5对,A组母子均为高病毒血症,B组子女为高病毒血症、母亲为低病毒血症,C组子女为低病毒血症、母亲为高病毒血症。高病毒血症患者均为乙型肝炎e抗原( ),低病毒血症均为抗-HBe( )。母子HBV亚型相同,各组中有4/5对母子为B/adw2、1/5对母子为C/adrq 亚型。对每组中B/adw2亚型HBV患者的PreS/S基因进行分析显示:高病毒血症组间或低病毒血症组间HBV PreS/S基因变异数目及位点差异均无显著性,变异与年龄无关,低病毒血症患者变异数目及位点明显高于高病毒血症患者。两个低病毒血症组PreS/S基因绝大多数变异位点相同(113个),其中变异热点85个、可引起37个氨基酸变异,这些变异的氨基酸大多位于免疫表位内或(和)其附近。结论 HBV变异可能与感染的时间长短无关;在发生乙型肝     

乙型肝炎病毒X蛋白上调白细胞介素-18基因的表达

目的:了解乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)与白细胞介素-18(IL-18)基因表达的关系,研究HBxAg在HBV致病的分子生物学机制中的作用.方法:聚合酶链反应(PCR)扩增人IL-18基因启动子DNA,命名为IL-18P.以T-A克隆法,将IL-18P基因片段连入载体pGEM-T.将获得的质粒pGEM-T-IL-18P,与报告质粒pCAT3-basic分别用KpnⅠ和BglⅡ双酶切后构建IL-18启动子报告基因表达载体pCAT3-IL-18P,以重组表达质粒pCAT3-IL-18P和HBxAg表达载体pcDNA-HBxAg瞬时转染HepG2细胞,以转染pCAT3 basic的HepG2细胞为阴性对照,48小时后收获细胞.用酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞中氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性,以了解乙型肝炎病毒X蛋白对IL-18基因表达的影响.结果:构建的报告基因表达载体pCAT3-IL-18P经过序列分析和酶切鉴定正确.真核表达载体pcDNA3.1(阴性)-X和pCAT3-IL-18P共转染的HepG2细胞的CAT表达活性是pCAT3空载体的6.2倍,是pCAT3-IL-18P的1.17倍.结论:乙型肝炎病毒X蛋白可上调IL-18启动子的转录活性,促进IL-18基因表达.     

Enhanced-Transient Expression of Hepatitis C Virus Core Protein in Nicotiana tabacum,a Protein With Potential Clinical Applications

Background:

Hepatitis C virus (HCV) is major cause of liver cirrhosis in humans. HCV capsid (core) protein (HCVcp) is a highly demanded antigen for various diagnostic, immunization and pathogenesis studies. Plants are considered as an expression system for producing safe and inexpensive biopharmaceutical proteins. Although invention of transgenic (stable) tobacco plants expressing HCVcp with proper antigenic properties was recently reported, no data for “transient-expression” that is currently the method of choice for rapid, simple and lower-priced protein expression in plants is available for HCVcp.

Objectives:

The purpose of this study was to design a highly codon-optimized HCVcp gene for construction of an efficient transient-plant expression system for production of HCVcp with proper antigenic properties in a regional tobacco plant (Iranian Jafarabadi-cultivar) by evaluation of different classes of vectors and suppression of gene-silencing in tobacco.

Materials and Methods:

A codon-optimized gene encoding the Kozak sequence, 6xHis-tag, HCVcp (1-122) and KDEL peptide in tandem (from N- to C-terminal) was designed and inserted into potato virus-X (PVX) and classic pBI121 binary vectors in separate cloning reactions. The resulted recombinant plasmids were transferred into Agrobacterium tumefaciens and vacuum infiltrated into tobacco leaves. The effect of gene silencing suppressor P19 protein derived from tomato bushy stunt virus on the expression yield of HCVcp by each construct was also evaluated by co-infiltration in separate groups. The expressed HCVcp was evaluated by dot and western blotting and ELISA assays.

Results:

The codon-optimized gene had an increased adaptation index value (from 0.65 to 0.85) and reduced GC content (from 62.62 to 51.05) in tobacco and removed the possible deleterious effect of “GGTAAG” splice site in native HCVcp. Blotting assays via specific antibodies confirmed the expression of the 15 kDa HCVcp. The expression level of HCVcp was enhanced by 4-5 times in P19 co-agroinfiltrated plants with better outcomes for PVX, compared to pBI121 vector (0.022% versus 0.019% of the total soluble protein). The plant-derived HCVcp (pHCVcp) could properly identify the HCVcp antibody in HCV-infected human sera compared to Escherichia coli-derived HCVcp (eHCVcp), indicating its potential for diagnostic/immunization applications.

Conclusions:

By employment of gene optimization strategies, use of viral-based vectors and suppression of plant-derived gene silencing effect, efficient transient expression of HCVcp in tobacco with proper antigenic properties could be possible.