人β2m转基因小鼠的制备、筛选及鉴定

目的:制备人β2m转基因小鼠,研究HLA-B2704的表达.方法:应用显微注射将人β2m基因注入C57BL/6×昆明鼠和昆明鼠×昆明鼠F1代受精卵,出生动物及其后代经PCR筛选,采用斑点杂交和Southern杂交对阳性鼠基因组DNA标本行进一步鉴定和测定整合拷贝数,利用RT-PCR检测阳性鼠中人β2m转基因的表达.结果:6只原代仔鼠及7只它们的下一代(F1)带有人β2m基因.由微注射基因后移卵出生的86只小鼠中,C57BL/6×昆明鼠杂交仔鼠35只,其中4只阳性(11.4%),昆明鼠×昆明鼠杂交仔鼠51只,其中2只阳性(3.9%),含有人β2m基因的原代鼠×昆明鼠杂交仔鼠20只,其中7只阳性.整合的转基因均为单拷贝.Southern杂交证实上述阳性鼠确有转基因整合.阳性鼠的皮肤、结肠、睾丸和脾脏组织中均有人β2m转基因mRNA的表达.结论:在转基因动物制备中,C57BL/6×昆明鼠F1代明显优于昆明鼠×昆明鼠F1代.与人HLA-B2704基因相比,人β2m基因不易整合,其整合率与整合拷贝数均较低.得到的人β2m转基因小鼠能够将人β2m基因传给下一代并可与人HLA-B2704转基因鼠交配.     

相对定量法检测nestin-GFP转基因小鼠外源基因整合拷贝数

目的计算出转基因小鼠nestin-GFP的外源基因整合拷贝数,为研究该模型中外源基因遗传及表达的稳定性打下基础。方法用荧光定量PCR的方法对F0代的2只小鼠基因组做检测。先根据已知拷贝数的GFP(green fluorescent protein)和GAPDH来制作标准曲线和方程,然后计算出基因组中二者所含拷贝数的比例来计算外源基因的拷贝数。结果 2只F0的外源基因拷贝数分别是3和4。结论 nestin-GFP转基因小鼠的外源基因整合拷贝数分别是3和4。     

C基因型HBV转基因小鼠的制备

目的: 建立C型HBV转基因小鼠,为乙肝防治研究提供实验动物模型.方法: 采用受精卵显微注射法,制备HBV转基因小鼠,用PCR,ELISA,荧光定量PCR和免疫组化的方法研究HBV基因在转基因小鼠体内的整合、复制和表达情况.结果: 注射受精卵2840枚,筛选注射后成活的受精卵共2256枚,注射成活率79.4%.注射后受精卵共移植假孕雌鼠85只,其中有42只怀孕,假孕雌鼠妊娠率49%,共产下F0代小鼠168只,PCR检测共有14只小鼠阳性,其中ELISA检测血清HBsAg阳性5只,HBeAg均阴性.荧光定量PCR血清HBV DNA显示,2只小鼠的拷贝数分别为3.12×105copies/L,1.98×105copies/L,经传代产下F1代小鼠61只,PCR检测HBV DNA阳性5只,ELISA检测HBsAg阳性4只,其中肝脏HBsAg免疫组化阳性2只,HBcAg均阴性,且肝组织表达HBsAg为胞浆型.结论: 构建的C型HBV基因不但可以在转基因小鼠体内进行复制表达,而且可以遗传给下一代小鼠.     

2型重组腺相关病毒介导的β-地中海贫血基因治疗实验

目的探讨2型重组腺相关病毒(rAAV2)能否有效转染重型β-地中海贫血患者造血细胞,通过体外途径基因治疗地中海贫血。方法 6只BALB/c裸小鼠分为转染组(n=4)和未转染组(n=2),经X射线照射后,分别移植入经rAAV2β-珠蛋白病毒转染(MOI=50)或未转染的β41-42/β654杂合子型重型β-地中海贫血流产胎儿造血细胞,转染后第28天和第70天分别处死rAAV2转染小鼠(n=2)和未转染受体小鼠(n=1)。采用RT-PCR、等位基因特异性PCR(ASPCR)法检测rAAV2介导的人β-珠蛋白基因在小鼠骨髓中的表达,并以高压液相色谱法量化分析受体小鼠外周血中人β-珠蛋白肽链的水平。结果①RT-PCR于所有受体小鼠样本中均可检测到人β-actin和人β-珠蛋白基因的表达。②ASPCR检测中,β41-42突变基因稳定表达于所有受体小鼠,β654突变基因仅在移植后第70天受体小鼠样本中被检测到;移植后第28天,rAAV2转染及未转染小鼠体内均可检测到主要来自于β654突变基因的正常β-珠蛋白基因表达;但至移植后第70天,仅rAAV2转染小鼠骨髓样本中仍可检测到rAAV2-β-globin载体介导的正常β-...     

血管内皮细胞组织特异性表达人CD59基因转基因小鼠传代及表达检测

探讨外源基因在转基因动物中的遗传规律。方法：将血管内皮细胞组织特异性表达人CD59基因转基因昆明种雄性小鼠，与普通昆明种雌性小鼠交配。Southern-blot杂交确定子一代外源基因整合阳性转基因小鼠。RT-PCR方法用于子一代转基因小鼠人CD59转录水平筛选。以流式细胞术检测人CD59基因在子一代转基因小鼠蛋白质水平表达。结果：产子14只。7只外源基因整合阳性，其中雄性4只，雌性3只。转录水平检测发现3只出现所需的条带。继而对上述3只转录水平阳性的F1代小鼠白细胞行流式细胞术检测，白细胞膜表面人CD59表达均阳性。结论：转基因动物的遗传规律复杂，基因沉默可能是导致子代转基因动物不表达的重要因素。     

实时荧光定量PCR法检测转基因小鼠拷贝数

目的利用实时荧光定量PCR法鉴定转基因小鼠外源基因插入拷贝数。方法以TG-CARK转基因首见鼠为研究对象,选取小鼠的高度保守基因Fabpi为内参,利用绝对定量的实时荧光PCR法鉴定转基因小鼠拷贝数,并与传统的Southern blot方法的定量结果进行比较。结果实时定量PCR鉴定的转基因拷贝数与Southernblot法完全一致,三只TG-CARK首见小鼠的拷贝数分别为1,7,45。结论实时定量PCR技术具有高准确性、高稳定性、高通量和低成本的优点,是比传统杂交技术更好的鉴定小鼠转基因拷贝数的方法。     

人β地中海贫血β~(41-42(-CTTT))转基因小鼠的构建

目的建立可表达人类βCD41-42(-CTTT)基因的转基因小鼠。方法采用Gateway技术,将人类βCD41-42(-CTTT)基因克隆到真核表达载体p RP.Des2d-EF1A中,重组质粒通过PCR技术和测序方法进行验证。采用显微注射法将线性化的重组质粒注射至FVB小鼠受精卵的雄性原核中,然后将受精卵植入假孕母鼠的子宫。采用PCR技术筛选出整合了外源基因的小鼠,实时荧光定量PCR验证βCD41-42(-CTTT)基因的表达。结果成功构建了真核表达载体p RP.Des2dEF1A-βCD41-42(-CTTT)。在出生的24只新生鼠中,共获得5只阳性转基因首建小鼠。结论建立了人βCD41-42(-CTTT)基因的转基因小鼠模型,为β地贫的基因治疗研究奠定了基础。     

GLUT4-Cre转基因模型建立与Cre酶特异性表达

目的建立骨骼肌和脂肪组织特异性表达Cre重组酶基因的转基因小鼠,以期在上述组织细胞中实现相关基因的条件性剔除.方法选择人葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)基因的启动子驱动Cre重组酶的特异性表达,利用基因重组技术,构建GLUT4-Cre转基因表达质粒.通过显微注射法将该质粒导入小鼠受精卵细胞核,获得的新生鼠经PCR和Southern杂交方法进行基因型的分析鉴定,常规方法培育、传代转基因鼠.用RT-PCR和免疫组化法对Cre酶在阳性转基因鼠体内mRNA和蛋白表达水平进行检测.结果获得5只阳性转基因首建鼠,其中3只已建系并稳定传代.在脑、脂肪组织中检测到Cre基因表达,而心肌、骨骼肌及肝脏组织中未检出转基因表达.结论成功构建了在脑、脂肪组织中特异性表达Cre的转基因鼠,为研究与2型糖尿病、胰岛素抵抗等相关的条件性基因剔除小鼠模型的建立奠定了基础.     

荧光定量RT-PCR检测OATP-E基因表达

目的：建立荧光定量RT-PCR检测肿瘤细胞有机阴离子转运多肽E(organic anion transporting polypeptide-E,OATP-E)mRNA的方法，了解乳腺癌细胞株MCF-7和对阿霉素耐药的乳腺癌细胞株MCF-7/ADR中OATP-E mRNA的表达水平。方法：构建重组质粒，绘制荧光定量RT-PCR检测OATP-E mRNA的标准曲线，并运用此方法检测MCF-7/ADR和MCF-7细胞株中OATP-E mRNA的表达。结果：荧光定量RT-PCR检测MCF-7和MCF-7/ADR细胞OATP-E的基因表达，重复10次实验所得结果平均分别为5.47×105拷贝数/μg RNA和2.82×104拷贝数/μg RNA，两者相差约19.4倍，P＜0.05。结论：成功建立了荧光定量RT-PCR检测OATP-E基因表达的方法，检测结果用绝对拷贝数表示，定量准确可靠，并有利于标准的统一。初步应用发现乳腺癌耐药株MCF-7/ADR中OATP-E mRNA的表达量比不耐药株MCF-7减少。     

实时荧光定量分析SK-N-SH细胞中β-actin mRNA的半衰期

目的:探讨和分析SK-N-SH细胞中β-actin mRNA的半衰期.方法:建立包含β-actin基因片断的pMD-T载体的梯度稀释曲线,应用VIC标记的Taqman-MGB探针进行检测,用Opticon2.02软件分析结果.以不同浓度和不同时间的放线菌素D阻断SK-N-SH细胞转录,提取总RNA并予荧光定量RT-PCR检测β-actin mRNA.结果:SK-N-SH细胞中β-actin mRNA的半衰期为4 h.与未处理组相比,4 h组β-actin的拷贝数差异有显著性(P＜0.05),12 h和24 h组β-actin拷贝数差异有极显著性(P＜0.01).不同浓度之间放线菌素D对β-actin拷贝数的影响差异不大(P＞0.05).结论:应用实时荧光定量RT-PCR,通过比较mRNA与总RNA的拷贝数,建立了一种准确方便地检测mRNA衰减的方法.同时β-actin不适合做放线菌素D处理实验中的内参照.     

采用CRISPR/Cas9技术构建新品系HBeAg转基因小鼠

目的培育一种HBeAg转基因小鼠新品系。方法克隆乙型肝炎病毒HBeAg基因;采用CRISPR/Cas9技术,通过同源重 组的方式分别在Rosa26基因位点定点插入pliver-HBeAg表达框,获得含有HBeAg基因的表达载体pliver-HBeAg,经酶切得到 含有HBeAg基因的线性DNA 片段,将Cas9 mRNA、gRNA和donor vector显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中,再将其移植 入C57BL/6J雌性代孕小鼠子宫,获得F0代建系小鼠;采用长片段PCR对出生小鼠进行鉴定,共获得HBeAg基因正确同源重组 的F0代建系小鼠;F0代阳性小鼠与野生型C57BL/6J小鼠交配,繁育获得F1代小鼠,经PCR鉴定及测序确认阳性F1代小鼠;将 携带HBeAg基因的F1代转基因小鼠再次回交,对子代小鼠进行PCR基因型鉴定,直至获得纯合子子代转基因小鼠;采用全自 动化学发光免疫分析仪、胶体金法和免疫组织化学方法分别检测HBeAg转基因鼠血浆和肝组织中HBeAg和HBeAb的表达。 结果采用CRISPR/Cas9技术共获得56只F0代小鼠,其中2只为正确同源重组的F0代小鼠;F1代小鼠中6只阳性F1代小鼠。 截至目前,共获得22只F2代纯合子和29只杂合子HBeAg转基因小鼠。所有HBeAg转基因小鼠外周血中均可检出高浓度的 HBeAg蛋白,但未检出HBeAb的表达。而且免疫组化结果显示HBeAg转基因小鼠肝脏肝细胞中可特异性表达HBeAg蛋白。 结论采用CRISPR/Cas9技术成功构建了能在肝脏肝细胞中稳定表达HBeAg蛋白且对HBeAg免疫耐受的新品系HBeAg转基 因小鼠,为HBV的研究提供了新的实验动物模型。     

瞬时受体电位通道家族M8型受体转基因小鼠模型的建立

目的 建立瞬时受体电住通道家族M8型受体(TRPM8)转基因小鼠模型.方法 通过显微注射法将pcDNA3.1-hTrpm8导入C57BL/6J×CBA F1小鼠的受精卵中,并将其移植到假孕母鼠输卵管中获得子代小鼠.采用PCR方法鉴定子代基因型,通过RT-PCR和免疲印迹法检测Trpm8基因及蛋白在组织中的表达.结果 将405枚注射受精卵移植给15只假孕鼠,其中13只顺利妊娠并产下95只子鼠,经PCR鉴定得到5只转基因阳性首建鼠,其中4只小鼠可稳定传代,经与C57BL/6J小鼠回交7代后互交数代建系.子代转基因小鼠经RT-PCR检测发现Trpm8基因在心脏、肝脏、肾脏、脂肪和骨骼肌中均有表达,且TRPM8蛋白表达在转基因小鼠中显著增加.结论 通过显微注射法成功建立了Trpm8转基因小鼠模型.     

GLUT4-Cre转基因模型建立与Cre酶特异性表达

目的：建立骨骼肌和脂肪组织特异性表达Cre重组酶基因的转基因小鼠，以期在上述组织细胞中实现相关基因的条件性剔除。方法：选择人葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)基因的启动子驱动Cre重组酶的特异性表达，利用基因重组技术，构建GLUT4-Cre转基因表达质粒。通过显微注射法将该质粒导入小鼠受精卵细胞核，获得的新生鼠经PCR和Southern杂交方法进行基因型的分析鉴定，常规方法培育、传代转基因鼠。用RT-PCR和免疫组化法对Cre酶在阳性转基因鼠体内mRNA和蛋白表达水平进行检测。结果：获得5只阳性转基因首建鼠，其中3只已建系并稳定传代。在脑、脂肪组织中检测到Cre基因表达，而心肌、骨骼肌及肝脏组织中未检出转基因表达。结论：成功构建了在脑、脂肪组织中特异性表达Cre的转基因鼠，为研究与2型糖尿病、胰岛素抵抗等相关的条件性基因剔除小鼠模型的建立奠定了基础。     

共刺激分子配体B7-DC转基因小鼠模型的建立

目的建立共刺激分子配体B7-DC转基因小鼠模型。方法利用RT-PCR方法从来自小鼠胸腺的mRNA中扩增出B7-DC cDNA,继而将B7-DC基因插入到真核表达载体PEF6/V5-His中得到含B7-DC和V5-His融合蛋白的PEF6-B7-DC/V5-His。注射外源基因PEF6-B7-DC/V5-His至FVB小鼠原核,注射胚胎移植到同期发情的假孕受体,所生仔鼠经PCR和Southem-blot检测获得阳性转基因小鼠。结果共注射移植胚胎87枚,出生小鼠39只,检测出阳性小鼠3只,并稳定遗传至F2代。结论成功建立了B7-DC转基因小鼠模型。     

用荧光定量RT-PCR检测鼻咽癌病人外周血CK-19 mRNA的表达

【目的】探讨鼻咽癌病人外周血中CK-19mRNA表达与鼻咽癌临床的关系。【方法】用荧光定量RT-PCR方法检测97例鼻咽癌病人及26例正常人外周血中CK-19 mRNA的表达量。【结果】鼻咽癌病人外周血中CK-19mRNA阳性表达94％(91／97)，健康对照组阳性表达8％(2／26)；T4期病人及远处转移病人外周血中CK-19mRNA拷贝数显著升高，CK-19mRNA拷贝数与鼻咽癌临床分期呈正相关。【结论】荧光定量RT-PCR方法检测鼻咽癌病人外周血CK-19mRNA表达，方法简单、准确，在预测鼻咽癌远处转移及准确临床分期方面有一定可行性。     

用荧光定量RT-PCR检测鼻咽癌病人外周血CK-19mRNA的表达

【目的】探讨鼻咽癌病人外周血中CK-19 mRNA表达与鼻咽癌临床的关系。【方法】用荧光定量RT-PCR方法检测97例鼻咽癌病人及26例正常人外周血中CK-19 mRNA的表达量。【结果】鼻咽癌病人外周血中CK-19 mRNA阳性表达94％(91/97),健康对照组阳性表达8％(2/26);T4期病人及远处转移病人外周血中CK-19 mRNA拷贝数显著升高,CK-19 mRNA拷贝数与鼻咽癌临床分期呈正相关。【结论】荧光定量RT-PCR方法检测鼻咽癌病人外周血CK-19 mRNA表达,方法简单、准确,在预测鼻咽癌远处转移及准确临床分期方面有一定可行性。     

荧光定量反转录PCR检测新生儿脐血ξ珠蛋白mRNA的转录水平

目的运用荧光定量反转录PCR技术,检测新生儿脐血ξ珠蛋白mRNA的转录水平。方法以基因型为（αα/αα）的新生儿作为正常对照组,基因型为（--／αα）的新生儿为病例组。选择β肌动蛋白基因为校正基因,ξ珠蛋白基因为目的基因。运用双标准曲线法检测两组新生儿脐血的ξ珠蛋白mRNA的转录水平。结果病例组的ξ珠蛋白mRNA的平均转录水平明显增高。结论通过荧光定量反转录PCR技术能够检测出基因型为（--SEA／αα）的新生儿的ξ珠蛋白mRNA转录水平的增高,具有较好的诊断价值。     

Preparation of lentivirus-mediated HLA-G transgenic mice

[目的]以慢病毒作为载体建立HLA-G转基因小鼠,为研究HLA-G与移植免疫提供模型动物.[方法]利用FUW载体,构建含有HLA-G编码序列的慢病毒表达载体FUW-HLA-G.用磷酸钙沉淀法将包装质粒psPAX2、PMD2.G与重组慢病毒载体质粒FUW-HLA-G共转染293FT细胞,包装成慢病毒.通过同步转染含有绿色荧光标记基因的慢病毒质粒FUGW为参照,测定FUW-HLA-G病毒液的滴度.用显微注射法将浓缩后的病毒液注射至FVB/N小鼠1-细胞期胚胎透明带下,建立HLA-G转基因小鼠.PCR鉴定转基因小鼠的基因整合,用RT-PCR检测转基因在转录水平的表达,用Western blot检测HLA-G蛋白的表达.[结果]载体BamH I、EcoR I双酶切结果和测序结果显示重组的慢病毒质粒与所设计的序列一致.浓缩和纯化后的病毒液滴度达到109TU/ml以上,符合用慢病毒制备转基因小鼠的要求.PCR筛选出阳性鼠6只,RT-PCR与Western blot检测结果表明HLA-G基因在F0和F1代转基因小鼠中均有表达.[结论]通过慢病毒介导的基因转移,成功建立了表达人HLA-G蛋白的转基因小鼠,为研究HLA-G的功能及其在器官或组织移植中的效应提供了动物模型.     

人β-珠蛋白小分子RNAs调控γ-珠蛋白基因表达及开关机制研究

目的从RNA角度研究珠蛋白基因表达调控,探讨人γ-珠蛋白向β-珠蛋白转换的分子机制,为β-珠蛋白生成障碍性贫血的分子治疗提供新靶位,并为诱导肿瘤细胞分化治疗肿瘤提供依据。方法通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)比较白血病和非白血病患者外周血白细胞血红蛋白基因分子水平的差异,将β-珠蛋白基因转染K562细胞,运用噻唑蓝比色法、细胞流式分选等技术检测β-珠蛋白基因对K562细胞增殖、细胞周期与凋亡的影响,通过Western blot及RT-PCR分别从蛋白质水平和mRNA水平分析其调控γ-珠蛋白基因表达的作用,同时运用生物信息学预测人β-珠蛋白基因可以产生具有基因表达调控作用的小分子RNAs。结果白血病患者血红蛋白A1、血红蛋白B、血红蛋白E1、细胞珠蛋白、脑红蛋白的mRNA表达均显著低于非白血病患者(P<0.05)。β-珠蛋白基因能以时间依赖的方式诱导K562细胞增殖受抑,并在第7天达到最佳时间效应。用RT-PCR检测转染后K562细胞α、β、γ-珠蛋白等mRNA的表达,发现β-mRNA上升导致转染后的K562细胞γ-珠蛋白表达下调,同时α-珠蛋白表达上调;β-珠蛋白基因可能产生作用于γ-珠蛋白的小分子RNA,符合条件的二级结构在热力学上稳定,空间位阻也在一定范围内。结论白血病患者外周血白细胞珠蛋白基因低表达,β-珠蛋白基因能以时间依赖的方式诱导K562细胞增殖受抑,其高表达可诱导K562细胞增殖受抑和凋亡,并抑制K562细胞γ基因表达,通过小分子RNAs调控γ-珠蛋白基因表达沉默,有助于揭示人γ-珠蛋白向β-珠蛋白转换的基因表达调控及开关机制。     

荧光定量反转录PCR检测新生儿脐血ζ珠蛋白mRNA的转录水平

目的 运用荧光定量反转录PCR技术,检测新生儿脐血ζ珠蛋白mRNA的转录水平。方法 以基因型为（αα/αα）的新生儿作为正常对照组,基因型为（――/αα）的新生儿为病例组。选择β肌动蛋白基因为校正基因,ζ珠蛋白基因为目的基因。运用双标准曲线法检测两组新生儿脐血的ζ珠蛋白mRNA的转录水平。结果 病例组的ζ珠蛋白mRNA的平均转录水平明显增高。结论 通过荧光定量反转录PCR技术能够检测出基因型为（――SEA/αα）的新生儿的ζ珠蛋白mRNA转录水平的增高,具有较好的诊断价值。