兔羊膜成体干细胞培养及体外定向诱导神经细胞分化

目的 观察体外分离、培养的兔羊膜成体干细胞(ADSC)定向诱导神经细胞的分化结果.方法 新西兰雌兔羊膜分离、培养ADSC.实时定量聚合酶链反应(PCR)检测羊膜ADSC的纤连蛋白(Fibronectin)、巢蛋白(Nestin)、波形蛋白(Vimentin) mRNA的表达水平.单克隆形成实验证实羊膜ADSC是否具有自我复制能力.培养成功的ADSC中加入神经分化诱导培养基诱导神经细胞分化.诱导分化5d后,免疫荧光染色检测β-微管蛋白(tubulin)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达.结果 培养的ADSC在24 h后逐渐从羊膜组织中移行出;72 h可见明显的多角形细胞富集在羊膜组织周边;120 h后多角形细胞致密地分布于羊膜四周.分裂后的子代细胞形态同父代细胞.单克隆形成实验结果证实羊膜ADSC具有自我复制能力.实时定量PCR检测结果显示,羊膜ADSC的Nestin、Vimentin、Fibronectin mRNA分别是脾脏细胞同种分子表达量的15.79、1.91、7.65倍,两者差异有统计学意义(Z=-5.243、-3.972、-2.524,P＜0.05).免疫荧光染色结果显示,β-tubulin在大部分细胞的胞质中表达;GFAP在部分细胞的细胞质中表达.结论 羊膜ADSC具有自我复制能力,在合适条件下能够分化成神经元和神经胶质细胞.     

人重组表皮生长因子和牛磺酸体外诱导人脐血干细胞分化为神经元样细胞

目的 探讨人重组表皮生长因子(rhEGF)和牛磺酸体外诱导人脐血间充质干细胞(MSC)分化为神经元样细胞的实验条件和可能机制.方法 用含有105U/L青霉素、100 mg/L链霉素、10%胎牛血清(FBS)、5%自体血浆、4 mmol/L-谷氨酰胺、30 ng/ml rhEGF的Dulbeceo改良Eagle培养基与F12以1:1混合(DMEM/F-12)培养液对人脐血MSC进行原代培养,传至第3代后改用含牛磺酸的培养基进行诱导.流式细胞仪检测细胞表面抗原CD90、CD29、CD34、CD44及CD45的表达.免疫细胞化学方法观察神经元特异性烯醇化酶(NSE)、视紫红质、巢蛋白的阳性细胞表达情况.统计学方法采用两组资料的卡方检验分析NSE、视察红质、巢蛋白的表达.结果 脐血MSC首次培养5～7 d,有间充质样细胞贴壁,3～4周后细胞达80%～90%融合,传代后生长加速;形态学类似骨髓源性MSC.脐血MSC均一稳定地表达MSC的相关抗原CD29、CD44、CD90,不表达CD34、CD45.经牛磺酸体外诱导后的脐血MSC中,3120个细胞中有2515个细胞表达神经元特异性烯醇化酶(NSE),3050个细胞中有903个细胞表达巢蛋白,3175个细胞中有1168个细胞表达视紫红质;未诱导组的2965个脐血MSC中仅有234个细胞表达NSE,其他抗原未见表达.两组间NSE、巢蛋白和视紫红质的表达差异具有统计学意义(χ2=3 242.9,1 073.0,1 444.5;P值均<0.01).结论 人脐血MSC经rhEGF和牛磺酸诱导后能使部分MSC向神经元样细胞或视紫红质阳性细胞分化.     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向视网膜色素上皮细胞分化的可行性研究

目的 探讨体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(rMSCs)向视网膜色素上皮(RPE)细胞分化的可行性.方法 采用贴壁筛选法分离、培养Brown-Norway(BN)rMSCs.将反复冻融制成的BN大鼠RPE细胞裂解液加入到rMSCs培养体系中,鉴定被诱导的细胞是否同时表达RPE细胞的特征性标记物细胞角蛋白(CK)与S-100.结果 经RPE细胞裂解液诱导的rMSCs生长速度减慢,细胞呈长梭形,周边有毛刺样突起.免疫印迹法和双重免疫荧光标记显示部分经诱导的细胞同时表达CK与S-100.流式细胞术显示14.1%的细胞能够同时表达CK与S-100.结论 rMSCs经RPE细胞裂解液诱导后能够向RPE细胞方向分化.     

人视网膜祖细胞和脑神经干细胞的体外培养和诱导分化研究

目的比较人视网膜祖细胞和脑神经干细胞的体外分化潜能。方法分离8-12周人胎儿神经视网膜和脑皮质、纹状体神经干细胞,进行无血清体外培养;采用光镜和免疫细胞化学或荧光免疫细胞化学染色方法,分别观察在无血清和10％胎牛血清培养条件下,两种来源的神经干细胞分化后的细胞特性。结果两种来源的神经干细胞,均能在体外有或无血清培养条件下增殖并分化。视网膜祖细胞不但表达视网膜祖细胞标志物Pax-6,也可表达神经干细胞标志物．巢蛋白（Nestin）、成熟神经元标志物-微管相关蛋白2（Map2）、星形胶质细胞标志物-胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、节细胞标志物Thy-1和视杆细胞标志物视紫红质（Rhodopsin）;脑神经干细胞也能表达这些特异性细胞标志物。血清诱导分化时,视网膜祖细胞较难贴壁,贴壁细胞球伸出少而短的突起,单个细胞形态不清;而脑神经干细胞球易贴壁并伸出较长突起交织成网,大量细胞从细胞球中沿突起徙出,单个细胞形态清晰。结论人胎儿视网膜祖细胞和脑神经干细胞体外培养均具有向神经元、胶质细胞及视网膜终末细胞分化的能力;两种干细胞在进行血清诱导分化时,细胞的贴壁、迁移能力及分化后的细胞形态均存在差异。（中华腠科杂志,2006,42：901．907）     

体外诱导室管膜下区神经干细胞分化为视网膜神经细胞样细胞的研究

目的 研究室管膜下区细胞的体外培养及其诱导分化情况。方法 取新生0—3d的SD乳鼠室管膜下区细胞进行体外培养,同时培养视网膜神经细胞。收集视网膜细胞培养上清液,配制成条件分化液,将培养的室管膜下区细胞接种于视网膜细胞条件分化液中,并对诱导的细胞进行免疫荧光鉴定。结果体外培养的室管膜下区细胞在无血清的培养基中生长良好,接种于SD乳鼠视网膜细胞条件分化液中的室管膜下区细胞可分化为视网膜神经样细胞。应用,Thyl.1单克隆抗体行免疫荧光检查,细胞呈阳性反应。结论 在一定条件下室管膜下区细胞能够于体外培养存活,视网膜细胞条件分化液可定向诱导室管膜下区细胞分化为视网膜神经节细胞样细胞,体外模拟眼内环境行室管膜下区细胞诱导,将为进一步的眼内移植提供理论依据。     

大鼠视网膜干细胞与神经干细胞体外增殖、分化特点比较

目的 通过对大鼠视网膜干细胞和神经干细胞体外增殖、分化特点进行比较,进一步明确视网膜于细胞自我更新及向神经细胞方向分化的能力.方法 实验研究.分离出生10 d大鼠睫状体区组织及新生大鼠脑组织,分别应用酶消化法将两种组织制成单细胞悬液,放入含有20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、20μg/L表皮生长因子及1×B27添加剂的无血清DMEM/F12培养液中培养,观察并比较视网膜干细胞及神经干细胞体外增殖的特点.分别取第2代细胞,应用免疫细胞化学染色法检测干细胞特异性抗原神经巢蛋白（nestin）及细胞分裂增殖标志物5-溴脱氧尿核苷（BrdU）的表达.同时,应用含50 ml/L的胎牛血清及1×N2添加剂的培养基促进其分化,观察两种细胞向神经细胞方向分化的特点：分别应用免疫细胞化学染色法对分化后的细胞nestin、神经无标志物神经元特异性烯醇酶（NSE）、神经胶质细胞标志物神经胶质酸性蛋白（GFAP）进行检测,并应用卡方检验对两种干细胞分化后的NSE及GFAP阳性细胞数比例进行比较.结果 两种细胞原代培养48 h后均可见小的球状细胞团悬浮生长,折光性强.原代培养约7 d后传代,传代后细胞能重新形成球状细胞团,应用免疫细胞化学染色方法均可检测到细胞内nestin及BrdU的阳性表达,视网膜干细胞体外增殖的能力较神经干细胞弱.两种细胞均可在血清诱导条件下转变为贴壁生长,并分化出具有神经细胞形态的细胞.诱导第7天进行免疫细胞化学染色,检测出两种干细胞表达nestin阳性细胞数比例分别为（9.5±3.5）%及（9.1±0.7）%.视网膜干细胞分化后NSE及GFAP的阳性细胞数比例分别为（11.2±2.8）%及（18.9＋2.1）%,低于神经干细胞分化后两种标志物阳性细胞数比例[（34.1±63）%及（41.9±3.3）%],NSE、GFAP在两组表达的差异均有统计学意义（x2=103.23,P＜0.05;x2=74.36,P＜0.05）.结论 来源于睫状体区的大鼠视网膜干细胞形态、体外增殖及可分化特性与神经干细胞相似,但其增殖及分化为神经细胞的能力较神经干细胞弱.     

体外培养人胚胎来源视网膜干细胞的诱导分化

目的 探讨培养的人胚胎来源视网膜干细胞向视网膜终末细胞分化的可能性。方法 来自16～20周人胚胎的视网膜干细胞进行无血清体外培养,并分别进行有血清条件下体外诱导和用含视网膜色素上皮的眼杯模拟体内条件诱导的观察,采用免疫荧光法检测干细胞和视网膜终末细胞表面抗原的表达,采用实时荧光定量PCR法检测诱导前后细胞nestin基因在mRNA水平的表达差异。结果 从人胚胎视网膜神经感觉层分离出的视网膜干细胞,在体外诱导的条件下,可表达视网膜终末细胞标记PKCα、GFAP、Thy1,少数细胞表达nestin和MAP2;在模拟体内环境诱导后,则不仅表达上述细胞标记,而且rhodopsin和syntaxin表达阳性。实时荧光定量PcR法检测显示：诱导后细胞nestin基因表达量较诱导前细胞明显降低。结论 RPE可以促进体外培养的视网膜干细胞向视杆细胞和无长突细胞分化。(中华眼科杂志,2004,40：448-452)     

永生化胚胎视网膜干细胞的体外诱导分化

目的：研究R71882永生化视网膜干细胞系细胞的体外诱导分化。方法：对R71882细胞系细胞进行体外培养扩增，利用含有表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)及白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)等生长因子的DMEM／F12培养液对第43代细胞进行体外诱导分化，免疫荧光细胞化学鉴定诱导后细胞的抗原表达。结果：诱导后的R71882细胞系细胞增殖速度减慢，细胞表达微管相关蛋白2(microtubule-associated protein 2，MAP2)、胶质源性纤维酸性蛋白(glial fibrillary acid protein，GFAP)、蛋白激酶C-α(protein kinase C-α，PKC-α)、Thy1．1及Calretinin，同时部分细胞仍表达巢蛋白(Nestin)，但未见视紫红质(Rhodopsin)表达。结论：R71882细胞是一种多能视网膜干细胞。在EGF及bFGF等多种生长因子的共同作用下，该细胞系中部分细胞仍能表达未分化细胞标记物Nestin，部分细胞开始向神经元、神经胶质细胞及双极细胞、神经节细胞和无长突细胞等视网膜终末细胞方向分化。     

人视网膜中神经干细胞样细胞的分离和体外培养

目的 分离培养发育基本成熟的人视网膜中神经干细胞样细胞。方法 取0～3岁猝死婴幼儿视网膜细胞，在干细胞选择性培养基中培养，观察原代和传代细胞的形态和增殖情况，并对其诱导分化。通过免疫细胞化学方法检测Nestin、MAP-2和GFAP的表达。结果 原代细胞可形成悬浮生长的致密球状细胞团，传代后能形成新的细胞球。部分细胞球表达Nestin，传代后阳性率增加。分化后细胞形态多样，每一团细胞相对一致，部分细胞表达MAP-2或GFAP。结论 0～3岁人视网膜中存在一种表现出神经干细胞特性的细胞。     

转化生长因子-β2对体外培养的小鼠视网膜干细胞的诱导分化作用

目的研究转化生长因子（TGF）-β₂是否能促进体外培养的鼠视网膜干细胞的分化及其作用的强弱。方法小鼠胚胎在解剖显微镜下分离视网膜干细胞并进行培养，传代，nestin和chx-10免疫荧光鉴定；将第六代细胞进行诱导分化，并进行抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、抗opsin、抗b-tubulin、抗蛋白激酶C（PKC）免疫荧光染色，鉴定终末细胞。结果培养细胞经TGF-β₂诱导可向成熟细胞分化, 免疫荧光检测显示分化细胞的数量较胎牛血清诱导的分化细胞数量多。结论TGF-β₂能诱导视网膜干细胞分化为视网膜细胞；其诱导分化作用强于单独的血清诱导。(中华眼底病杂志, 2007, 23: 104-107)     

冻存复苏后大鼠视网膜干细胞的增生及分化特性

目的研究视网膜干细胞冻存复苏后的成活率及再培养后的增生分化特性。方法对胎龄17 d Long Evans的大鼠眼视网膜干细胞进行分离与体外培养。利用无血清培养基短期体外培养大鼠胚胎来源的视网膜干细胞，将传代三代后的视网膜干细胞以冻存液［体积分数为80%的改良基础培养基（DMEM）/F12，10%牛血清白蛋白（BSA），10%二甲基亚砜（DMSO），碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）20 ng/ml］于液氮中冻存，于1、2、4、8、12、16周分别复苏，计数活细胞比例进行再培养，并进一步诱导分化，采用免疫细胞荧光化学方法检测视网膜干细胞的增生及分化特性。结果不同的冻存时间对冻存后细胞存活率的影响无显著差异(P＞0.05)，再培养生长良好，具有视网膜干细胞特异性标志，并可进一步诱导分化为视网膜各种类型的细胞。结论大鼠视网膜干细胞的冻存复苏并不影响其原有的增生及分化特性。(中华眼底病杂志, 2007, 23: 94-97)     

人胚胎视网膜来源神经干细胞体外培养尝试

目的从人胚胎视网膜中分离、培养神经干细胞。方法人16～20周胚胎视网膜制备的单细胞悬液,分别在无血清和有血清条件下进行体外培养,采用免疫荧光法检测培养的细胞对nestin和视网膜终末细胞抗原的表达,采用RT—PCR方法和实时荧光定量PCR法检测诱导前后细胞nestin基因在mRNA水平的表达差异。结果可从人胚胎视网膜神经感觉层中培养出神经干细胞。该细胞具有自我复制能力,表达nestin,经不同条件诱导后细胞表达视网膜视杆细胞、无长突细胞、双极细胞、节细胞和米勒细胞等标志。诱导后细胞nestin基因表达量较诱导前细胞明显降低。结论人胚胎视网膜神经感觉层中存在具有自我更新能力和多分化潜能的神经干细胞。（中华眼科杂志,2005,41：847-852）     

视网膜细胞培养上清液对胚胎干细胞定向分化的神经样细胞钠通道动力学的影响

目的探讨不同视网膜细胞上清液对由胚胎干细胞诱导的神经细胞生理机能的影响。方法对拟胚体分别使用视黄酸（A组）、视黄酸+鼠视网膜胶质细胞和神经细胞培养上清液（B组）、视黄酸+人胎儿视网膜胶质细胞培养上清液（C组）进行次级诱导。在诱导后5~21 d，对各组中的细胞分别行细胞膜上的钠离子通道分析。结果诱导后5~21 d时，各组细胞钠电流变化均不明显。A组细胞钠通道呈爆发状的放电现象；B组呈现短促而频繁的状态；C组开放时程较长。三组细胞中，无电流细胞的比例分别为25%、11.4%和23.8%，但组间差异无统计学意义(P＞0.05)。A组Na+电流细胞数目表现为先升高后下降，B组表现为一直上升，C组表现为先下降后趋于平稳。A组细胞通道的开放时间最长，B组最短。三组的开放时间分布均可使用双指数拟和。结论在胚胎干细胞向神经细胞诱导中，视网膜细胞上清液对诱导细胞的生理功能会产生明显影响。(中华眼底病杂志，2007，23：91-93）