肺癌K—ras基因突变的二步PCR检测及其临床应用

目的 探讨高敏感性Ｋ－ｒａｓ基因点突变检测方法在肺癌临床的应用价值。方法 应用二步（巢式）聚合酶链反应结合限制性片断多态性分析方法（ＰＣＲ－ＲＦＬＰ）检测临床肺癌标本Ｋ－ｒａｓ基因第１２码子点突变。结果 二步ＰＣＲ－ＲＦＬＰ法检测Ｋ－ｒａｓ点突变的敏感性较一步法提高约６４倍。５５例肺癌石蜡包埋标本中，Ｋ－ｒａｓ点突变检出率为４７．３％；对另６７例纤支镜标本进行基因检测，以Ｋ－ｒａｓ突变进行基因诊断     

痰标本检测p53和ras基因突变与肺癌的早期诊断

目的　探索p53和Kras作为肺癌早期基因诊断指标的可行性。方法　从41例有细胞学证据的肺癌患者和15例临床诊断为肺结核或COPD的非肺癌患者的痰标本中提取基因组DNA,分别以PCRSSCP银染法检测p53第5～8外显子突变和PCRSSCP银染法检测Kras点突变。结果　p53突变在肺癌组为22例,非肺癌组为1例;而Kras突变只在肺癌组检出3例且均为腺癌。以p53作为肺癌诊断的指标得出其灵敏度为537%,特异性933%,阳性似然比805,正确诊断指数047。无1例同时存在p53和Kras突变,我们联合p53和Kras作为肺癌诊断或早期诊断的指标,则灵敏度为61%,特异性933%,阳性似然比915,正确诊断指数054。分析肺癌41例患者临床资料与p53突变关系得出p53检出率高龄患者(≥60岁)高于低龄患者(<60岁),但与患者吸烟情况、情别、病理分型和疾病分期均无关。结论　PCRSSCP银染法简单经济,快速安全,痰标本为无创检查,易被受检者接受,以p53或p53和Kras作为肺癌的基因诊断指标在高危人群或可疑病例中值得尝试。     

Detection of p53 gene mutations in sputum samples and their implications in th e early diagnosis of lung cancer in suspicious patients

目的　评价痰标本检测p5 3基因点突变方法及其作为肺癌早期临床诊断监测指标的真实性和可靠性。方法　用PCR SSCP 银染法检测 5 4例原发性肺癌患者和 114例良性肺疾患者痰标本中p5 3基因第 5 - 8外显子的点突变 ,同时进行痰涂片细胞学检查。结果　p5 3突变在肺癌组检出率为 5 5 5 6 % (30 /5 4 ) ,非肺癌组检出率为 1 75 % (2 /114) (P <0 0 0 1)。痰标本检测p5 3基因突变作为肺癌临床诊断监测指标的灵敏度 5 5 5 6 %、特异度 98 2 5 %、阳性似然比 31 75。肺癌组p5 3阳性检出率 5 5 5 6 % (30 /5 4 )与痰涂片瘤细胞阳性检出率 35 19% (19/5 4 )比较 :差异性有显著意义 (P <0 0 5 ) ,关联性有极显著意义 (P <0 0 1)。肺癌组p5 3检出率与性别、吸烟指数、病理分型、疾病分期均无明显关系 ,但与年龄有密切关系 ,高龄患者 ( 6 0岁 )检出率高 (P =0 0 2 )。非肺癌组一例慢性阻塞性肺病 (COPD)患者检测到E5突变 ,随访四年 ,确诊为肺鳞癌。结论　PCR SSCP 银染法检测痰标本p5 3突变可以在可疑肺癌患者 (如吸烟者合并慢性肺疾患 )中作为一项随访监测指标 ,将有助于肺癌早期临床诊断。     

改良Blocker PCR检测EGFR-TKI耐药后非小细胞肺癌血浆EGFR T790M突变的价值

 目的   探讨改良PCR(Blocker PCR)方法在晚期非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)患者血浆游离DNA(cell free DNA,cfDNA)中检测继发EGFR T790M突变的应用价值。方法   采用Blocker PCR方法对127例表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI)耐药后肺癌患者的血浆标本行EGFR敏感突变和T790M突变检测,统计T790M突变的检出率;为验证Blocker PCR 血浆检测的可靠性,部分患者血浆标本行二代测序(next generation sequencing,NGS)和Blocker PCR配对比较;获得配对血浆和组织的病例行Blocker PCR配对检测。结果   在127例采用Blocker PCR方法检测的EGFR-TKI耐药NSCLC患者中,T790M耐药突变的检出率为40.15% (51/127),其中21.56% (11/51)为单纯T790M耐药突变,78.44% (40/51)为T790M合并原有EGFR敏感突变。组织与血浆配对检测中,EGFR-TKI耐药后二次活检组织标本T790M的检出率为54.54% (6/11),血浆T790M的检出率为43.75% (14/32)。在同时行Blocker PCR 和二代测序基因检测的18例患者中,敏感突变位点及T790M突变位点在两种检测方法中的一致率均为100%。结论   在EGFR-TKI耐药后的NSCLC患者中使用Blocker PCR 检测血浆T790M突变是对组织活检的重要补充。     

Super-ARMS法在检测非小细胞肺癌EGFR基因突变中的应用分析

目的本研究通过对超级突变扩增阻滞系统(Super-ARMS)法与突变扩增阻滞系统法(ARMS)检测晚期非小细胞肺癌患者表皮生长因子受体(EGFR)基因突变的比较分析,探索Super-ARMS法的临床应用价值。方法收集111例晚期非小细胞肺癌患者外周血标本,提取血浆游离DNA后,分别采用Super-ARMS法及ARMS法进行EGFR基因突变检测,同时对53例配对的石蜡组织切片采用ARMS法进行EGFR基因突变检测。结果 111例标本中,Super-ARMS法检测EGFR基因突变率为50.5%(56/111),ARMS法检测EGFR基因突变率为46.9%(52/111);Super-ARMS法检测出T790M单突变3例,双突变5例,ARMS法则未检测出相关突变,两者比较差异有统计学意义(χ~2=8.023,P0.01);两种方法检测EGFR基因突变一致率达87.4%(97/111),一致性检验显示Kappa系数为0.748(95%CI:0.624～0.871,P0.001);通过检测53例配对组织样本的EGFR基因突变情况显示,与组织ARMS法比较,Super-ARMS法检测的敏感性、特异性和准确性分别为70.8%(17/24)、89.7%(26/29)和81.1%(43/53)。结论 Super-ARMS法与ARMS法检测EGFR基因突变结果一致性较高,Super-ARMS法检测T790M突变的敏感性明显优于ARMS法。     

肺癌患者纤维支气管镜活检标本K-ras基因突变的检测及其临床意义

目的: 探讨检测纤维支气管镜活检标本K-ras基因突变对肺癌诊断的临床意义。方法： 采用聚合酶链反应-单链构象多态性（PCR-single strand conformational polymorphism, PCR-SSCP） 银染技术,检测52例肺癌患者和9例肺良性疾病患者的纤支镜活检标本中K-ras基因第12,13和61位密码子的突变率,并对K-ras基因突变与临床病理参数进行相关分析。结果： 52例肺癌患者活检标本中,12例检测出K-ras基因点突变,突变率为23.1%,9例肺良性疾病患者活检标本中未检测出K-ras基因点突变。K-ras基因突变与肺癌病理组织类型相关,在腺癌中达43.8%,但与患者年龄、性别、吸烟史、肿瘤细胞分化程度及临床分期无关。 结论：检测纤支镜活检标本K ras基因突变有可能作为肺癌早期诊断的一个参考指标。肺癌; 纤维支气管镜; K-ras基因; 突变     

周围型非小细胞肺癌患者支气管肺泡灌洗液p53基因突变及其临床意义

目的:DHPLC分析周围型非小细胞肺癌患者支气管肺泡灌洗液标本p53突变及其作为分子诊断标记的可行性.方法:DHPLC分析46例支气管肺泡灌洗液标本(33例肺癌,13例对照)p53基因Exon5～9突变.结果:肺癌组p53突变检出率36.36%(15/33),对照组未检出一例,两组p53突变率比较具有明显差异(P＜0.05);p53突变作为肺癌诊断分子标记,灵敏度36.36%(12/33),特异度100%(13/13).结论:DHPLC分析周围型非小细胞肺癌患者支气管肺泡灌洗液标本p53基因热点突变可以作为周围型肺癌诊断的分子标记,但在支气管肺泡灌洗液标本检测单一基因突变不能满足临床诊断的需要.     

寡核苷酸芯片检测肺癌患者痰标本中p53点突变

目的：用寡核苷酸基因芯片方法检测肺癌患者痰标本中p53基因的热点突变,为肺癌的诊断探索快速、准确的基因检测途径。方法：收集肺癌患者痰标本并提取基因组DNA,用荧光标记的引物对DNA进行p53基因Exon5、Exon7PCR扩增,然后用PCR扩增产物与基因芯片进行杂交,通过对杂交信号的检测,判断是否发生点突变,并用测序方法对部分阳性结果进行验证。结果：在27例肺癌患者痰标本中,p53基因突变的检出率为25．92％,其中小细胞肺癌的突变率为40％（2／5）、肺鳞癌的突变率为26．6％（4／15）、肺腺癌的突变率为14．28％（1／7）,检测到的突变位点有175（2）、248（1）、249（2）,对2例阳性标本的测序证实了基因芯片的结果。结论：寡核苷酸基因芯片法可以快速、准确检测出肺癌患者痰标本中p53基因的点突变,今后可用该法对肺癌患者和高危人群的痰标本进行大规模筛选,提高肺癌的早期诊断率。     

液相芯片技术检测非小细胞肺癌多基因突变

目的 建立基于高通量液相芯片技术、可同时检测p53、p16、视网膜母细胞瘤(Rb)和表皮生长因子受体(EGFR)基因热点突变的方法,并探讨其在非小细胞肺癌(NSCLC)分子诊断中的意义.方法 针对p53、p16、Rb和EGFR基因热点突变位点,分别设计正常序列和突变序列探针,将探针固定于标记不同比例荧光物的微球上.分别提取65例NSCLC患者(Ⅰ期23例,Ⅱ期20例,Ⅲ期22例)癌组织标本和其中20例患者癌旁正常组织标本基因组DNA,PCR扩增p53、p16、Rb和EGFR基因.将PCR产物与含寡核苷酸探针的微球混合后用Luminex 100多功能流式点阵仪进行流式荧光检测分析.结果 单独检测p53、p16、Rb和EGFR基因突变时,NSCLC标本突变检出率分别为53.8%(35/65)、20.0%(13/65)、7.7%(5./65)和35.4%(23/65);癌旁正常组织标本为5.0%(1/20)、5.0%(1/20)、0和0.而四基因联合检测,敏感性为81.5%(53/65),特异性为90.0%(18/20),准确性为83.5%(71/85);Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期NSCLC标本突变检出率分别为78.3%(18/23)、80.0%(16/20)和86.4%(19/22).结论 成功建立了具有较高敏感性和特异性、可同时检测临床NSCLC标本多基因突变的液相芯片检测方法,该方法有助于提高NSCLC分子诊断的效率,并可能有助于NSCLC的早期诊断.     

肺癌病人痰细胞中p16基因高甲基化分析

目的　分析肺癌病人痰标本中p16基因启动子区域异常高甲基化的改变情况 ,评价该指标作为肺癌辅助诊断分子标记物的价值。方法　运用半巢式甲基化特异性PCR技术 ,检测 94例原发性肺癌病人痰标本和部分对应肿瘤组织 ,以及 10例慢性炎病例痰标本中p16基因启动子区域的甲基化改变。结果　 74%的肺癌病人痰标本中检测到了p16基因异常高甲基化 ,与传统细胞学相比 ( 4 6.8%) ,痰标本中p16基因异常高甲基化对肿瘤的检出率灵敏度更高 (P <0 .0 1) ;痰细胞中p16甲基化检测和细胞学相结合 ,对肿瘤的检出率可达 86.17%( 81 94)。如果痰标本中p16基因启动子区域发生高甲基化 ,其对应的肿瘤组织中p16基因亦为高甲基化。 10例慢性炎病人痰标本中仅 3例检测出p16基因甲基化。结论　痰标本中p16基因甲基化是临床肺癌辅助诊断的有效分子生物标记物之一。     

胃癌组织ras和P53基因突变的检测

（１）目的 研究胃癌组织中Ｐ５３基因和ｒａｓ基因的突变情况,（２）方法 采用ＰＣＲ ＲＦＬＰ技术,分析４１例胃癌标本中Ｐ５３基因和ｒａｓ基因的突变。（３）结果 本组４１例中,１２例（２９．３％）发生Ｐ５３基因突变,１６例（３９．１％）发生ｒａｓ基因突变,１全负时发生Ｐ５３基因和ｒａｓ基因的突变。（４）结论 Ｐ５３和ｒａｓ基因突变与胃癌的发生密切相关,在胃癌的发生中可能起重要作用。     

肺癌组织p53和K-ras基因突变及其表达产物检测的意义

目的：研究肺癌组织中ｐ５３ 和 Ｋｒａｓ 基因突变、蛋白表达,以及二者的关系． 方法：应用 Ｐ Ｃ Ｒ Ｓ Ｓ Ｃ Ｐ和免疫组织化学方法分别检测肺癌组织中的ｐ５３ 和 Ｋｒａｓ基因突变和蛋白表达． 结果：肺癌组织中检测到ｐ５３ 和 Ｋｒａｓ基因的突变分别为５３％ 和１４％ ,肺癌组织中检测到ｐ５３ 蛋白和 ｐｒａｓ ２１ 蛋白的积聚分别为５８％ 和１９％ ． 结论：ｐ５３ 和 Ｋｒａｓ基因突变与肺癌发生关系密切,其基因突变与蛋白的积聚之间存在一致的关系,但并非完全对应． ｐ５３ 和 Ｋｒａｓ基因突变及其表达产物的检测对肺癌患者有一定的辅助诊断意义．     

检测胰液和粪便中K-ras和p53基因突变对胰腺癌早期诊断的价值

目的 通过检测胰液、粪便癌基因K－ras和抑癌基因p53的突变,探索早期诊断胰腺癌的手段。方法 1994年至2000年5月住院和门诊患者共201例,正常对照60例,通过聚合酶链反应－限制片段长度多态性（PCR－RFLP）方法检测胰液、粪便K－ras突变,PCR－SSCP方法检测p53突变。结果 胰腺癌患者胰液K－ras突变率为87．8％（36／41）,胰腺良性病变为23．5％（4／17）。粪便K－ras扩增成功率为90．0％（235／261）。胰腺癌患者粪便K－ras突变率为88．0％（66／75）,胰腺良性病变为51．1％（24／47）,正常人粪便K－ras突变率为19．6％（9／46）。胰腺癌胰液细胞p53突变率47．4％（18／38）,胰腺良性疾病为12．5％（2／16）。胰腺癌粪便p53突变率为37．1％（23／62）,慢性胰腺炎为19．1％（4／21）。结论 胰腺癌患者胰液K－ras突变的敏感性、特异性高,可以作为胰腺癌诊断的辅助手段。粪便K－ras结合p53检测可以提高敏感性,在胰腺癌筛选中有潜在的价值,联合血清CA19－9等肿瘤标记物检测有助于提高胰腺癌早期诊断率。     

胰管刷检标本K-ras基因突变检测在胰腺癌诊断中的作用

目的:探讨胰管刷检标本K-ras基因突变检测在胰腺癌诊断中的价值.方法:应用突变富集聚合酶链反应(PCR)-单链构象多态性(SSCP)法检测胰腺疾病胰管刷检标本K-ras基因第1外显子第12密码子点突变.结果:35例胰管刷检标本PCR扩增均获成功,成功率100％.20例胰腺癌中14例检测到K-ras突变,7例慢性胰腺炎1例K-ras突变,两组间差异显著(P<0.05).胰腺囊腺瘤、十二指肠乳头癌均未见K-ras突变.胰管刷检标本K-ras突变与胰腺癌部位无关.胰管刷检K-ras突变检测诊断胰腺癌的敏感性、特异性、准确性分别为70％、94％、83％.结论:检测胰管刷检标本中K-ras基因突变有助于提高胰腺癌的诊断,具有良好的临床应用前景.     

胰腺癌患者外周血游离K-ras基因突变检测的临床意义

目的:通过检测胰腺癌患者外周血中游离K-ras基因突变,探索无创性胰腺癌诊断的新方法.方法:采用两步法聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)技术,部分样本行DNA直接测序确证,检测胰腺良性病变患者(11例)血浆、恶性病变患者(30例)血浆及肿瘤组织K-ras基因的突变情况.对照组为8例慢性胰腺炎和3例胆石症患者.结果:胰腺癌和慢性胰腺炎病例外周血K-ras基因突变率分别为60.0％(18/30) 和12.5％(1/8),3例胆石症未见K-ras基因突变.其中肿瘤组织K-ras基因突变阳性病例外周血检测阳性率为69.6％(16/23).结论:胰腺癌患者外周血游离K-ras基因突变的检测有助于胰腺癌的无创性诊断.     

联合检测胃粘膜组织P53、P16、K—ras对胃癌的诊断价值

目的 :探讨胃癌组织P53、P1 6 、K ras基因的协同突变情况 ,揭示P53、P1 6 、K ras基因突变与胃癌发生的关系。方法 :应用聚合酶链反应 (PCR)与单链构象多态性分析法 (SSCP)对 6 0例经病理切片诊断为胃癌组织和 2 0例正常胃粘膜组织进行P53、P1 6 、K ras基因突变分析。结果 :6 0例胃癌粘膜组织中 ,P53基因发生突变 5 3例 ,占 88 3% ;P1 6 基因发生突变 49例 ,占 81 7% ;K ras基因发生突变 5 6例 ,占 93 3% ;男女间突变率比较差异无显著性 (P >0 0 5 ) ;而 2 0例正常胃粘膜组织无P53、P1 6 、K ras基因突变发生。结论 :P53、P1 6 、K ras基因突变是胃癌中常见的分子事件 ,用PCR—SSCP法联合检测胃粘膜组织P53、P1 6 、K ras基因的突变情况将有助于诊断胃癌 ,为临床提供更为可靠的检验资料     

53例胃癌前病变粘膜组织K—ras基因突变情况分析

目的：探讨胃癌前病变组织K－ras基因突变情况,揭示K－ras基因突变与胃癌发生的关系。方法：应用聚合酶链反应（PCR）与单链构多态性分析（SSCP）对53例经病理切片诊断为胃癌前病变粘膜组织和10例正常胃粘膜组织进行K－ras基因突变分析。结果：53例胃癌前病变粘膜组织中,K－ras基因发生突变40例,占75．5％;男女间突变率比较差异无显著性（P＞0．05）;而10例正常胃粘膜组织无K－ras基因突变发生。结论：K－ras基因突变是胃癌前病变中常见的分子事件,用PCR－SSCP法检测胃粘膜组织K－ras基因的突变情况将有助于了解胃癌发生的生物学行为,对早期诊断有一定的帮助。     

慢性胰腺炎K—ras基因突变的临床病理学意义

目的：探讨慢性胰腺炎K－ras基因突变的临床病理学意义。方法：9例手术切除的慢性胰腺炎的石蜡标本,用微解剖法分离慢性胰腺炎的胰导管上皮粘液细胞增生灶,提取,扩增DNA,用ASO斑点杂交检测K－ras基因第12密码子的碱基序列。对9例接受手术治疗的病人进行长期随访,结果：9例慢性胰腺炎中4例有明显的胰导管上皮粘液细胞增生,其中2例被检出GAT型突变,分别占全组和有胰管上皮粘液细胞增生的22％和505,两个突变病例分别是接受了胰体尾切除和胰头十二指肠切除手术,术后分别随访17年和10年,没有发现任何恶变迹象,结构：慢性胰腺为可以检出K－ras基因突变,发生了K－ras基因突变的慢性胰腺炎上皮粘液细胞增生灶,未必一定发生为胰腺癌,胰液、粪便、末梢血液和尿液的检测,以及胰腺组织细针刺液检出K－ras基因突变,对胰腺癌的诊断有重要参考价值,但不应视为胰腺癌的确诊依据。     

胰液K-ras 12密码子点突变检测对胰腺癌诊断的临床价值

目的:探讨胰液中K-ras 12密码子点突变对胰腺癌诊断的临床应用价值.方法:采用内镜下置鼻胰管方法收集20例胰腺疾病的胰液标本,聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)检测胰液K-ras基因第12密码子点突变,与肿瘤标记物CA19-9及CEA检测结果比较.结果:12例胰腺癌患者胰液标本中K-ras突变率为58.3％(7/12);8例慢性胰腺炎患者标本K-ras突变率为12.5％(1/8),胰腺癌胰液K-ras基因突变检测的敏感性为58.3％,特异性为87.5％,阳性预示值为87.5％,阴性预示值为58.3％.同一组病例以血清CA19-9>37 U/ml、CEA>4.5 μg/ml为阳性界值.胰腺癌血清 CA19-9、CEA阳性率分别为58.3％(7/12)、41.7％(5/12).结论:K-ras基因突变与胰腺癌相关性好,胰液中K-ras 12密码子突变率高,特异性强,为胰腺癌早期诊断的初步筛选提供了手段.     

人乳头状瘤病毒和p53基因及H-ras基因在喉癌细胞中的表达

目的：研究喉癌细胞p53基因、H－ras基因突变及其与人乳头瘤病毒（HPV）感染的关系，探讨其在喉癌发生发展中可能起的作用。方法：采用分子生物学技术，包括聚合酶链反应、单链构型多态性分析、限制性内切酶长度多态性分析，及DNA序列分析等方法，对28例喉癌进行人乳头状瘤病毒、p53基因及H－ras基因检测。结果：28例喉癌中有50％在p53基因的第7－8外显子有突变，其中4例行DNA序列分析表明均有碱基替换、插入或丢失；而H－ras基因第12密码子的突变率仅3．57％；高危型HPV（HPV－16或－18）感染在喉癌细胞中有一定的特异性，且与p53基因突变有一定的相关性。结论：在喉癌的发生发展过程中高危型HPV感染和p53基因突变起着重要的作用，且两者之间可能存在某种内在的联系。