基于重组优势多表位抗原的梅毒间接酶联免疫吸附试验与梅毒螺旋体血凝试验和甲苯胺红不加热血清试验检测梅毒螺旋体抗体的比较研究

目的：建立操作简便、特异性好、敏感性高的血清梅毒抗体的间接酶联免疫吸附试验（ELISA）。方法：通过计算机分析选择梅毒螺旋体优势抗原表位，构建了梅毒螺旋体多表位优势嵌合抗原(rTpN15-TpN17-TpN42-TpN47)表达载体，转化宿主菌HB101进行表达，纯化获得高纯度融合抗原。在此基础上，以纯化抗原包被酶联板，建立检测血清中梅毒抗体的间接ELISA法。利用该方法与梅毒螺旋体血凝试验（TPHA）和甲苯胺红不加热血清试验（TRUST）同时检测了126例梅毒可疑血清样本，对检测结果进行了比较研究。结果：梅毒螺旋体多表位优势嵌合抗原（rTpN15-TpN17-TpN42-TpN47)在大肠杆菌中获得了高效表达，并成功建立了检测血清中梅毒抗体的间接ELISA法及试剂。对126例梅毒可疑血清样本的检测结果，ELISA、TRUST、TPHA的检出阳性率分别为75．40％（95／126）、72．22％（91／126）、70．63％（89／126）， 其中TRUST有29例，TPHA有6例为可疑阳性。TPHA检测的6例可疑阳性中，有5例ELISA、TURST均为阳性；而TRUST测出的29例可疑样品中，仅7例ELISA、TPHA阳性。结论：多表位嵌合抗原ELISA试剂在特异性、敏感性与TPHA法相近，但明显优于TRUST法。     

基于重组优势多表位抗原的梅毒间接酶联免疫吸附试验与梅毒螺旋体血凝试验和甲苯胺红不加热血清试验检测梅毒螺旋体抗体的比较研究

目的 建立操作简便、特异性好、敏感性高的血清梅毒抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA)。方法 通过计算机分析选择梅毒螺旋体优势抗原表位,构建了梅毒螺旋体多表位优势嵌合抗原(rTpN15-TpN17-TpN42-TpN47)表达载体,转化宿主菌HB101进行表达,纯化获得高纯度融合抗原。在此基础上,以纯化抗原包被酶联板,建立检测血清中梅毒抗体的间接ELISA法。利用该方法与梅毒螺旋体血凝试验(TPHA)和甲苯胺红不加热血清试验(TRUST)同时检测了126例梅毒可疑血清样本,对检测结果进行了比较研究。结果 梅毒螺旋体多表位优势嵌合抗原(rTpN15-TpN17-TpN42-TpN47)在大肠杆菌中获得了高效表达,并成功建立了检测血清中梅毒抗体的间接ELISA法及试剂。对126例梅毒可疑血清样本的检测结果,ELISA、TRUST、TPHA的检出阳性率分别为75.40％(95/126)、72.22％(91/126)、70.63％(89/126),其中TRUST有29例,TPHA有6例为可疑阳性。TPHA检测的6例可疑阳性中,有5例ELISA、TRUST均为阳性;而TRUST测出的29例可疑样品中,仅7例ELISA、TPHA阳性。结论 多表位嵌合抗原ELISA试剂在特异性、敏感性与TPHA法相近,但明显优于TRUST法。     

抗原优势表位的筛选方法

疫苗的出现有效降低了人类感染性疾病的发病率和死亡率。随着科学的进步和发展,发现原始的疫苗已经不能满足当今社会的需要。现代保护性免疫理论认为,有效的保护性免疫来源于一组表位的合理组合与搭配。近年来兴起的表位研制技术,是用抗原表位制备疫苗,它在感染性疾病和恶性肿瘤中有着自身独特的优势。因此如何在众多的表位中确定优势表位,已经成为研究的新方向。本文详细阐述了优势表位的筛选办法,对其最新的研究进展进行了综述。     

芯片法筛选钩端螺旋体外膜蛋白抗原表位

目的 通过芯片法筛选钩端螺旋体主要外膜蛋白中抗原表位,为后续研制有广泛交叉保护作用的通用钩体疫苗提供科学依据。方法 采用PCR及测序法检测主要外膜蛋白编码基因在不同血清群钩体中的分布情况及其序列相似性。采用生物信息学软件预测钩体外膜蛋白抗原表位。采用抗体纯化磁珠试剂盒纯化大鼠抗不同血清群钩体抗血清IgG。采用抗原芯片法检测各抗原肽的免疫反应性,确定优势抗原表位。结果 候选抗原蛋白编码基因均广泛存在于不同血清群的致病性钩体中且序列保守。综合生物信息学软件结果预测出30个候选T-B联合抗原表位。合成短肽结合芯片检测方法共筛选出9个优势抗原表位,各抗原肽对不同血清群钩体抗血清IgG反应性基本一致。结论 芯片法可高效筛选钩体外膜蛋白优势表位,为表位肽疫苗的研制提供支持。     

螺旋体传染病

梅毒螺旋体多表位抗原的改构及在双抗原夹心检测梅毒抗体中的应用——张贺秋等(北京军事医学科学院基础医学研究所100850)《中国医学检验杂志》2004，5(6)：549-551[研制用于包被和标记重组梅毒螺旋体表位抗原，建立双抗原夹心酶联免疫检测梅毒抗体。方法：利用计算机Godlkey软件分析梅毒螺旋体基因，确立优势抗原表位(rTpN17-TpN15-TpN42-Tp-N47)，并分别克隆表达四个抗原，然后将四个抗原串联成一个嵌合表达蛋白用于包被，在此抗原的末端连接4个赖氨酸，作为辣根过氧化物酶标记用梅毒抗原，建立双抗原夹心检测梅毒抗体。     

汉坦病毒核蛋白抗原表位的研究

汉坦病毒(HV)核蛋白(NP)是其主要结构蛋白之一,由病毒基因组S基因编码,分子量在48～51KD之间,系一非糖基化的线性蛋白质,在病毒的装配、增殖过程中具有重要意义。血清学研究表明,汉坦病毒NP具有很强的抗原性和免疫原性,病人对该蛋白的抗体应答反应不仅出现早,且滴度高,于第七病日即达100％。对流行性肾病出血热研究亦证实,在疾病急性期及恢复早期,抗HV结构蛋白三种抗体中,以抗-NP出现早、且滴度高,而抗-G1     

抗—HIV ELISA试验中双抗原夹心法与间接法的对比分析

我们对 31例恶性胸腔积液患者采用力尔凡胸腔注射治疗 ,取得良好的近期疗效 ,现报告如下。临床资料 :本组男 18例 ,女 13例 ;年龄 2 3～ 6 9岁。均通过胸腔射层、胸液生化、癌细胞及 CT等检查确诊 ,其中肺癌2 7例 ,肝癌 3例 ,乳腺癌 1例。积液部位为双侧 5例 ,右侧 15例 ,左侧 11例。积液量为中等量 17例 ,大量 14例。积液性质为渗出液 2 0例 ,漏出液 8例 ,血性 3例。患者均经化疗 (肝癌为局部 ,其他是全身性 )、利尿剂、白蛋白及支持治疗等 ,并行胸腔穿刺抽液 1～ 3次 ,胸腔积液无明显减轻者 ,于胸腔注射力尔凡。方法 :首次使用前应做皮试…     

梅毒螺旋体TprF蛋白B细胞表位的预测与鉴定

目的 预测和鉴定梅毒螺旋体(Tp) 膜蛋白TprF氨基端保守区(TprF^N)的优势B细胞表位,为深入研究梅毒多价表位疫苗提供依据。方法 从GenBank获取TprF^N的氨基酸序列,采用Mobyle、ABCpred和IEDB在线软件综合分析预测TprF^N的B细胞表位并人工合成多肽;表达重组蛋白TprF^N并经Western blot鉴定后免疫兔,获取血清并测定抗体效价;以TprF^N免疫兔血清、梅毒患者血清(设正常人血清和正常兔血清为阴性对照),间接ELISA测定预测的7条人工合成的B细胞表位多肽的免疫反应性和特异性。结果 软件综合预测TprF^N的P1 (43-62AA)、P2(57-71AA)、P3(81-88AA)、P4(89-103AA)、P5(125-138AA)、P6(231-251AA)、P7(268-279AA)可能为B细胞表位;表达一可溶性蛋白,WB鉴定为目的 蛋白,其免疫抗体效价为1∶12 800以上;ELISA结果显示,预测表位P1、P3与TprF^N免疫兔血清及梅毒患者血清均呈阳性反应,而与对照血清均不反应。结论 P1、P3为TprF潜在的优势B细胞表位。     

抗-HCVELISA间接法与双抗原夹心法试剂的应用对比评价

目的:对比研究国产抗-HCV ELISA间接法和双抗原夹心法试剂的检测效能,探讨血站抗-HCV检测模式。方法:选择1种双抗原夹心法酶联免疫试剂、2种间接法酶联免疫试剂分别检测34 593名无偿献血者血样,采用重组免疫印迹试验(RIBA)对其中有反应性的44份标本进行确认,并用BBI血清盘对这2种检测试剂进行考核评价。结果:科华、新创和万泰3个厂家的抗-HCV有反应性及灰区标本经RIBA实验确证后,假阳性率分别为31%、63%、13%。万泰双抗原夹心法与间接法相比,增加了反应强度、降低了假阳性率且缩短了窗口期。结论:为确保血液质量,血筛实验室应选择灵敏度和特异性双优的试剂,采用间接和双抗原夹心2种不同的ELISA试剂检测HCV抗体优于2种间接ELISA试剂,不仅提高抗-HCV有反应性标本的检出率,而且减少血液因假阳性造成的浪费。     

钩端螺旋体OmpL1抗原表位预测、克隆和表达

目的　应用生物信息学方法预测钩体外膜蛋白OmpL1的表位 ,结合基因工程手段进行表位重组、表达和分离纯化。方法　用预测程序ProPred和ANTIGENIC预测OmpL1的表位 ,PCR合成重组表位基因片段 ,克隆PCR产物构建表达质粒 pGEX/Omp Omp ,测序验证。对含有该质粒的大肠杆菌BL2 1(DE3)进行诱导表达 ,表达产物westernblot分析并纯化融合蛋白。结果　预测到 2个既具有MHC结合肽特性又具有B细胞表位特征的肽段。重组表位基因序列与理论设计完全一致。IPTG诱导BL2 1(DE3)中高效表达Mr约 30 0 0 0的融合蛋白 ,纯化后蛋白纯度 >90 %。结论　成功构建原核表达质粒pGEX/Omp Omp ,并进行含重组表位的GST融合蛋白的分离纯化 ,为OmpL1的表位研究和应用于亚单位疫苗奠定了基础。     

梅毒螺旋体重组抗原TmpA的表达及其在梅毒诊断中的应用

目的：用基因工程方法表达梅毒螺旋体的TmpA重组抗原,建立检测梅毒螺旋体抗体酶联免疫试验（EIA）。方法：用聚合酶链反应（PCR）扩增梅毒螺旋体TmpA基因,克隆到原核表达载体pQE-30中表达,用亲和层析柱法纯化该重组抗原,并用其建立检测梅毒螺旋体抗体的EIA。结果：表达的重组抗原相对分子质量构为39000,具有良好的抗原性。用其建立的EIA检测10份阳性参比血清,均为阳性,灵敏度为100%;检测20份阴性参比血清,均为阴性,特异性为100%。检测12份I期梅毒（早期感染）和24份Ⅱ期和晚期梅毒患者血清,阳性率分别为91.67%（11/12）和100%（24/24）。结论：用该重组抗原建立的EIA可检出97.2%（35/36）以上梅毒患者,仅2.8%（1/36）漏检。为进一步提高该试剂的灵敏度,可能需增加梅毒螺旋体的其它重组抗原。     

贝氏柯克斯体5种重组表面蛋白抗原包被酶联免疫吸附试验的特异性和敏感性分析

目的 使用贝氏柯克斯体5种重组表面蛋白作为包被抗原的酶联免疫吸附试验用于血清学检测的特异性和敏感性分析。方法 本研究建立由贝氏柯克斯体的Com1、GroEL、Mip、OmpH、RplL重组表面蛋白抗原分别包被的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,然后分别检测贝氏柯克斯体实验感染小鼠血清和Q热患者血清中IgG特异性抗体。结果 8份贝氏柯克斯体感染小鼠血清中除1份血清与RplL反应为阴性外其它均为阳性;11份Q热患者血清中除1份血清与RplL、1份血清与OmpH反应为阴性外,其它血清反应均为阳性。将这5种重组蛋白分别与莫氏立克次体、黑龙江立克次体、恙虫病东方体实验感染小鼠血清反应,除1份黑龙江立克次体感染小鼠血清与GroEL反应为阳性外,其它血清反应均为阴性。另外,Com1对斑疹伤寒、斑点热、恙虫病患者血清的阳性反应率平均为22.2%,GroEL为25.0%,Mip为25.0%,OmpH为25.0%,RplL为13.9%。结论 这些结果证明这5种重组蛋白抗原均可被贝氏柯克斯体感染血清所识别。所建立的ELISA方法具有良好特异性和敏感性,可用作Q热血清学诊断。     

结核γ-干扰素酶联免疫斑点检测在结核性心包积液诊断中的应用

目的 探讨结核菌特异性γ-干扰素（interferon-gamma,IFN-γ）酶联免疫斑点（enzyme-linked immunosorbent spot,ELISPOT）检测对结核性心包积液的诊断价值.方法 采用结核菌特异性IFN-γ ELISPOT技术同时检测20例结核性心包积液患者（TP组）和14例非结核性心包积液患者（Non-TP组）外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMC）及心包积液单核细胞（pleural effusion mononuclear cells,PEMC）中结核菌特异性IFN-γ水平.结果 TP组PBMC和PEMC结核菌特异性IFN-γ水平均显著高于Non-TP组,差异有统计学意义（P＜0.01,P＜0.01）.TP组心包积液中结核菌特异性IFN-y水平显著高于外周血IFN-γ水平,差异有统计学意义（P＜0.01,P＜0.01）.PBMC ELISPOT检测结核性心包积液的敏感性和特异性分别为80.0％和85.7％;而PEMC ELISPOT敏感性和特异性为90.0％和85.7％.结论 结核菌特异性IFN-γELISPOT技术对结核性心包积液诊断和鉴别诊断具有很好的辅助价值.     

双单克隆抗体夹心酶联免疫吸附试验检测鼠疫F1抗原的实验观察

目的 观察双单克隆抗体(F1-McAb)夹心酶联免疫试验(DMcAbS-ELISA)快速检测鼠疫F1抗原的敏感性和特异性.方法 采用鼠疫细菌学检验、DMcAbS-ELISA和反向间接血球凝集试验(RIHA)对比检测鼠疫感染鼠和阴性对照鼠脏器标本.结果 共检测225份阴性对照鼠脏器标本,鼠疫细菌学检验、DMcAbS-ELISA和RIHA法检测F1抗原均为阴性.共检测308只鼠疫感染鼠脏器标本,鼠疫细菌学检验、DMcAbS-ELISA、RIHA法阳性率分别为92.21％(284/308)、90.91％(280/308)和89.61％(276/308),3种方法比较,差异无统计学意义(x2=5.65,P＞0.05).DMcAbS-ELISA法与鼠疫细菌学检验结果符合率为97.00％[(274+243)/533],Kappa值为0.940;与RIHA法符合率为99.25％[(276+253)/533],Kappa值为0.985.脏器标本F1抗原检测的真实性比较:DMcAbS-ELISA法敏感性为96.48％(274/284),特异性为97.59％(243/249),阳性预测值为97.86％(274/280),阴性预测值为96.05％(243/253),一致性为96.99％11/4×(274/280+274/284+ 243/253+243/249)|,Youden指数为0.9407;RIHA法的敏感性为96.13％(273/284),特异性为98.80％(246/249),阳性预测值为98.91％(273/276),阴性预测值为95.72％(246/257),一致性为97.39％[1/4×(273/276+273/284+246/257+246/249)],Youden指数为0.9492.DMcAbS-ELISA法对鼠疫菌检测灵敏度为2.7×104cfu/ml,RIHA法为2.2×105 cfu/ml;两种方法检测F1抗原灵敏度均为10 μg/L.结论 DMcAbS-ELISA法检测鼠疫F1抗原具有敏感、特异、简便、快速的特点,是有应用价值的鼠疫快速诊断技术.     

Efficacy of a hepatitis C virus core antigen enzyme-linked immunosorbent assay for the identification of 'window-phase' blood donations

BACKGROUND AND OBJECTIVES: Recent studies have suggested that potentially infectious donations provided during the antibody-negative 'window' phase of hepatitis C virus (HCV) infection may be identified by testing for viral RNA or HCV core protein. We therefore evaluated the performance of an HCV antigen enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for identification of window-phase donations and for prospective screening of blood donors. MATERIALS AND METHODS: One-hundred and twenty-eight archived plasma donations containing HCV RNA, but lacking antibody to HCV (anti-HCV), were tested by using the HCV antigen ELISA, together with 9951 freshly collected serum and plasma specimens from blood donors. RESULTS: HCV core antigen was detected in 94% (120/128) of window-phase plasma donations. Overall specificity in freshly collected blood donor specimens was 99.74%. Two putative window-phase donations containing HCV core protein and viral RNA were identified from paid plasma donors by prospective testing with the HCV antigen ELISA. CONCLUSION: These results indicate that an HCV antigen ELISA can identify almost all (94%) of viraemic donations given during the seronegative window phase of infection. The performance of the HCV antigen ELISA appears to be suitable for large-scale screening of blood donations.     

Improved quantification of a commercial enzyme-linked immunosorbent assay kit for measuring anti-MDA5 antibody

Objectives: To compare the quantitative performance for measuring anti-MDA5 antibody titer of two enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) systems: an in-house ELISA and the commercial MESACUP^TM anti-MDA5 test.

Methods: Anti-MDA5 antibody titer was measured in sera from 70 patients with dermatomyositis using an in-house ELISA and the MESACUP^TM anti-MDA5 test side-by-side. For the commercial ELISA kit, serum samples diluted 1:101 were used according to the manufacturer’s protocol, but serial dilutions of sera were also examined to identify the optimal serum dilution for quantification.

Results: The anti-MDA5 antibody titers measured by the in-house and commercial ELISAs were positively correlated with each other (r?=?0.53, p?=?.0001), but the antibody titer measured by the commercial ELISA was less sensitive to change after medical treatment, and 37 (80%) of 46 anti-MDA5-positive sera had antibody titer exceeding the quantification range specified by the manufacturer (≥150 index). Experiments using diluted serum samples revealed that diluting the sera 1:5050 improved the quantitative performance of the MESACUP^TM anti-MDA5 test, including a better correlation with the in-house ELISA results and an increased sensitivity to change.

Conclusion: We improved the ability of the commercial ELISA kit to quantify anti-MDA5 antibody titer by altering its protocol.     

Clinical application of an enzyme-linked immunosorbent assay detecting hepatoma-specific γ-glutamyltransferase

Aim:  To develop a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) measuring hepatoma-specific datura stramonium agglutinin–tightly bounding γ -glutamyltransferase (DSA-GGT) and evaluate its clinical application for hepatocellular carcinoma (HCC) diagnosis.
Methods:  Serum DSA-GGT concentrations were measured with the sandwich ELISA system in 96 patients with HCC, 240 patients with chronic liver diseases and 119 healthy subjects. The diagnostic performance of DSA-GGT for HCC was assessed using receiver operating characteristic (ROC) curves. The diagnostic accuracy of DSA-GGT was compared with serum α-fetoprotein (AFP).
Results:  The area under the ROC curve of DSA-GGT in discriminating patients with HCC from non-HCC was 0.865 (95% confidence interval: 0.818–0.915, P  < 0.001). Serum DSA-GGT was positive in 67 out of 96 patients with HCC and 23 out of 240 patients with non-HCC diseases. The sensitivity and specificity of DSA-GGT and AFP for the diagnosis of HCC were 69.8% and 90.5%, and 72.9% and 89.1%, respectively. A higher sensitivity (93.8%) in the identification of HCC was observed by combining DSA-GGT and AFP.
Conclusion:  The sandwich ELISA system showed good reliability and reproducibility, and using the measurement, we found that serum DSA-GGT was a valuable marker of HCC, as a usable complementary to AFP. The sensitivity for identifying HCC could be significantly improved by combining DSA-GGT and AFP, and the combination could be used in large-scale screening for HCC in susceptible individuals.     

Combined use of an antigen and antibody detection enzyme-linked immunosorbent assay for cysticercosis as tools in an epidemiological study of epilepsy in Burundi

OBJECTIVE: To evaluate the benefits of the detection of both circulating antibodies (Ab) and antigens (Ag) for the diagnosis of cysticercosis in people with epilepsy. Neurocysticercosis is a cause of neurological diseases world-wide, especially epilepsy. The clinical symptoms of neurocysticercosis are non-specific and diagnosis is often difficult. METHODS: Serum samples were collected from subjects in a matched case-control study for epilepsy in the Kiremba area, Burundi, between March and April 2001 (epileptic cases=303; controls without epilepsy=606). The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used for the detection of antibodies (Ab-ELISA) and circulating Ag (Ag-ELISA). RESULTS: The Ab-ELISA revealed 58.7% positivity in epilepsy cases and 31.4% in healthy controls; and Ag-ELISA revealed 38.3% positivity in epilepsy cases and 20.0% in controls. The matched odds ratios were 3.6 (95% CI: 2.5-4.9) for Ab-ELISA, and 2.9 (95% CI: 2.1-4.3) for Ag-ELISA. CONCLUSION: Both Ag- and Ab-ELISA detected a significantly higher number of seropositives among people with epilepsy than among controls. The risk of epilepsy was high in cases with a positive Ag-ELISA, although less important than in cases with positivity for Ab-ELISA. Dead or degenerating cysticerci appear to be more frequently associated with epilepsy than living cysts. The high number of people with circulating Ag of Taenia solium suggests that the study area is a focus of active transmission of the parasite.     

粗提抗原检测炭疽血清抗体ELISA方法的初步评价

目的 对使用粗提抗原检测炭疽血清抗体的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法进行初步评价.方法 用间接ELISA方法检测人群血清(健康人血清42份、炭疽病人血清42份)特异性抗体,用阳性血清对照绘制标准曲线,按照标准曲线计算出每份血清标本的抗体相对含量,所得结果与重组致死因子(rLF)方法的检测结果进行比较.结果 病人组血清抗体相对含量中位数为1.19,健康人组血清抗体相对含量中位数为0.24,两组比较差异有统计学意义(uc=7.643,P＜0.05).粗提抗原检测与rLF检测结果并不完全对应,但两种方法显示出较高的一致性.结论 粗提抗原检测炭疽血清抗体的方法能区分大部分的病人和健康人,有一定的应用潜力,可用在炭疽疾病监测工作中.