KLF4反义基因对内皮细胞血管性血友病因子、纤溶酶原抑制物-1表达的影响

目的 探讨类果蝇分节因子4(Kroppel-like factor4,KLF4)反义基因对原代人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中血管性血友病因子(vWF)、纤溶酶原抑制物-1(PAI-1)表达的影响,明确KLF4在内皮细胞调节血栓形成中的作用.方法 胰蛋白酶消化法分离和培养原代HUVEC,采用同源重组方法 构建携带反义KLF4基因腺病毒,实时定量(Real-time)PCR、Western blot、激光共聚焦显微镜法检测转染KLF4反义基因后内皮细胞KLF4、PAI-1、vWF mRNA和蛋白的表达.结果 成功构建出携带反义KLF4基因片段的重组腺病毒(Ad-反义KLF4),以感染复数值200的重组腺病毒感染HUVEC,KLF4 mRNA相对表达水平由0.59±0.01下降至0.44±0.06,同时HUVEC中vWF mRNA相对表达水平升至1.17±0.05,与感染携带绿色荧光蛋白的腺病毒(Ad-GFP)组(1.04±0.03)相比,差异均具有统计学意义(P<0.05).而HUVEC中PAI-1 mRNA相对表达水平增加至0.73±0.01,与感染Ad-GFP组(0.67±0.04)相比,差异无统计学意义(P>0.05).与感染Ad-GFP组相比,感染Ad-反义KLF4的HUVEC中vWF、PAI-1蛋白表达水平明显增加.结论 KLF4反义基因可下调KLF4表达,促进内皮细胞中vWF、PAI-1的表达.KLF4可能参与内皮细胞抗栓作用的转录调节.     

人KLF4基因克隆及重组KLF4慢病毒表达载体的构建

背景：KLF4基因在细胞分化过程中有重要作用。目的：构建KLF4基因慢病毒过表达载体。方法：聚合酶链反应扩增（PCR）目的基因KLF4后插入慢病毒表达载体pCDH中,构建重组载体pCDH—KLF4。通过PCR、双酶切和DNA测序方法对其鉴定,共同转染293NT细胞包装病毒,荧光显微镜观察报告基因的表达情况,收集病毒上清,测定病毒的滴度。将重组的慢病毒感染5637细胞,RT—PCR检测KLF4mRNA的表达。结果与结论：重组慢病毒表达载体质粒经限制性酶切和DNA测序分析证实重组慢病毒载体pCDH-KLF4的插入序列完全正确,重组慢病毒载体感染5637细胞后,细胞内KLF4mRNA高表达。结果证实,实验成功构建KLF4基因慢病毒过表达载体。     

大鼠过氧化物酶体增生因子活化受体α基因重组腺病毒载体及在乳鼠心肌细胞中的表达

背景：过氧化物酶体增生因子活化受体α是调节心脏脂肪酸氧化的重要核转录因子,利用基因工程技术构建其重组腺病毒载体对研究心脏能量代谢障碍机制具有重要意义。目的：构建大鼠过氧化物酶体增生因子活化受体α基因重组腺病毒载体,评价其在原代培养的乳鼠心肌细胞中的表达效率。方法：采用RT-PCR法自SD大鼠肝脏扩增过氧化物酶体增生因子活化受体α基因,将其克隆至带有增强型绿色荧光蛋白的穿梭质粒载体pAd-Track-CMV。线性化重组穿梭质粒载体并转化入含有腺病毒骨架质粒pAd-Easy-1的感受态大肠杆菌BJ5183构建重组腺病毒载体质粒。用脂质体将线性化的重组腺病毒载体质粒转染于人胚肾293细胞以包装、扩增,纯化病毒后计算滴度。用纯化的重组腺病毒转染心肌细胞,荧光显微镜观察转染效率;荧光定量PCR、免疫印迹法检测细胞过氧化物酶体增生因子活化受体αmRNA、蛋白表达。结果与结论：成功构建携带大鼠过氧化物酶体增生因子活化受体α基因的重组腺病毒载体,病毒滴度为3.5×1011pfu/L。重组腺病毒转染心肌细胞的效率达90%以上,被转染细胞目的基因mRNA、蛋白表达显著增高。该载体的成功构建为研究过氧化物酶体增生因子活化受体α基因在心肌能量代谢障碍中的作用奠定基础。     

人Nanog基因重组腺病毒载体的构建及其在人脐带间充质干细胞中的表达

摘要:目的：构建重组人Nanog基因腺病毒载体(Ad-Nanog),转染人脐带间充质干细胞（hucMSCs）,用于后续研究。 方法：设计含有KpnⅠ及XhoⅠ酶切位点的引物,PCR扩增Nanog基因,将扩增产物亚克隆到pAdTrack-CMV穿梭质粒上,经双酶切和基因测序鉴定,重组穿梭质粒经PmeⅠ线性化后,在含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183中同源重组,筛选获得Ad-Nanog重组腺病毒质粒。经PacⅠ酶切线性化,脂质体转染293A细胞,包装和扩增病毒,并感染hucMSCs。 结果：重组腺病毒质粒经PCR和双酶切鉴定正确,测序结果和设计片段的序列一致。荧光显微镜下观察在感染的hucMSCs中绿色荧光蛋白高效表达。 结论：成功构建了Nanog腺病毒表达载体,能高效转染hucMSCs,可用于后续转基因的研究。     

重组腺病毒AdCat转染增加血管平滑肌细胞中过氧化氢酶表达

目的：制备含过氧化氢酶基因的重组腺病毒，转染血管平滑肌细胞，观察过氧化氢酶表达水平。方法：将过氧化氢酶cDNA亚克隆至pShuttle-CMV中，将其和pAdEasy-1在细菌内进行同源重组，构建重组腺病毒质粒pAdEasy-1-Cat，再转染Ad-293细胞，包装成重组腺病毒颗粒；经纯化获取重组腺病毒AdCat。转染血管平滑肌细胞，Westem blot鉴定细胞中过氧化氢酶表达。结果：正确构建了重组腺病毒载体，获得高滴度重组腺病毒，转染血管平滑肌细胞后过氧化氢酶高表达。结论：重组腺病毒AdCat转染增加血管平滑肌细胞中过氧化氢酶表达，为用过氧化氢酶基因进行再狭窄的防治打下了基础。     

人骨保护素基因重组腺病毒载体在大鼠骨髓基质细胞中的表达效率

目的：构建人骨保护素基因的重组腺病毒载体，并观察在大鼠骨髓基质细胞中的转染能力及表达效率。方法：实验于2004-03／2005-04在第三军医大学完成。采用基因工程技术，将人骨保护素基因片段插入到腺病毒载体质粒pAdTrack-巨细胞病毒上，利用PadEasy系统与骨架质粒在大肠杆菌BJ5183胞内进行同源重组，经293细胞包装、扩增，得到携带人骨保护素基因的重组腺病毒，将携带人骨保护素基因重组腺病毒对大鼠骨髓基质细胞进行感染。采用聚合酶链反应方法对重组腺病毒载体进行鉴定，利用绿色荧光报告基因转染结果，以荧光计数法检测重组腺病毒的滴度，应用Westernblot及酶联免疫吸附法检测骨保护素在大鼠骨髓基质细胞中的表达。结果：①酶切鉴定及聚合酶链反应结果证明人骨保护素基因重组腺病毒载体构建成功，病毒滴度可达2．5&;#215;10^9pfu／mL，具有很强感染能力。②人骨保护素基因重组腺病毒载体转染大鼠骨髓基质细胞后48h，Westernblot及酶联免疫吸附法可检测到人骨保护素的蛋白表达。结论：应用细菌内同源重组法，可成功构建含人骨保护素基因重组腺病毒载体，且能高效转染大鼠骨髓基质细胞。     

含人p27基因的重组腺病毒的构建及鉴定

目的:构建并鉴定含有人p27基因和EGFP基因的重组腺病毒载体,并观察其表达.方法 利用腺病毒载体系统Adeno-X,通过质粒抽提、电泳、酶切、连接、转化等多种基因工程技术,构建重组腺病毒质粒pAdeno-p27-EGFP;酶切、PCR鉴定重组腺病毒质粒;利用293细胞包装重组腺病毒载体PAd-p27-EGFP,通过荧光倒置显微镜观察EGFP的表达.结果:经酶切和PCR鉴定,成功构建重组腺病毒质粒pAdeno-p27-EGFP,利用脂质体转染人293细胞后,转染腺病毒质粒pAdeno-p27-EGFP可见EGFP表达和细胞致病效应(CPE).结论:利用腺病毒载体系统Adeno-X成功构建含CMV启动子的Flag-p27和EGFP基因的腺病毒载体,为进一步研究细胞周期调控与慢性移植物失功之间的关系,并为寻找慢性移植物失功的基因治疗的途径奠定基础.     

人分化抑制因子3重组腺病毒的制备及鉴定

目的构建人细胞分化抑制因子3(Id3)重组腺病毒载体,制备并鉴定人Id3重组腺病毒,为研究Id3基因在细胞中的表达及其对细胞功能的影响奠定基础。方法以pUC57-Id3为模板扩增人Id3基因,克隆到质粒pUC18中,pUC18-Id3经EcoR I和HindⅢ双酶切补平之后与载体pAxCAwtit连接,构建重组粘粒载体pAxCAwtit-Id3,包装试剂盒包装重组粘粒,转染大肠埃希菌,鉴定正确后大量制备重组pAxCAwtit-Id3,经酶切线性化后,用脂质体法转染HEK293A细胞,包装成重组腺病毒Ad-Id3,制备高滴度的重组腺病毒Ad-Id3,利用TCID50法计算重组腺病毒滴度,经RT-PCR及western blot检测Id3基因的表达。结果Id3基因成功克隆到腺病毒载体中,重组腺病毒滴度为1.8×1010PFU/ml,用RT-PCR检测到Id3基因的转录产物,westernblot检测到Id3在A549细胞中的高水平表达。结论成功构建Ad-Id3重组腺病毒载体,并在A549细胞中得到高效表达。     

大鼠过氧化物酶体增生因子活化受体α基因重组腺病毒载体及在乳鼠心肌细胞中的表达☆

背景:过氧化物酶体增生因子活化受体α是调节心脏脂肪酸氧化的重要核转录因子,利用基因工程技术构建其重组腺病毒载体对研究心脏能量代谢障碍机制具有重要意义. 目的:构建大鼠过氧化物酶体增生因子活化受体α基因重组腺病毒载体,评价其在原代培养的乳鼠心肌细胞中的表达效率. 方法:采用RT-PCR法自SD大鼠肝脏扩增过氧化物酶体增生因子活化受体α基因,将其克隆至带有增强型绿色荧光蛋白的穿梭质粒载体pAd-Track-CMV.线性化重组穿梭质粒载体并转化入含有腺病毒骨架质粒pAd-Easy-1的感受态大肠杆菌BJ5183构建重组腺病毒载体质粒.用脂质体将线性化的重组腺病毒载体质粒转染于人胚肾293细胞以包装、扩增,纯化病毒后计算滴度.用纯化的重组腺病毒转染心肌细胞,荧光显微镜观察转染效率;荧光定量PCR、免疫印迹法检测细胞过氧化物酶体增生因子活化受体α mRNA、蛋白表达. 结果与结论:成功构建携带大鼠过氧化物酶体增生因子活化受体α基因的重组腺病毒载体,病毒滴度为3.5×1011 pfu/L.重组腺病毒转染心肌细胞的效率达90%以上,被转染细胞目的基因mRNA、蛋白表达显著增高.该载体的成功构建为研究过氧化物酶体增生因子活化受体α基因在心肌能量代谢障碍中的作用奠定基础.     

Ad-vcam-1-gfp重组腺病毒转染人脐血源基质细胞的实验研究

本研究探讨血管细胞黏附分子（vcam-1）修饰的人脐血源基质细胞（human umbilical cord blood derived strom cells，CBDSC）在造血调控中的作用。采用DNA重组技术，将目的基因vcam-1克隆至含有报告基因gfp的穿梭质粒；在BJ5183细胞中与pAdeasy—1质粒进行同源重组，产生重组腺病毒载体转染人脐血源基质细胞并进行鉴定。结果表明：vcam-1基因与pAdTrack—CMV载体成功连接，经NotⅠ／XhoⅠ双酶切后电泳可见2个大小约为9kb和2kb左右条带，经PCR法扩增后电泳可见1个600bp左右条带，证明pAdTrack—CMV—vcam-1重组质粒构建成功。pAdTrack—CMV—vcam-1质粒与pAdeasy—1质粒同源重组后，产物经PACⅠ酶切后电泳可观察到2个大小约为31kb、4kb左右条带，与预期结果相符。腺病毒载体转染人脐血源基质细胞后免疫化学、RT—PCR、荧光显微镜等方法均检测到目的基因vcam-1的表达。结论：构建ad—vcam-1-gfP重组腺病毒载体可成功转染人脐血源基质细胞并使其vcam-1表达增高。     

趋化因子受体4基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

背景：目前研究发现,基质细胞衍生因子1/趋化因子受体4轴具有介导骨髓间充质干细胞定向迁移的作用。目的：构建小鼠趋化因子受体4基因重组腺病毒载体。方法：从C57BL/6小鼠中提取总RNA,以RT-PCR方法获得小鼠趋化因子受体4基因全长1080bp的完整编码序列,通过穿梭质粒pAdTrack-CMV,将目的片段克隆入AdEasy-1腺病毒DNA中,获得重组腺病毒DNA,通过脂质体转染293细胞,经包装扩增后,获得重组腺病毒pAdTrack-CMV-CXCR4,并感染293细胞,PCR鉴定、Western blot检测蛋白表达。结果与结论：含趋化因子受体4基因的重组腺病毒pAdTrack-CMV-CXCR4构建成功,经PCR鉴定鉴定重组病毒中含有趋化因子受体4cDNA全长,经序列测定表明趋化因子受体4cDNA序列正确无丢失和错配现象,病毒滴度高,Western blot检测感染后293细胞趋化因子受体4的蛋白表达较未感染293细胞明显增加。     

VEGF165基因重组腺病毒载体的构建及其促血管形成作用

目的构建携带人血管内皮细胞生长因子165（VEGF165）基因的腺病毒表达载体（Ad—VEGF165）,并观察其感染QBI．293A靶细胞后目的基因的表达及促进血管形成的作用。方法以含有VEGF165基因片段的pSV-K3-VEGF165质粒为模板,PCR扩增获得的VEGF165目的片段（XhoI、EcoRV）亚克隆至GFP标记的pAdTrack—CMV载体中构建重组转移质粒pAdTrack．CMV．VEGF165,行PCR、双酶切和DNA测序鉴定。将测序正确的pAdTrack—CMV．VEGFl65质粒经PmeI线性化后与腺病毒骨架质粒pAdEasy．1共转化BJ5183细菌,获得同源重组腺病毒质粒pAdEasy-1．pAdTrack-CMV．VEGF165（pAd．VEGF165）,再经PacI线性化后用脂质体转染QBI．293A包装细胞,通过多轮扩增和氯化铯密度梯度离心纯化获得Ad．VEGFl65重组腺病毒。RT．PCR和ELISA检测腺病毒介导的外源性VEGFl65基因在QB｜．293A细胞中的转录和表达。将孵育8d的生长状态良好的鸡胚随机分成Ad空载体腺病毒组、Ad—VEGFI65重组腺病毒组、NS组。采用鸡胚尿囊膜（CAM）法检测VEGF165重组腺病毒促进尿囊膜血管形成活性。结果PCR、双酶切和测序鉴定结果证实成功构建了pAdTrack．CMV—VEGF165重组转移质粒,并获得了高滴度的Ad．VEGF165重组腺病毒,其病毒效价可达2×10^10pfu／mL。Ad-VEGFl65感染后,QBI．293A细胞中的VEGF165含量较QBI．293A细胞对照组和Ad空病毒感染组均明显升高（P〈0．05）。Ad-VEGF165组与Ad．空载体组和NS组比较,CAM三级分支血管生长更旺盛,毛细血管更丰富（P〈0．05）。结论成功获得了携带人VEGF165基因的腺病毒表达载体,具有明显的促CAM血管形成活性,为进一步开展VEGF165基因修饰干细胞的应用研究奠定了实验基础。     

Effect of antisense KLF4 gene on the expression of vWF and PAI-1 in endothelium cells

OBJECTIVE: To investigate the effect of antisense KLF4 (Krüppel-like factor 4) gene on the expression of vWF and PAI-1 in endothelial cells. METHODS: Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were isolated from umbilical vein and cultured in endothelial cell medium. The recombinant adenoviral plasmid carrying the antisense KLF4 gene was constructed by homologous recombination. KLF4, PAI-1 and vWF mRNAs and proteins expression were detected by real time-PCR, Western blot, and confocal laser microscopy. RESULTS: Recombinant adenoviral plasmid carrying the antisense KLF4 gene (Ad-KLF4AS) was constructed successfully. Compared with the control Ad-GFP infection group, Ad-KLF4AS at a 200 MOI can down-regulate the expression of KLF4 gene in HUVEC (from 0.59 ± 0.01 to 0.44 ± 0.06) (P < 0.05), and increase vWF mRNA (from 1.04 ± 0.03 to 1.17 ± 0.05) and protein expression (P < 0.05). PAI-1 mRNA and protein of Ad-KLF4AS infection group was higher than that of Ad-GFP infection group. PAI-1 mRNA between the two groups had no significant difference (P > 0.05). CONCLUSIONS: Down-regulation of KLF4 leads to increase in expression of vWF and PAI-1 in endothelial cells. KLF4 might play an important role in regulation of endothelial coagulant function.     

人骨形态发生蛋白2基因重组腺病毒表达载体转染兔骨髓间充质干细胞

背景：采用GatewayTM技术构建腺病毒载体,显著弥补了外源性细胞因子局部应用的缺陷。目的：观察人骨形态发生蛋白2重组腺病毒表达载体（Ad-BMP-2/GFP）转染兔骨髓间充质干细胞后骨形态发生蛋白2的表达情况。方法：密度梯度离心联合贴壁培养法,分离、培养、纯化兔骨髓间充质干细胞;GatewayTM技术构建的Ad-BMP-2/GFP腺病毒载体转染兔骨髓间充质干细胞。结果与结论：RT-PCR检测转染诱导后的细胞表达成骨细胞特异性产物骨钙素;转染后兔骨髓间充质干细胞在mRNA水平和蛋白水平均有人骨形态发生蛋白2的表达。结果表明构建的Ad-BMP-2/GFP可高效转染兔骨髓间充质干细胞,骨形态发生蛋白2在细胞中能高效表达。     

应用AdEasy腺病毒载体系统构建鼠白细胞介素10基因重组腺病毒

目的：AdEasy系统可在原核细胞E．coli BJ5183中完成穿梭质粒与骨架质粒之间的高效同源重组，经抗生素培养板筛选重组体，然后转染293细胞获得重组病毒，极大简化了载体的构建过程。实验利用AdEasy腺病毒载体系统构建鼠白细胞介素10基因重组腺病毒。 方法：实验于2006—08／2007—05在青岛大学医学院病毒学实验室完成。①实验材料：清洁级SD大鼠5只，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。腺病毒穿梭质粒pAdTrack—CMV，骨架质粒pAdeasy—1，大肠杆菌BJ5183和DH10B，人胚肾293细胞均由青岛大学医学院微生物教研室罗兵教授惠赠。②实验方法；从脂多糖刺激培养的大鼠脾细胞中提取细胞总RNA，应用反转录多聚酶链反应技术扩增白细胞介素10cDNA，定向亚克隆至pAdtrack—CMV中构建腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV-IL-10，酶切线性化后转化到含腺病毒骨架质粒pAdEasy的BJ5183大肠杆菌中，获得重组腺病毒质粒pAd-IL-10，Lipofectamin包装转染293细胞，获得重组腺病毒vAd—IL—10，荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。将293细胞接种丁96孔板中，每孔1×10^4个细胞，浓缩后的病毒贮存液按不同比例稀释加至培养板中，测定重组腺病毒滴度。用重组腺病毒vAd—IL-10感染293细胞3d后，以TRIzol一步法提取细胞总RNA，所获RNA加入DNaseⅠ消化处理可能污染的DNA后，PCR产物行琼脂糖电泳检测白细胞介素10mRNA的表达。 结果：①重组腺病毒的包装及滴度测定：经限制性内切酶转染293细胞16h后，荧光显微镜观察到细胞中有GFP荧光，可间接反映目的基因的表达。将病毒上清反复感染293细胞扩增重组腺病毒，通常传至第4～5代于接种病毒后24—48h，几乎可观察到所有细胞出现荧光，此时收获病毒，重组病毒命名为vAd—IL-10。vAd—IL—10滴度为5．5×10^8pfu／mL，vAd—GFP滴度为9．0×10^8pfu／mL?     

可诱导表达mIL-12单链融合蛋白的腺病毒载体的构建

目的：构建带mIL-12单链融合蛋白基因并可经RU486诱导表达的重组腺病毒载体,以期用于体内的基因治疗研究。方法：利用分子生物学技术，构建了穿梭质粒PDC-RUmIL-12，使mIL-12单链融合蛋白基因和启动子在RU486诱导表达系统调控之下，酶切、测序鉴定正确后，将其与Admax腺病毒包装系统的辅助质粒共转染293细胞后，构建出可调控的重组腺病毒载体。用mIL-12引物对病毒进行了鉴定,扩增后用氯化铯密度梯度离心纯化病毒，采用最终稀释法测定了其滴度，并在结肠癌SW620细胞中用westen blot和ELISA方法检测了其基因调控效果。结果：经PCR鉴定证实可调控腺病毒载体Ad-RUmIL-12构建正确，病毒滴度达到4.62×1010pfu/ml。当给予诱导剂RU486后，腺病毒载体可以诱导表达mIL-12单链融合蛋白，表达量随着诱导剂浓度而增加，而没有RU486时，几乎没有mIL-12蛋白的表达。结论:成功构建了重组腺病毒 Ad-RUmIL-12，可以通过RU486诱导mIL-12单链融合蛋白的表达，为下一步体内基因治疗奠定了良好的基础。     

携带人OCT4A基因的慢病毒载体的构建及其稳定转染K562白血病细胞株的建立

本研究旨在构建共表达人OCT4A与绿色荧光蛋白（GFP）慢病毒载体pLVX-OCT4A-ZsGreen1,并通过感染获得稳定表达重组质粒的白血病K562细胞系,观察OCT4A在其中的表达。根据Gen Bank数据库提供的OCT4A mRNA序列,合成编码mRNA基因的特异性引物序列,通过RT-PCR技术扩增出OCT4A全长片段,克隆至pCR-Blunt载体。将OCT4A DNA片段酶切回收后克隆至经EcoR1酶切线性化的慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1,构建pLVX-OCT4A-ZsGreen1慢病毒重组质粒,利用测序鉴定所构建的重组载体是否正确。经三质粒包装系统包装后获得高滴度慢病毒颗粒并感染人白血病细胞系K562,通过流式细胞仪分选获得稳定表达的白血病细胞系,应用Real-time PCR和Western blot方法分别检测稳定转染细胞系的OCT4A mRNA和OCT4A蛋白表达。应用CCK-8法和平板细胞克隆形成试验测定OCT4A对K562细胞增殖能力的影响。结果表明,经限制性内切酶检测及基因测序证实成功构建了携带OCT4A基因的重组慢病毒;包装病毒颗粒超速离心后病毒滴度达（1.43±0.25）×10^8U/ml;病毒感染K562细胞后经流式细胞仪分选获得GFP＋细胞,实时定量PCR及Western blot证实病毒感染后OCT4A基因及蛋白的表达可有效上调;CCK-8法及平板集落形成试验显示病毒感染的K562细胞体外增殖活性明显升高,与对照组相比均有统计学差异（P〈0.05）。结论：成功构建了表达OCT4A基因的慢病毒载体,并且获得可稳定上调OCT4A表达的K562细胞株。