人胰岛素瘤相关蛋白-2基因的克隆及原核表达研究

目的：克隆1型糖尿病自身抗原人胰岛素瘤相关蛋白-2(IA-2)的编码基因，并从大肠杆菌中表达具有免疫原性的人IA-2重组蛋白。方法：抽提胎脑总RNA，通过RT—PCR获得编码IA-2胞内结构域的cDNA，与Pinpoint Xa-IT质粒相连接，构建表达型重组质粒，经转化、筛选并鉴定后，从大肠杆菌诱导表达生物素酰化融合蛋白，进而用亲和层析纯化之，以dot—blot鉴定其免疫原性。结果：重组质粒转化的大肠杆菌经IPTG诱导表达及亲和层析后得到了纯度较高、分子量约为59kd的融合蛋白，表达产物用dot—blot证明具有免疫原性。结论：原核表达的生物素酰化人IA-2胞内段融合蛋白具有正确的免疫学构象。     

人CTLA-4胞外区cDNA的克隆及Ig融合蛋白表达载体的构建

目的 克隆人ＣＬＴＡ－４胞外区ｃＤＮＡ－４胞外区与人免疫球蛋白ＩｇＧ Ｆｅ融合蛋白表达载体,为研究ＣＴＬＡ－４／Ｉｇ融合蛋白及其临床应用奠定基础。方法 从抗人ＣＤ３单克隆抗体和ＰＭＡ活化的健康人中国外周血淋巴细胞总ＲＮＡ中,扩增人ＣＴＬＡ－４基因胞外区ｃＤＮＡ片段,经ＨｉｎｄⅢ＋ＢｃｌⅠ双酶切后定向插入Ｉｇ融合蛋白表达载体。结果 从活化人Ｔ细胞中扩增出人ＣＴＬＡ－４胞外区ｃＤＮＡ片段,并将其正确插     

人ALEX2部分cDNA序列的克隆与表达

目的：克隆人ALEX2基因部分片段的cDNA,构建重组表达载体并诱导其表达．方法：通过RT—PCR技术从人胚胎脑组织中特异扩增出ALEX2基因部分编码序列片断(630—1058位核苷酸),克隆入pGEM—Teasy载体中,测序后亚克隆于表达载体pGEX-4T-3中,酶切鉴定正确,转化大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导4h后,可表达Mc417000的目的蛋白．结果：特异扩增出大小约440bp的片断,经测序与已知序列完全一致,构建了融合蛋白的重组表达质粒PGEX-ALEX2,表达的融合蛋白产物经凝胶薄层扫描检测,占菌体总蛋白量的15．5%．结论：获得了人ALEX2部分基因编码片断及其原核表达产物,为下一步ALEX2 mAb的制备和研究其生物学功能奠定了基础．     

凋亡相关蛋白Apr-2的克隆、测序及初步表达

目的: 从HL-60细胞凋亡模型中克隆凋亡相关蛋白Apr-2编码区基因,并对其进行表达,为进一步研究Apr-2的结构功能及多克隆抗体的制备奠定基础.方法: 建立HL-60细胞凋亡模型,提取HL-60凋亡细胞总RNA,以RT-PCR方法获取Apr-2 cDNA编码区全序列,将其与PGEM-T Easy载体连接,转化E.coli DH5α,构建重组克隆载体PGEM-TEasy/apr-2,测序正确后,将目的片段亚克隆入PGEX-4T-2原核表达载体,并转化大肠杆菌, IPTG诱导重组蛋白质表达,分析蛋白质在细菌中的表达分布,进行凝胶自动扫描分析. 结果:序列分析表明,与GenBank中已登录的Apr-2 cDNA编码区序列比较,完全一致.表达的融合蛋白占菌体总蛋白质的40%以上,主要以包涵体的形式存在. 结论:成功的获得了细胞凋亡模型HL-60中Apr-2 cDNA编码区的克隆及其融合蛋白表达产物.     

人胰岛素瘤相关蛋白-2基因的克隆及原核表达研究

目的克隆1型糖尿病自身抗原人胰岛素瘤相关蛋白-2(IA-2)的编码基因,并从大肠杆菌中表达具有免疫原性的人IA-2重组蛋白.方法抽提胎脑总RNA,通过RT-PCR获得编码IA-2胞内结构域的cDNA,与Pinpoint Xa-1T质粒相连接,构建表达型重组质粒,经转化、筛选并鉴定后,从大肠杆菌诱导表达生物素酰化融合蛋白,进而用亲和层析纯化之,以dot-blot鉴定其免疫原性.结果重组质粒转化的大肠杆菌经IPTG诱导表达及亲和层析后得到了纯度较高、分子量约为59kd的融合蛋白,表达产物用dot-blot证明具有免疫原性.结论原核表达的生物素酰化人IA-2胞内段融合蛋白具有正确的免疫学构象.     

BMP-4cDNA的克隆表达及活性的初步测定

目的：利用原核基因工程生产有诱骨活性的骨形态发生蛋白－4（BMP－4），方法：应用RT－PCR技术，从成熟人的胎盘组织中扩增出长0．34Kb编码入骨形态发生蛋白－4成熟肽的基因序列，经测序证实后，装入表达载体pET-22b，诱导表达后SDS－PAGE显示在14kd处有一明显的表达条带，经初步鉴定，证实表达蛋白部分位于裂菌处理后的上清中，部分以包涵体的形式存在于沉淀中，将沉淀中的包涵体蛋白纯化，变性和复性处理，和上清中的蛋白分别经真空冷冻干燥后，植入小鼠的肌肉内检测蛋白活性。结论：第14d和21d，组织切片可见骨细胞和骨基质的形成，结论：大肠杆菌表达的BMP－4的经复性处理后具有诱骨活性。     

人单核细胞趋化蛋白1基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的：克隆表达具有重要生物功能的人单核细胞核细胞趋化蛋白１（ｈｕＭＣＰ－１）。方法：从人外周血单核细胞（ＰＢＭＣ）中提取ｐｏｌｙ（Ａ）＾＋ＲＮＡ,用ＲＴ－ＰＣＲ法扩增出ｈｕＭＣＰ－１ｃＤＮＡ。将ｈｕＭＣＰ－１ｃＤＮＡ插入融合表达载体ｐＧＥＸＩＮ,１ｍｍｏｌ／Ｌ异丙基－β－Ｄ－硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导后获得高效表达。结果：Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ证明与ｈｕＭＣＰ－１单克隆抗体有明显交叉反应。结论     

人硫氧还蛋白还原酶cDNA的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的：克隆人硫氧还蛋白还原酶(TR)基因并构建原核表达载体，获得TR蛋白。方法：采用反转录聚合酶链式反应(RT—PCR)技术，从人胚脑组织中扩增出TRcDNA片段，克隆至pGEM—T载体并转化大肠杆菌DH5α，获得重组质粒pGEM—TR；经序列分析证实后，提取pGEM—TR重组体，由双酶切得到目的片段，并插入pET9c原核表达质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组质粒pET—rhTR。异丙基硫代—β—D—半乳糖苷(IPTG)诱导pET—rhTR在BL21中表达，用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及免疫蛋白印迹(Western blot)分析重组蛋白。结果：克隆的TRcDNA与人胎盘组织TRcDNA同源性为99％；pET—rhTR在大肠杆菌中高效表达，目的蛋白占菌体总蛋白量的36％，其分子质量为55ku。TRcDNA序列被GenBank收录，登录号为AF208018。结论：成功克隆了人脑组织来源的TR基因，该基因在大肠杆菌中得到高表达，为进一步研究其功能奠定基础。     

人B7.2cDNA的克隆及其核表达

为克隆人Ｂ７．２ｃＤＮＡ，构建Ｂ７．２真核表达质粒，并在哺乳动物细胞中表达。分离正常人淋巴结淋巴细胞，经ＬＰＳ诱导后，以ＲＴ－ＰＣＲ，克隆Ｂ７．２ｃＤＮＡ；构建真核表达质粒ｐＢＣＭＧＳＮｅｏ－Ｂ７．２，转染哺乳细胞，进行表达。结果成功克隆了Ｂ７．２ｃＤＮＡ，并经测序证实：所构建的Ｂ７．２抗原真核表达质粒可在哺乳动物细胞中高效表达。表明经ＬＰＳ诱导的人淋巴细胞可表达Ｂ７．２ｍＲＮＡ，所建立的ｐＢＣＭ     

人颗粒溶解素cDNA克隆及在大肠埃希菌中的表达

目的：构建颗粒溶解素(granulysin)cDNA原核表达载体并进行表达。方法：采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术获得颗粒溶解素cDNA，克隆到pGEM-T载体，测序正确后，再亚克隆到质粒pGEX-4T1中，构建重组表达载体pGEX-4T1-granulysin，并转化大肠埃希菌DH5α，诱导GST-granulysin融合蛋白表达。结果：诱导含重组表达载体pGEX-4T1-granulysin的大肠埃希菌DH5α后，免疫印迹显示出一条相对分子量(Mr)为44000的蛋白条带。结论：获得了颗粒溶解素与GST的融合蛋白,为进一步的工作打下了基础。     

人NDRG4-B cDNA克隆和表达

目的：获得NDRG4-B(N-myc downstream-regulated gene 4-B)的编码基因，表达NDRG4-B蛋白。方法：以成人脑cDNA文库为模板，通过PCR方法扩增NDRG4-B编码基因，克隆至pMD18-T载体并测序，再亚克隆至表达载体pRSET-A，转化大肠杆菌，IPTG诱导表达6His-NDRG4-B融合蛋白。结果：从成人脑cDNA文库中扩增出编码NDRG4-B的cDNA，序列测定证实有两个沉默突变(从ATG开始，第765bp处：G→A；966bp处：A→G)；成功构建了pRSET-A融合表达载体NDRG4-B-pRSET-A；表达了6His-NDRG4-B融合蛋白。结论：克隆与表达了人NDRG4-B。     

重组人TALL-1基因全长及其胞外区片段的克隆和表达

目的　获得人TALL 1基因全长及其胞外区片段 ,构建重组表达载体并对其诱导表达。方法　利用RT PCR技术从人外周血单个核细胞中扩增出TALL 1全长及其胞外区基因编码区序列 ,克隆于载体pGEX 4T 1中 ,测序证实序列正确后转化大肠杆菌BL2 1,以IPTG诱导表达 ,SDS PAGE和Westernblot分析表达产物。结果　①从人外周血单个核细胞中扩增出编码TALL 1基因全长及其胞外区片段cDNA序列 ,序列测定证实与文献报道的序列一致 ;②成功构建了GST融合表达载体pGEX 4T 1 hTALL 1和pGEX 4T 1 sTALL 1;③表达了hTALL 1 GST和sTALL 1 GST融合蛋白。结论　人TALL 1基因全长及其胞外区片段的克隆成功及融合蛋白的表达 ,为进一步探索TALL 1抗原表位打下了基础。     

杀菌/通透性增强蛋白N端cDNA的克隆和表达

目的　克隆杀菌 /通透性增强蛋白 (BPI) N端 c DNA,构建原核和真核表达载体 ,分别在大肠杆菌和 CHO细胞中表达 BPI蛋白 .方法　提取正常人外周血多形核粒细胞 (PMN)总 RNA,经套式 RT- PCR法扩增出 BPI N端 c DNA片段 ,将其克隆入 p GEM- T easy载体中并进行酶切鉴定和序列测定 .然后亚克隆入 p GEX- 4T- 1质粒 ,转化大肠杆菌 ,进行诱导表达 ,表达产物用 Western blot法鉴定 .同时将该基因片断克隆入 pc DNA3质粒 ,通过脂质体转染 CHO细胞 ,免疫荧光法鉴定 BPI的表达 .结果　获得 BPI N端长度为 72 6 bp的基因片断 .序列分析证实该片断中有 4个点突变 ,但均不在活性中心 .在大肠杆菌中的表达产物为相对分子质量 5 1× 10 3的GST- BPI融合蛋白 ,Western blot反应中在 5 1× 10 3处有显色区带 .G418筛选出的阳性 CHO细胞在免疫荧光反应中产生荧光反应 .结论　我们成功的在大肠杆菌和 CHO细胞中表达了 BPI2 5蛋白 ,为进一步研究 BPI生物学功能奠定了基础     

人CDC2基因的克隆和原核表达及鉴定

目的：从人肝癌组织中克隆出人细胞分裂周期基因2（ CDC2）,并在大肠杆菌中表达CDC2蛋白。方法：从人肝癌组织中提取RNA,采用RT-PCR法扩增CDC2 cDNA,用DNA凝胶回收试剂盒纯化并回收RT-PCR产物,将RT-PCR产物插入pET28a(+)载体NdeⅠ和 XhoⅠ两酶切位点之间,转化大肠杆菌BL21(DE3);IPTG诱导表达人CDC2蛋白。结果：RT-PCR扩增出约894 bp的DNA片段,与GenBank中的CDC2基因序列完全一致。经限制性内切图谱和测序鉴定,成功构建了pET28a(+)/CDC2原核表达载体。SDS-PAGE分析结果显示人CDC2蛋白在大肠杆菌中得已表达。结论：从人肝癌组织中成功地扩增出CDC2基因,并在大肠杆菌中表达。     

人破骨细胞形成抑制因子成熟肽基因在大肠杆菌中的融合表达

目的:在大肠杆菌中高效融合表达人破骨细胞形成抑制因子(osteoclastogenesis inhibitory factor,OCIF)成熟肽基因.方法:利用PCR从人肝细胞文库中扩增得到OCIF成熟肽编码基因序列,将其与pMD18-T连接,转化大肠杆菌K802,筛选得到阳性重组克隆载体pMD18-OCIFm,双酶切重组克隆质粒pMD18-OCIFm得到OCIF成熟肽基因,将其定向插入pMAL-c2载体中,转化大肠杆菌TB1.筛选得到阳性重组表达子后进行诱导表达.结果:所获得的OCIF成熟肽基因编码序列经测序与GenBank报道的完全一致.所表达的产物经SDS-PAGE分析可见在相对分子质量80000处出现一条特殊条带,与预期的相对分子质量一致.Western印迹证实了表达产物的正确.表达产物在高剂量(＞120ng/L)时可诱导体外培养小鼠成熟破骨细胞的凋亡.结论:成功获得了人OCIF成熟肽基因的克隆并实现了其在大肠杆菌中的融合表达.     

人白细胞介素15基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的 克隆人白细胞介素（IL）15全长cDNA,并在大肠杆菌中表达。方法从人外周血分离的淋巴细胞中提取总RNA,通过RT—PCR扩增出hIL-15全长cDNA。构建到原核表达载体pET28a（＋）中,通过卡那霉素平板筛选及PCR鉴定,挑出阳性克隆进行扩增,DNA测序正确后,转化到大肠杆菌BL21（DE3）中,扩增后IPTG诱导表达。通过SDS-PAEG及Western-blot方法鉴定表达的融合蛋白。结果 成功构建人IL-15表达载体,并表达于大肠杆菌中。SDS—PAEG及Western-blot分析显示表达的融合蛋白分子量为16．1ku,与理论值相符。结论 获得了hIL-15融合蛋白,为hIL-15单克隆抗体的制备及其功能研究奠定了基础。