大鼠脑出血周边组织TNF-α、ICAM-1的表达及NAC对其变化的影响

目的:研究大鼠脑出血周边组织细胞凋亡及TNF-α、ICAM-1(细胞粘附因子-1)的表达机制,探讨NAC(N-乙酰-L-半胱氨酸)抗细胞凋亡作用和对TNF-α、ICAM-1表达的干预机制.方法:Wistar大鼠105只,随机分为对照组,脑出血组,脑出血 NAC组,各分为(出血6h,12h,24h,48h,3d,5d,7d)七个时间点.采用立体定位注入自体未肝素化动脉血复制脑出血模型.采用免疫组化染色法检测脑组织ICAM-1的表达;利用原位末端标记法检测出血周边组织神经细胞的凋亡.结果:①脑出血后6h血肿周边组织TNF-α开始表达,48h达高峰,12hICAM-1开始表达,72h达高峰.各组与对照组之间有显著差异(均P＜0.05).②大鼠脑出血周边组织6h出现凋亡细胞,12h上升显著,3d凋亡细胞达峰值,7d仍有凋亡细胞表达.③NAC干预后周边组织TNF-α、ICAM-1表达阳性细胞数及凋亡细胞数与脑出血组对应时间点比较显著下降(P＜0.05).结论:①细胞因子TNF-α、ICAM-1参与了脑出血周边组织炎性反应损伤.②脑出血周边组织存在着细胞凋亡病理生理过程.③NAC可抑制细胞因子TNF-α、ICAM-1表达,同时具有抗细胞凋亡作用,可改善脑出血预后.     

新型水蛭肽嵌合蛋白治疗脑出血后脑水肿的实验研究

目的探讨新型基因工程药物水蛭肽嵌合蛋白（TNHH）对大鼠脑出血后脑水肿的治疗作用及其机制。方法将96只成年雄性SD大鼠随机分为假手术组、脑出血模型组、TNHH组,以自体血注入大鼠尾状核方法建立脑出血模型,假手术组只进针不注血。TNHH组静脉注射TNHH（2mg／kg）,分别于造模前30min及造模后每12h给药1次。于6,24,72,168h时分别用Longa标准测定神经功能缺损,干、湿重法检测脑含水量,分光光度法测定脑血肿周围脑组织髓过氧化物酶（MPO）活性。结果与假手术组相比,脑出血模型组大鼠神经功能缺损评分、脑含水量、MPO活性均显著增高（P〈0．05或P〈0．01）;与脑出血模型组相比,TNHH组大鼠神经功能缺损评分、脑含水量、MPO活性显著下降（P〈0．05或P〈0．01）。结论TNHH对大鼠脑出血后脑水肿有治疗作用,其机制可能与抑制凝血酶活性、降低中性粒细胞浸润有关。     

大鼠脑出血后IL-1β表达及其与凝血酶的关系

目的 观察大鼠实验性脑出血(ICH)后不同时间点血肿周围组织白细胞介素1β(IL-1β)炎性细胞表达及其与凝血酶的关系.方法 免疫组化法观察ICH后不同时间点血肿周围IL-1β的表达情况及凝血酶对其表达的影响.结果 在造模后1 h,ICH组和凝血酶组血肿周围即可见IL-1β炎性细胞表达,6 h达高峰,以后逐渐下降,48 h无阳性细胞表达.在相应时间点,水蛭素组血肿周围IL-1β的表达水平均明显低于脑出血组(P＜0.01),且细胞着色浅.假手术组仅有少量阳性细胞表达.结论 IL-1β参与ICH后脑损伤,凝血酶可能通过促进IL-1β的表达而产生ICH后脑损伤作用.     

腺苷2A受体在小鼠全肝缺血-再灌注损伤中的表达及意义

目的 探讨在小鼠全肝缺血-再灌注(I-R)前后肝组织内腺苷2A受体的动态表达趋势,以及与肝脏组织炎症反应的关系.方法 分别检测缺血前、缺血20 min、再灌注0、1、3、6、12、18、24 h后肝脏A2AR蛋白表达和肿瘤坏死因子α(TNF-α)、巨噬细胞炎性蛋白2(MIP-2)、细胞间黏附分子(ICAM-1)含量以及组织髓过氧化物酶(MPO)活性的变化.结果 A2AR表达于再灌注后12 h达高峰,随后逐渐下降,再灌注24 h降至正常以下水平.而TNF-、MIP-2和ICAM-1含量于再灌注后表达逐渐增高,3～6 h达到高峰,随后逐渐降低.MPO的活性趋势与炎性因子基本一致.结论 I-R后组织炎症可能诱导了A2AR表达升高,从而抑制炎性因子的表达及组织炎性损伤.     

凝血酶诱导血管内皮细胞生长因子的表达及水蛭素的抑制作用

目的:研究凝血酶对血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响及重组水蛭素的作用.方法:将原代培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的第2～5代与凝血酶(4.0u*mL-1)共同孵育,按不同分组加入水蛭素(6.0u*mL-1)和肝素(6.0u*mL-1).在不同时间,通过MTT比色检测细胞生长活性,以检测细胞损伤程度;用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法评价VEGF mRNA的表达.结果:凝血酶对血管内皮细胞损伤的作用从2h即可出现,24h开始减轻.凝血酶对VEGF的表达呈现双峰状:诱导后1h即有VEGF表达增高,2h减低后再次升高,24h达最高.重组水蛭素可以有效地阻断凝血酶的上述作用.结论:凝血酶诱导HUVECs损伤并显著上调VEGF mRNA的表达,该过程可被水蛭素有效抑制.     

水蛭素对凝血酶诱导血管内皮细胞与中性粒细胞表达黏附分子的影响

目的:研究水蛭素对凝血酶诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)表达细胞黏附分子(ICAM-1)和中性粒细胞表达膜整合素CD11b的影响.方法:用酶消化法获得HUVEC,密度梯度离心和重力沉降法分离人外周血细胞中性粒细胞.用酶联免疫吸附测定HUVEC在凝血酶、水蛭素作用下ICAM-1的变化,同时以免疫荧光流式细胞术检测中性粒细胞表达CD11b水平的变化.结果:与对照组相比,凝血酶诱导的HUVEC 表达ICAM-1显著增多,随时间延长,ICAM-1的表达递增,高峰在24 h.凝血酶使中性粒细胞CD11b的表达也显著上调,6 h平均荧光强度明显增加,随时间延长逐渐升高,高峰在24 h.水蛭素和肝素对凝血酶诱导的HUVEC 表达ICAM-1和中性粒细胞表达CD11b均有明显的抑制作用,且水蛭素抑制ICAM-1的表达强于肝素,尤其在ICAM-1表达的高峰期,对CD11b表达的抑制作用水蛭素与肝素无明显差别.结论:水蛭素可以明显抑制凝血酶诱导的HUVEC 表达ICAM-1和中性粒细胞表达CD11b.     

ICAM-1在大鼠急性胰腺炎肺损伤中的作用

目的：探讨ICAM-1在大鼠急性胰腺炎（acute pancreatitis,AP）肺损伤中的作用。方法：雄性Wistar大鼠40只,随机分为对照组（CON组）、AP不同时间点（3,6,12h）组。胆胰管逆行注射5％牛磺胆酸钠制备急性胰腺炎模型,术后3,6,12h分批剖杀大鼠,每个时间点10只。观察肺组织病理学改变并评分,检测血清淀粉酶（AMY）、肺组织髓过氧化物酶（MPO）活性;逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测肺组织肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和细胞间黏附分子-1（ICAM-1）mRNA表达;Western Blot法检测肺组织中ICAM-1蛋白表达。结果：AP组各时间点AMY、MPO和肺组织病理评分均较CON组升高（P〈0．05）;TNF-α和ICAM-1mRNA表达逐渐升高,均12h达到高峰;同时ICAM-1蛋白表达也逐渐升高,并在12h达到高峰。结论：AP大鼠肺组织中,ICAM-1在mRNA和蛋白水平均呈过度表达,且与肺损伤的严重程度密切相关。前炎症因子TNF-α在肺组织中ICAM-1的过度表达起着重要作用。     

丹参酮ⅡA预防性给药对脑缺血/再灌注损伤炎症反应的影响

目的研究丹参酮ⅡA对大鼠脑缺血/再灌注损伤缺血区白细胞浸润及细胞粘附分子的影响。方法缺血前给予丹参酮ⅡA8,16,32mg·kg-1,灌胃7d,末次给药1h后制备大鼠大脑中动脉阻断短暂局灶性缺血模型。脑缺血2h再灌注24h后,用TTC染色法、伊文思兰法(EB)测定脑梗死范围及血脑屏障的损伤程度。分别用放免、酶免、Westernblot法测定大脑缺血区肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、髓过氧化物酶(MPO)的活性、血清白介素-8(IL-8)的含量及血管内皮粘附分子ICAM-1(细胞间粘附分子)、E-selectin(E-选择素)的表达水平。结果丹参酮ⅡA能缩小脑缺血/再灌注后脑梗死体积,减轻神经损伤症状,降低脑内TNF-α、MPO的活性及血清IL-8含量,同时,减少ICAM-1、E-selectin的表达(P<0·05或P<0·01vs模型组)。结论丹参酮ⅡA可通过抑制脑缺血/再灌注过程中炎症介质释放、表达,降低脑缺血/再灌注所致脑损伤。     

槲皮素抑制血小板-内皮细胞粘附及粘附分子表达槲皮素抑制血小板-内皮细胞粘附及粘附分子表达

目的研究槲皮素(Que)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和人血小板的粘附作用,及其粘附分子表达。方法用流式细胞仪测定肿瘤坏死因子(TNF-α)诱导HUVEC表达细胞间粘附分子(ICAM-1)及凝血酶诱导的人血小板P-选择素的表达，用［³H］-Adenine标记人血小板,检测其与HUVEC的粘附反应。结果Que与人血小板作用后，可抑制凝血酶诱导的人血小板表达P-选择素。HUVEC经TNF-α处理后，明显增加细胞表面ICAM-1的表达,加强其与血小板的粘附反应，Que在一定剂量范围内可抑制HUVEC表达ICAM-1,并可抑制其与血小板的粘附作用。结论Que可抑制内皮细胞和血小板粘附及粘附分子表达。     

头部亚低温对脑出血患者炎性损伤干预作用的研究

目的观察脑出血患者白细胞介素-1β(IL-1β)、细胞间粘附分子-1(ICAM-1)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量的变化及头部亚低温对其的影响。方法 86例脑出血患者根据是否加用头部亚低温治疗分为头部亚低温组(45例)和对照组(41例),采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定两组患者治疗前及治疗后7d血清1L-1β、ICAM-1、TNF-α含量,并与正常组(30例)进行比较。结果头部亚低温组和对照组治疗前1L-1β、ICAM-1、TNF-α明显升高,与正常组比较差异均具有显著性(P<0.01);治疗前头部低温组和对照组间1L-1β、ICAM-1、TNF-α差异均无显著性(P>0.05);治疗后7d,头部亚低温组1L-1β、ICAM-1、TNF-α较治疗前明显降低(P<0.05),对照组降低不明显(P>0.05),头部亚低温组与对照组比较差异均具有显著性(P<0.01)。结论脑出血患者早期血清1L-1β、ICAM-1、TNF-α含量明显升高,头部亚低温组可有效降低其含量。     

卡托普利对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后炎症反应的影响

目的观察血管紧张素转化酶抑制药卡托普利对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后炎症反应的影响。方法采用血管内栓线阻断法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型,于脑缺血1 h、再灌注24 h后测定脑组织中髓过氧化物酶(MPO)活性,免疫组织化学方法测定细胞间黏附分子(ICAM-1)表达。结果卡托普利可明显抑制MPO活性及ICAM-1的表达。结论卡托普利可抑制脑缺血再灌注损伤后炎症反应。     

高糖对人肾小球系膜细胞MPO、GSH-ST活性和ICAM-1表达影响及茶多酚的干预作用

目的 探讨高糖对人肾小球系膜细胞髓过氧化物酶(MPO)、谷胱甘肽-硫转移酶(GSH-ST)活性和细胞间黏附分子1(ICAM-1)表达的影响及茶多酚对其的干预作用.方法 应用分光光度比色法检测高糖作用后系膜细胞上清液中MPO、GSH-ST活性及茶多酚对其活性的改变;免疫细胞化学法和Western印迹检测高糖作用后系膜细胞内ICAM-1蛋白的表达及茶多酚对其表达的影响.结果 高糖使系膜细胞上清液中MPO活性增加,GSH-ST活性降低,使系膜细胞内ICAM-1表达增加;茶多酚可显著改善高糖对系膜细胞的影响.结论 高糖导致人肾小球系膜细胞氧化失衡,增强ICAM-1的表达;茶多酚可有效干预高糖的作用.     

七氟烷对内毒素致急性肺损伤鼠肺组织ICAM-1和TNF-α的影响

目的:考察七氟烷对内毒素致大鼠急性肺损伤肺组织细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达的影响。方法:48只雄性Wistar大鼠(200～290 g)随机分为对照组,内毒素组,七氟烷低(1.0 MAC)、高浓度(1.5 MAC)组,每组12只,分别予以股静脉注射生理盐水1.2 mL后机械通气2 h,股静脉注射内毒素5 mg.kg-1后机械通气2 h,股静脉注射内毒素5 mg.kg-1后机械通气分别吸入1.0,1.5倍肺泡气最低有效浓度(minimal alveolar concentration,MAC)七氟烷2 h的处理。处死大鼠,取肺组织,采用免疫组化和RT-PCR法测定ICAM-1和TNF-α的蛋白及mRNA表达水平。结果:与对照组相比,内毒素组ICAM-1和TNF-α的蛋白及mRNA表达水平明显升高(P<0.01或0.05);与内毒素组相比,七氟烷低、高浓度组ICAM-1和TNF-α的蛋白及mRNA表达水平明显降低(P<0.05)。结论:吸入1.0或1.5倍MAC的七氟烷2 h可下调内毒素所致大鼠急性肺损伤后肺部ICAM-1和TNF-α的蛋白及mRNA表达,在一定程度上减轻...     

多拷贝水蛭素基因在毕赤酵母中的分泌型表达

目的:通过多拷贝克隆技术实现水蛭素(Hirudin)基因在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达.方法:利用基因重组技术,从pPIC9-Hirudin中扩增α-facor-Hirudin插入到载体pA0815中,并构建pA0815-(α-Hirudin)n多拷贝重组质粒,转化毕赤酵母GS115后进行诱导表达,并鉴定表达产物活性.结果:PCR证实成功构建了水蛭素多拷贝毕赤酵母表达载体pA0815-(α-Hirudin)n,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳证实能成功高效分泌重组水蛭素,活性测定表明表达的水蛭素有良好的抗凝血活性.结论:成功构建了分泌型水蛭素多拷贝质粒,筛选出多拷贝稳定整合表达菌株,成功表达出具有抗凝血活性的1 600 ATU/mL重组水蛭素,为大规模表达纯化水蛭素蛋白及其临床应用奠定了基础.     

非甾体类抗炎药对脑缺血再灌注后黏附分子表达的影响

目的：探讨非甾体类抗炎药对大鼠局灶性缺血再灌注后黏附分子表达的影响。方法：线栓法制作大鼠大脑中动脉缺血模型（MCAO）。用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测脑组织细胞间黏附分子-1（ICAM-1）和E-选择素mRNA的表达,白细胞髓过氧化物酶（MPO）检测试剂盒检测MPO活性。结果：再灌注4、22、46h,缺血脑皮质及纹状体ICAM-1和E-选择素mRNA表达增加,同时MPO活性增加;消炎痛和美洛昔康再灌注后即刻给药抑制ICAM-1和E-选择素mRNA表达,降低MPO活性;再灌注后4h给药作用减弱。结论：缺血再灌注后早期ICAM-1和E-选择素mRNA表达都增加,介导了再灌注后炎症损伤,消炎痛和美洛昔康再灌注早期给药能从转录水平抑制黏附分子表达,减轻再灌注后炎症反应。     

补体旁路激活致小鼠急性肺损伤的炎症病理机制研究

目的研究补体旁路激活所导致的小鼠肺部急性炎症的发生发展及相关指标的变化,为药物筛选及干预研究提供理想的小鼠肺部急性炎症病理模型。方法 SPF级昆明小鼠尾静脉注射眼镜蛇毒因子(CVF)激活血清补体旁路途径,根据注射后取样时间不同,分为15 min、30 min、1 h、2 h、6 h组,同时平行设置PBS对照组。取肺组织测定肺系数、肺含水量,并行病理切片检查,肺组织匀浆测定髓过氧化物酶(MPO)活性;制备支气管肺泡灌洗液(BALF)和血清,测定BALF中的细胞数和蛋白含量,采用ELISA法分别测定BALF和血清中的IL-6、TNF-α、P-selectin和ICAM-1含量。结果小鼠尾静脉注射CVF后可致肺部炎性细胞明显浸润,MPO活性明显上调,BALF中细胞总数和蛋白浓度明显增加。BALF和血清中的IL-6、TNF-α、P-selectin水平及血清中ICAM-1的含量均明显升高,其中,BALF中P-selectin含量在30 min时间点出现1个小高峰,IL-6和TNF-α在1 h时间点出现1个高峰,在2 h时间点均无进一步上升,但在6 h时间点各指标均又明显升高;血清中IL-6和TNF-α含量在1 h时间点达到峰值,随后浓度降低,P-selectin和ICAM-1水平随着时间的延长持续上升。而肺系数、肺含水量及BALF中ICAM-1的含量与PBS组相比无明显变化。结论补体旁路激活可导致小鼠肺部急性炎症的发生,以30 min至1 h的炎症反应最为明显,该实验可以为药物筛选及干预研究提供理想的动物肺部急性炎症病理模型。     

双作用靶点水蛭素Ⅲ突变体库(R33G34D35X36-rHV3)的构建及最适突变体筛选

构建水蛭素Ⅲ(HVⅢ)突变体库R33G34D35X36-rHVⅢ,从中筛选出具有与重组水蛭素Ⅲ(rHV3)抗凝血酶活性比活力相当,同时又具有很强的抗ADP诱导的血小板聚集抑制率的双作用靶点水蛭素Ⅲ突变体。通过基因定点突变技术构建水蛭素Ⅲ突变库R33G34D35X36-rHVⅢ,表达纯化后通过凝血酶滴定方法测定其抗凝血酶比活性,同时测定其抗ADP诱导的血小板聚集比活性。结果显示所有突变体的抗凝血酶比活性未发生变化,但各突变体抗ADP诱导的血小板聚集的比活性各异,当第36位为Met和Ser时所表现的抗ADP诱导的血小板聚集的比活性最强。由此可知水蛭素Ⅲ(HVⅢ)突变体库R33G34D35X36-rHVⅢ中第36位氨基酸种类对其抗凝血酶活性影响不大,但对其抗ADP诱导的血小板聚集的比活性影响较大,当该位点为Met和Ser时突变体具有很好的抗凝血酶和抗ADP诱导的血小板聚集的双重药理活性。     

凝血酶与脑水肿的实验研究

目的 观察凝血酶与脑水肿的关系及使用凝血酶抑制剂（如水蛭素）、钙离子拮抗剂（尼莫地平）是否能减轻凝血酶对脑细胞的毒性损伤，是否存在治疗的有效时间。方法 分别以不同剂量的凝血酶注入SD大鼠尾状核，建立SD大鼠模型，采用干湿重法及普通光镜（HE染色）观察脑水肿情况。SD大鼠随机分为6组。1组：生理盐水组；2组：小剂量凝血酶组；3组：大剂量凝血酶组；4组：小剂量凝血酶与小剂量水蛭素同时注入组；5组：大剂量凝血酶与大剂量水蛭素同时注入组；6组：尼莫地平组。每组每时相(4h、24h、48h、3d、7d)各5只SD大鼠。结果 大剂量凝血酶组脑含水量与其余各组比P＜0．01，尼莫地平组与其余各组比P＜0．05，大剂量凝血酶组与尼莫地平比P＜0．05，而3d和7d二个时相点6组组间无明显差异P＞0．05。结论 大剂量凝血酶可早期（4h)引起明显脑水肿，其高峰时间为24－48h,3至7天后水肿逐渐消褪且趋于正常，凝血酶致脑水肿作用可被特异性抑制剂水蛭素有效抑制，钙离子拮抗剂（尼莫地平）早期即能减轻凝血酶致脑水肿作用。研究提示如能在脑出血早期（特别是4－24h，这一时期可能是治疗脑出血的关键时期）有效抑制凝血酶致水肿的作用（如使用水蛭素及尼莫地平等），将会明显减轻脑出血后脑水肿，改善脑出血的预后，这也为临床更好地治疗脑出血提供了新的思路。     

肢体缺血预处理减少肝门阻断再灌注后肠黏膜损伤和中性粒细胞浸润的实验研究

目的 观察肢体缺血预处理（LIP）对肝门阻断（HPO）再灌注损伤后肠黏膜损伤和中性粒细胞（PMN）浸润的影响,并探讨INF-α和细胞间黏附分子（ICAM-1）的作用.方法 将24只大鼠随机分为3组各8只,分别为假手术（Sham）组、HPO再灌注组（HPO组）和肢体缺血预处理＋HPO再灌注组（LIP＋HPO）组.以肠黏膜为目标,采用光镜病理学Chiu评分系统评价肠损伤程度,测定髓过氧化物酶（MPO）、评价PMN浸润程度,以放免法和ELISA法分别测定肠黏膜组织INF-α和ICAM-1含量.结果 HPO组肠黏膜损伤明显,PMN浸润程度较高,MPO活性明显升高（P〈0.01）,同时组织中TNF-α和ICAM-1浓度升高明显（均P〈0.05）;LIP＋HPO组肠损伤减轻,MPO活性降低,但TNF-α、ICAM-1水平仍高于Sham组（均P〈0.05）.结论 HPO后肠黏膜损伤严重,致炎因子TNF-α大量生成,激活了PMN并使其聚集;ICAM-1介导了PMN细胞毒效应,可致肠黏膜屏障损伤.LIP通过抑制肠黏膜组织中TNF-α和ICAM-1的生成,可减少PMN浸润,减轻肠黏膜屏障损伤.     

重组人表皮生长因子对冷冻角膜缘上皮细胞PCNA表达的影响

为探讨重组人表皮生长因子(rhEGF)的浓度对冷冻后兔角膜缘上皮细胞增殖活性的影响，采用器官培养方法和SABC免疫组织化学染色法检测角膜缘上皮细胞的PCNA表达。结果表明，器官培养1周时，冷冻角膜缘上皮细胞核中均可见PCNA表达，染色阳性细胞主要在基底细胞层。EGF组的PCNA染色阳性率显著高于无EGF组(P&;lt;0．01)；而不同浓度的EGF组之间阳性率差异无显著意义(P&;gt;0．05)。结论：在体外器官培养中，EGF能增强超低温冷冻保存的角膜缘上皮细胞PCNA的表达，但无量效依赖性。