人骨髓来源内皮祖细胞的分离培养及生物学特性的鉴定

目的建立人骨髓来源的内皮祖细胞（EPCs）分离、培养、诱导分化与鉴定的方法,并探讨其生物学特性。方法收集腰椎间盘退变性疾病患者的髂骨骨髓24例,密度梯度离心法分离的单个核细胞接种于纤维连接蛋白包被的培养瓶,贴壁培养,EGM-2培养基诱导扩增EPCs。Dil-ac-LDL、FITC．UEA—I荧光双标、流式细胞术鉴定EPCs,计算纯度。透射电镜和管腔形成实验鉴定EPCs向血管内皮细胞（ECs）分化的能力。结果培养72h换液时可见贴壁细胞形成明显细胞克隆集落,第5天集落数增加,1周后细胞融合达80％,至第14天细胞呈铺路石样排列。培养至第7天细胞Dil-ac-LDL、FITC-UEA-I双荧光染色阳性率为（95．1±4．0）％,CD133、CD34、KDR、VE。Cadherin标记阳性率分别为（18．5±4．4）％、（45．4±7．8）％、（66．7±7．2）％、（20．5±5-3）％。培养第10天细胞透射电镜显示成熟血管ECs特有的Weibel-Palade小体。管腔形成实验表明,体外ECMatrix上培养7至12d的EPCs具有较强的管腔形成能力。结论采用密度梯度离心与贴壁培养法分离、培养的人髂骨骨髓来源的单个核细胞在特定诱导条件下可分化为EPCs,纯度较高,稳定性和重复性好。EPCs培养7至12d,具有良好的管腔形成能力。     

骨髓血管内皮祖细胞移植提高缺血皮瓣存活率的研究

目的：探讨大鼠骨髓来源的血管内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）移植促进缺血皮瓣的血管新生,从而提高皮瓣存活率的可能性。方法：在Wistar大鼠背部形成2cm×8cm蒂部位于双侧髂棘连线上的随意型超比例皮瓣,建立缺血皮瓣模型。采用密度梯度离心法从Wistar大鼠骨髓中分离出骨髓单个核细胞,并在专有的诱导培养基（EG-M2MV）中培养,贴壁筛选法分离,诱导分化为EPCs;对细胞的形态、表型、功能加以鉴定。将EPCs注射移植于iWstar大鼠背部的缺血皮瓣,大体观察皮瓣的存活率,vWF免疫酶染色法检测皮瓣毛细血管密度。以缺血皮瓣单纯注射磷酸盐缓冲液（PBS）的Wistar大鼠作为对照组。结果：骨髓中分离培养的EPCs呈现典型的＂铺路石＂样外观,表达CD34、Flk-1及CDl 33表型,能够摄取DIL-ac-LDL和特异性结合FITC-UEA-1。注射EPCs组的缺血皮瓣存活率以及毛细血管密度显著高于对照组（P〈0.05）。结论：骨髓中的EPCs在体外培养后注射移植于皮瓣内,可以促进缺血性皮瓣的血管新生,提高缺血性皮瓣的存活率。     

兔骨髓源性单核细胞分化为血管内皮祖细胞的体外研究

目的探讨采用密度梯度离心法和差速贴壁法分离兔骨髓源性血管内皮祖细胞,并对分离细胞进行培养及鉴定。方法通过细胞形态观察、免疫荧光染色、管腔形成实验以及低密度脂蛋白吞噬和植物凝集素贴附实验进行鉴定。结果分离培养的细胞呈多角形生长,细胞能够形成放射样克隆集落,细胞表达血管假性血友病因子(vW F),在基质胶呈管腔样生长,吞噬低密度脂蛋白并能够黏附植物凝集素。结论采用密度梯度离心法和差速贴壁法分离兔骨髓源性干细胞,在一定条件下能分化成为血管内皮祖细胞。     

人外周血内皮祖细胞的分离、培养、扩增和鉴定

目的:研究人外周血内皮祖细胞的分离、培养、扩增和鉴定方法.方法:采用密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞,用EGM-2培养基在多聚赖氨酸包被的培养板中进行诱导培养,动态地观察贴壁细胞的生长状况,免疫组织化学技术检测培养细胞表面标志物的表达.结果:人外周血单个核细胞经体外培养至第2天,呈贴壁生长,细胞形态为大小相近的圆球体；第4天一些细胞开始出现尾状物,形态呈蝌蚪样改变,部分细胞聚集形成细胞簇；至第7天细胞形态变长,呈梭形改变,细胞间相互围绕呈环形,并有集落出现,免疫组织化学染色CD133、CD34、VEGFR-2和Ⅷ因子表达均呈阳性.结论:运用本实验方法可以成功实现人外周血内皮祖细胞的分离、培养和扩增.     

体外诱导大鼠骨髓内皮祖细胞(EPCs)成内皮细胞的实验研究

目的体外诱导大鼠骨髓内皮祖细胞(EPCs)成内皮细胞,探索其作为血管组织工程内皮种子细胞的可行性.方法冲洗大鼠骨髓腔,通过密度梯度离心得到单个核细胞;按诱导(M199,20%FBS,VEGF 10ng/mL,bFGF2ng/mL)和未诱导(M199,20%FBS)分组培养骨髓单个核细胞,体外培养至第二代;免疫细胞荧光分别检测诱导组和未诱导组细胞VWF、VEGFR-2、VE-cadherin和PECAM-1的表达;流式细胞仪分别检测骨髓单个核细胞、诱导组细胞和未诱导组细胞VEGFR-2、VE-cadherin和PECAM-1表达率;诱导组细胞接种于胶原凝胶中三维培养,观察血管生成能力.结果诱导组原代细胞呈小梭形,5～7d时出现典型的线样结构,P2、P3细胞逐渐成内皮细胞典型铺路石样结构,未诱导细胞未见这两种典型结构;免疫细胞荧光发现,诱导组细胞有VWF、VEGFR-2、VE-cadherin和PECAM-1表达,未诱导组未见明显表达;流式细胞仪检测显示三种标记(VEGFR-2、VE-cadherin和PECAM-1)在原代时的比例均不到总细胞数5%,经两代培养后,诱导组中阳性细胞率高于35%,未诱导组阳性细胞率明显低于诱导组(P＜0.01);三维培养状态下诱导组细胞集落在胶原内有"出芽式"生长.结论本实验建立了一套骨髓EPCs分离、诱导培养和表型检测的方法;以VEGF和bFGF为主要诱导因子的诱导体系,对骨髓EPCs成内皮细胞的诱导阳性率达35%～40%,经诱导的内皮细胞有希望作为血管组织工程新的种子细胞来源.     

人骨髓内皮祖细胞的分离、诱导培养和扩增

目的 探讨并改进从人骨髓中分离、诱导培养和体外扩增内皮祖细胞(EPCs)的方法 ,为EPCs参与基础研究和临床应用奠定基础. 方法 采用不同的细胞分离液,用密度梯度离心法从正常人骨髓中分离单个核细胞(hBMMNCs),分别培养在包被人纤维连接蛋白(HFN包被组),包被明胶(明胶包被组)和未包被(未包被组)的培养皿内,利用EBM-2培养4～7 d后出现细胞克隆集落(cell colony-forming units,CFUs),挑选内皮祖细胞样CFUs继续培养(CFUs挑选法),采用流式细胞仪检测CD34 KDR 和CDl33 KDR 双荧光阳性细胞,细胞免疫化学法检测EPCs表面标记CD133、CD34、CD31、vWF和KDR的表达. 结果 用OptiprepTM分离液可从人骨髓中更有效地分离出hBMMNCs,进而诱导获取更多EPCs并可进行体外培养扩增;流式细胞仪检测结果 显示CD133 KDR 细胞高达70.4%±5.4%,CD34 KDR 细胞高达69.1%±8.7%;HFN包被组和明胶包被组细胞生长一样旺盛,均可促进EPCs的贴壁生长,促进其生长的作用差异无统计学意义(P＞0.05),而未包被组细胞生长数量最少.培养7d的贴壁细胞表面标记CD133、CD31、vWF和KDR均呈阳性,培养14d的贴壁细胞表面标记CD34呈阳性. 结论 CFUs挑选法可以从人骨髓中成功地获取更多EPCs并在体外扩增,提出了另一种获取EPCs的高效简单方法 ,进一步拓宽了获取EPCs的方法 和范围.     

大鼠脐血来源单个核细胞诱导为内皮祖细胞的免疫荧光检测

目的脐血（umbilical cord blood,UCB）中含有大量内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）,内皮祖细胞（EPCs）是血管内皮细胞的前体细胞,有分化为血管内皮细胞的能力,为骨组织工程血管化带来新的途径。本实验研究大鼠脐血来源的单个核细胞体外诱导为EPCs的可能性。方法分离大鼠脐血单个核细胞,血管内皮诱导液（添加10％胎牛血清,1％青霉素,1％链霉素,VEGF20ug／L,IGF-12ug／L,bFGF2ug／L,EGF20ug／L）培养分化,于3周、6周进行免疫荧光染色检测贴壁细胞CD34、CD133、Flk-1、vWF表面标志。结果培养三周单个核细胞CD34、CD133、Flk-1、vWF抗体免疫荧光检测均为阳性;六周免疫荧光染色可见CD34、Flk-1、VWF组为阳性,CD133组部分为阳性,阴性对照组未发现阳性细胞。结论大鼠脐血来源的单个核细胞在体外诱导3周可以分化为EPCs,6周部分细胞分化为成熟血管内皮细胞。     

冠心患者外周血单个核细胞体外诱导分化的研究

内皮祖细胞（EPCs）是干细胞移植疗法最常见的种子细胞之一。EPCs是指外周血、骨髓和脐血中存在的内皮细胞前体细胞，具有定向分化成为成熟内皮细胞的能力，并可参与缺血组织血运重建，有效促进血管新生，增加局部缺血组织血流，是出生后组织血管新生的重要途径。EPCs具有特定的细胞表面标志物CD34抗原，通过免疫磁珠、生物索一抗生物索亲合吸附、流式细胞术及mAb铺展贴壁等细胞分选术，可广泛开展CD34^＋细胞及其亚群的分离纯化。我们应用Ficoll密度梯度离心法获得单个核细胞。同时通过VEGF和bFGF诱导和预涂纤连蛋白促使细胞贴壁而诱导分化成EPCs，从而为冠心病干细胞移植疗法的种子细胞来源探讨新的途径。     

成人骨髓基质干细胞体外定向诱导分化为软骨细胞的实验研究

目的 建立临床成人骨髓基质干细胞(MSCs)体外培养、定向诱导分化为软骨细胞的途径。方法抽取成人骨髓，Percol密度梯度离心法进行体外培养，贴壁细胞传代，取第3代细胞在培养基中添加软骨分化诱导剂地塞米松、维生素C和不同剂量转化生长因子-β(TGF-β)，培养16d后,在倒置显微镜观察细胞形态，甲苯胺蓝染色蛋白多糖，逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫细胞化学(SABC法)检测Ⅱ型胶原表达，诱导后MSCs与新型材料聚乳酸和羟基乙醇共聚物(PL-GA)复合。结果 Percoll密度梯度离心法培养可获得均一的。MSCs；5、10ng TGF-β诱导分化的MSCs生长迅速。呈典型的软骨细胞形态，甲苯胺蓝染色阳性，Ⅱ型胶原表达阳性，MSCs对材料PL-GA黏附力强。结论 可以从成人骨髓中培养出MSCs，并可定向诱导分化为软骨细胞，5～10ng TGF-β为最佳诱导剂量，成人MSCs可用作临床自体软骨组织工程种子细胞。     

成人骨髓间充质干细胞的体外分离培养与鉴定

目的 对成人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)进行体外分离培养与鉴定,研究其生物学特性.方法 将密度梯度离心法获得的单个核细胞,用贴壁培养法分离纯化、扩增获得大量hBMSCs,观察细胞形态,分析细胞生长特性,并经流式细胞仪检测细胞表面抗原、细胞周期,和进行成骨诱导鉴定.结果 经密度梯度离心和贴壁培养法可成功分离纯化、扩增得到大量hBMSCs,其细胞形态、分化特性和表型均符合干细胞特点,在特定培养条件下能向成骨细胞分化.结论 骨髓间充质干细胞分离扩增容易,细胞增殖能力和成骨性能好,是骨组织工程理想的种子细胞.     

疏肝活血方含药血清对内皮祖细胞数量及功能的影响

目的：观察疏肝活血方含药血清对大鼠骨髓来源的血管内皮祖细胞（EPCs）数量及功能的影响。方法：从大鼠骨髓中获取单个核细胞,体外培养9d后,收集贴壁细胞,加入低、中、高浓度的疏肝活血方及其拆方的含药血清,培养12、24、48h。激光共聚焦显微镜鉴定,FITC-UEA-I和Dil-acLDL双染色阳性细胞为正在分化的EPCs,并在倒置荧光显微镜下计数,分别采用黏附能力测定、MTT比色法及改良的Boyden小室实验来观察疏肝活血中药对EPCs黏附能力、增殖能力和迁移能力的影响,用流式细胞仪检测PI-/AnnexinⅤ＋的凋亡细胞。结果：疏肝活血方能明显促进EPCs的分化,提高EPCs的数量,明显改善EPCs的黏附、增殖及迁移能力,减少EPCs的凋亡率,中浓度组培养24h达到作用的高峰（P〈0.01）。结论：疏肝活血方能促进EPCs数量的增加、功能的改善,减少EPCs的凋亡。     

HSCT联合不同剂量内皮祖细胞输注对小鼠造血重建的影响

目的 探讨异基因造血干细胞移植联合不同剂量内皮祖细胞(EPC)输注对移植后造血重建的影响.方法 以C57BL/6小鼠为供鼠,Balb/c小鼠为受鼠,进行HSCT,输注骨髓单个核细胞数量为5×106个/只.仅进行HSCT者为单纯骨髓细胞移植组;行HSCT的同时经尾静脉输注供者骨髓单个核细胞诱导培养的EPC的受鼠为EPC联合移植组,EPC的输注量分别为5×104、1×105、5× 105和1×106个/只.另设正常对照组和致死量照射组.观察小鼠的存活率、造血重建情况及骨髓微环境的变化.结果 各EPC联合移植组小鼠存活时间长于单纯骨髓移植组,5×105 EPC联合移植组至观察结束时存活率为100％,高于其他各组(P＜0.05).移植后10和15 d,5×105 EPC联合移植组外周血白细胞数量高于其他组(P＜0.05).移植后15 d,5×105 EPC联合移植组外周血血小板数量高于其他组(P＜0.05).5×105 EPC联合移植组造血组织增生程度也好于其他组.5×105 EPC联合移植组骨髓内HSC比例为(1.06±0.03)％,高于其他各组(P＜0.05).结论 小鼠异基因骨髓移植中联合输注5×105 EPC能够有效促进造血重建,提高小鼠存活率.     

急性胰腺炎时骨髓和循环内皮祖细胞的变化研究

目的 探讨急性胰腺炎时骨髓及循环内皮祖细胞(EPCs)的数量变化及机制.方法 将BALB/c小鼠随机分为对照组和腹腔注射雨蛙素组,腹腔注射后12 h、24 h、48 h,用流式细胞仪测定骨髓和循环中EPCs数量,分别采用ELISA法和Western blot检测循环中VEGF、TNF-α、ET-1含量及胰腺VEGF表达,TUNEL法原位检测胰腺血管内皮细胞凋亡.结果 腹腔内雨蛙素注射后骨髓和循环中EPCs的数量显著增加(P<0.05)并伴有血浆高水平的VEGF、TNF-α、ET-1(P<0.05),骨髓和循环中EPCs数量与血浆VEGF水平呈线性相关(r分别为0.77和0.67);雨蛙素注射后12 h胰腺VEGF表达明显增加;雨蛙素注射后24 h胰腺血管内皮细胞凋亡明显增加.结论 急性胰腺炎可导致胰腺局部血管内皮损伤,并可动员骨髓内EPCs进入循环.     

内皮祖细胞异体移植对慢性血栓微环境影响的实验研究

目的 探讨骨髓内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)移植对慢性血栓微环境的影响,即能否上调促血栓机化和再通的血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、血管生成素(angiopoietin,ANG-1)和单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)的表达.方法 将幼年Wister大鼠骨髓单个核细胞体外培养扩增到第10天,通过股静脉将其移植到成年大鼠下腔静脉慢性血栓中.实验分为A组:空白对照组(仅做血栓手术);B组:对照组(血栓中注入培养基);C组:实验组(血栓中注入EPCs),每组15只.第28天,取出肾下段下腔静脉及血栓,应用实时荧光定量PCR和Western blotting检测VEGF、ANG-1和MCP-1 mRNA及蛋白的表达.结果 EPCs经免疫组化、免疫荧光和功能鉴定成功后,移植到下腔静脉慢性血栓中,实验组(C组)下腔静脉及血栓标本在第28天与空白对照组(A组)和对照组(B组)相比,VEGF、ANG-1、MCP-1mRNA表达明显上调,差异有统计学意义(P＜0.01),A组和B组之间(P＞0.05)差异无统计学意义.标本中VEGF、ANG-1和MCP-1蛋白表达和mRNA表达相似,移植组与A组和B组比较表达上调,差异有统计学意义(P＜0.01),A组和B组之间(P＞0.05)差异无统计学意义.结论 骨髓EPCs移植,能够上调促血栓机化和再通的细胞因子VEGF、ANG-1和MCP-1,影响血栓微环境.     

复合血管内皮祖细胞的组织工程骨在修复大段骨缺损实验中的血管化评价

目的 评价复合了血管内皮祖细胞(EPCs)的组织工程骨在修复兔桡骨大段骨缺损实验中的血管化情况.方法 自体骨髓通过不同方法的体外培养,获得EPCs及经成骨诱导的骨髓基质干细胞(BMSCs),与脱钙骨基质(DBM)构建组织工程骨修复兔桡骨大段骨缺损.用墨汁灌注、放射性核素骨显像、血管内皮细胞生长因子和Ⅷ因子相关抗原的免疫组化方法观察术后不同时期实验组(EPCs+BMSCs+DBM)、自身对照组(BMSCs+DBM)、阴性对照组(DBM)的骨组织血管化情况.结果 各组手术后2周骨缺损区新生血管数量增加,血流量开始升高,4周和8周时达到峰值,12周后开始下降.实验绀的新生血管数量和局部血流量在术后2、4、8周明显高于自身对照组和阴性对照组,血管排列更整齐.结论 复合EPCs的组织工程骨在修复大段骨缺损时,能促进早期血管化,从而进一步促进成骨.     

端粒酶反转录酶在体外培养的内皮祖细胞中的表达

目的 探讨体外培养的大鼠内皮祖细胞增殖活性与端粒酶反转录酶表达的关系。 方法 原代培养大鼠骨髓源性内皮祖细胞。在培养7、14、21和28 d时,用MTT法检测内皮祖细胞在不同时间点的增殖活性;流式细胞术检测内皮祖细胞早期凋亡率;免疫细胞化学方法、RT-PCR和Western印迹技术检测内皮祖细胞端粒酶反转录酶mRNA和蛋白表达的变化。 结果 大鼠骨髓单个核细胞可以被诱导成内皮祖细胞。内皮祖细胞增殖活性随着培养时间的延长呈现单峰曲线,在培养14 d时增殖活性最高（P < 0.01）。内皮祖细胞凋亡率随培养时间的延长而增加,在培养7 d、14 d、21 d和28 d时分别为0.28%、0.66%、1.38%、1.52%;衰老率分别为3.04%、20.28%、24.36%、16.52%,14 d 内皮祖细胞衰老率显著增加 （P < 0.01）,21 d衰老率最高,但二者之间差异无统计学意义。端粒酶反转录酶mRNA和蛋白表达呈单峰曲线,在培养14 d时表达最高,以后表达随培养时间的延长逐渐降低（P < 0.05）。 结论 大鼠骨髓内皮祖细胞增殖活性下降可能与端粒酶反转录酶活性下降有关。     

内皮祖细胞移植治疗慢性深静脉血栓形成的实验研究

目的 研究内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)移植对慢性深静脉血栓的治疗作用. 方法 Ficoll法分离大鼠骨髓单个核细胞(bone marrow-derived mononuclear cells,BMMNCs),采用内皮祖细胞培养基(EGM-2MV)诱导分化为骨髓源性EPCs.建立大鼠慢性深静脉血栓模型,饲养至10 d,并分三组:A组(25只):单纯EPCs组,移植1 ml含有10~6 个EPCs细胞悬液;B组(25只):EGM-2MV培养基对照组,移植1 ml EGM-2MV培养基;C组(25只):空白对照组.移植后第14天取出血栓段下腔静脉及血栓,应用HE染色及vWF免疫组化染色观察血栓机化再通情况,高倍镜下计数血栓内毛细血管数目;Western blot检测血管内皮生长凶子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的蛋白表达变化;实验数据采用SPSS13.0软件进行分析.结果 体外成功培养了骨髓源性EPCs和构建了大鼠慢性深静脉血栓模型,EPCs移植后A组VEGF、bFGF的表达有明显的上调(P＜0.05).B组和C组之间差异无统计学意义(P＞0.05).移植后A组血栓再通毛细血管数目明显高于B、C组.免疫组化染色vWF确定再通管道为新牛血管,管道为内皮细胞组成.结论 EPCs为内皮细胞的前体细胞,移植到深静脉血栓中能够促进血管新生,加快血栓的机化和再通.