多重耐药铜绿假单胞菌MexAB-OprM、MexXY-OprM主动外排系统的耐药作用

目的 探讨MexAB-OprM、MexXY-OprM主动外排系统（外排泵）在多重耐药铜绿假单胞菌耐药机制中的作用.方法 选取25株外科监护室分离的多重耐药铜绿假单胞菌,用实时定量RTPCR测定结构基因mexA、mexX的mRNA表达水平来判断MexAB-OprM、MexXY-OprM外排泵表达情况;用PCR分别扩增其调控基因mexR、mexZ,并对其产物测序,用Blast软件在GenBank与已知序列比较,研究其过度表达的机理.结果 25株多重耐药铜绿假单胞菌中,14株高表达MexAB-OprM系统（56%）,3株高表达MexXY-OprM系统（12%）,这3株菌同时高表达2种外排泵.在8株mexA高表达的菌株中,5株菌发生mexR基因突变,出现氨基酸替代,1株mexR提前出现终止密码子,2株菌未发现mexR基因突变.2株mexX高表达的菌株均发生基因mexZ突变,出现氨基酸替代.结论 主动外排系统MexAB-OprM、MexXY-OprM在多重耐药铜绿假单胞菌中过度表达,是此菌多重耐药机制之一;外排泵MexAB-OprM、MexXY-OprM高表达分别与调控基因mexR、mexZ发生变异有关,同时存在其他调控机制.     

铜绿假单胞菌临床分离株主动外排泵的检测

目的了解铜绿假单胞菌临床分离株的耐药特点及其外排泵存在的状况。方法采用K-B法检测铜绿假单胞菌临床分离株对9种常用抗生素（庆大霉素、氨曲南、头孢他啶、亚胺培南、阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦、环丙沙星、左氧氟沙星、多粘菌素B）的耐药情况;通过外排泵抑制剂氰氯苯腙（CCCP）对四种药物（羧苄青霉素、红霉素、亚胺培南、庆大霉素）的琼脂稀释法抑制试验分别检测铜绿假单胞菌的四种外排泵（MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN、MexXY-OprM）的表型;应用PCR检测MexAB-OprM外排泵调节基因mexR的存在情况。结果铜绿假单胞菌对9种常用抗生素的耐药率依次为：庆大霉素36.67%（22/60）,氨曲南33.33%（20/60）,头孢他啶31.67%（19/60）,亚胺培南28.33%（17/60）,阿米卡星26.67%（16/60）,哌拉西林/他唑巴坦23.33%（14/60）,环丙沙星21.67%（13/60）,左氧氟沙星11.67%（7/60）,多粘菌素B为0。外排泵表型阳性株依次为：MexAB-OprM35株,阳性率58.33%（35/60）;MexXY-OprM13株,阳性率21.67%（13/60）;MexCD-OprJ11株,阳性率18.33%（11/60）;MexEF-OprN10株,阳性率16.67%（10/60）。35株MexAB-OprM外排泵表型阳性株中有28株扩增出mexR基因片段,检出率为80.0%（28/35）。结论铜绿假单胞菌临床分离株对庆大霉素耐药率最高,对多粘菌素B耐药率最低;MexAB-OprM外排泵的存在是铜绿假单胞菌临床分离株的重要耐药机制。     

siRNA干扰铜绿假单胞菌MexA-MexB-OprM外排泵mexB基因表达的研究

目的 探讨RNA干扰技术对铜绿假单胞菌MexA-MexB-OprM外排泵mexB基因表达及有关功能的影响.方法 设计并合成4条小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)(siRNA1、siRNA2、siRNA3和siRNA4)序列,构建干扰RNA( short hair pin RNA,shRNA)表达载体,将带有siRNA质粒电转入PAO1和临床耐药株PAO3.应用E-test方法检测PAO1和PAO3抗生素MIC的变化.用半定量RT-PCR和定量PCR方法检测mexB的表达变化.结果 经酶切鉴定siRNA表达载体构建成功,并明显提高PAO和临床耐药株PAO3对抗生素的敏感性.RT-PCR结果显示干扰后的PAO1和临床耐药株PAO3 mexB基因表达明显下降(P＜0.05).结论 siRNA成功干扰MexA-MexB-OprM外排泵mexB基因的表达,提高铜绿假单胞菌对抗生素的敏感性,为临床上治疗铜绿假单胞菌感染,降低其耐药性提供了新的思路.     

黄芩苷对氟喹诺酮类抗铜绿假单胞菌协同作用的初步报告

目的：研究黄芩苷对氟喹诺酮类药物抗铜绿假单胞菌的协同作用。方法：以二倍稀释法测定药物的体外抗菌活性,筛选耐药菌,然后测定黄芩苷对4种氟喹诺酮类药物（诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星）抗铜绿假单胞菌的协同作用;以CCCP筛选存在主动外排系统的耐药菌．测定黄芩苷对4种氟喹诺酮类药物抗该类耐药菌的协同作用。结果：临床分离铜绿假单胞菌耐药现象普遍．黄芩苷联合4种氟喹诺酮类药物对耐药铜绿假单饱菌有协同抗菌作用．MIC值下降1-2倍。同时存在主动外排系统的耐药菌也表现出抗菌增敏作用。结论：黄芩苷与氟喹诺酮类药物联合应用对耐药铜绿假单胞菌有协同抗菌,对存在主动外排系统的耐药菌也表现出抗菌增敏作用。     

湖南省铜绿假单胞菌四种外排泵在多重耐药菌株中表达的分布及作用

目的 探讨湖南省多重耐药(multi-drug resistance,MDR)铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa,Pa)中4种外排泵表达的分布和作用,以及相关调控基因的突变情况.方法 收集2008年湖南省临床首次分离非重复多重耐药Pa株40株,以外排泵抑制剂苯丙氨酸-精氨酸-β萘酰胺及4种药敏纸片进行外排泵表型初步筛选,PCR扩增膜融合蛋白基因及相关外排泵调控基因并测序;以18组非多重耐药菌株为对照研究分析Pa外排泵基因表达在多重耐药中的作用.结果 表型筛选MDR组菌株MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-oprN、MexXY-OprM阳性率分别为45.0%(18/40)、30.0%(12/40)、42.5%(17/40)、12.5%(5/40);RT-PCR显示mexA、mexC、mexE和mexX表达阳性率分别为100%(58/58)、22.5%(9/40),45.0%(18/40)和22.5%(9/40).Real-time PCR半定量分析菌株超表达mexA和mexX阳性率分别为55.0%(22/40)和22.5%(9/40).非多重耐药组中,mexA与mexX real-time PCR超表达阳性率均为0(0/18).mexC和mexE RT-PCR表达阳性率分别为11.1%(2/18)、38.9%(7/18).两组相比,mexA与mexX超表达差异有统计学意义(P<0.001,P=0.045).随机挑选超表达mexA菌株Pa20出现mexR的164GTG→GAG、126Val→Gh替代;超表达mexX菌株Pa34出现mexZ的164GCG→GAG、55Ala→Glu.结论 湖南省多重耐药Pa株大多存在主动外排的耐药机制,其耐药与外排基因Mex-AB-OprM和MexXY-OprM超表达有关.主动外排泵MexAB-OprM和MexXY-OprM超表达大多存在其调控基因突变.     

siHybrids技术沉默铜绿假单胞菌外排泵 mexB基因体外效应的初步研究

目的 初步研究siHybrids技术对铜绿假单胞菌野生菌PAO1外排泵mexB基因体外沉默效应。方法 针对铜绿假单胞菌野生株PAO1外排泵mexB基因设计并合成3条特异性siHybrids分子和1条阴性对照siHybrids分子。在分子浓度为50 nmol/L下,分别以合成的siHybrids分子干扰铜绿假单胞菌野生菌PAO1,并设实验组为铜绿假单胞菌野生菌PAO1空白对照组,阴性对照组scamble(sc)-001,干预组siHybrids( si) -001、siHybrids( si) -002及siHybrids( si) -003,分别在干预12h及24h后采用real-time PCR法检测各实验组中靶基因mexB基因mRNA的表达水平。进一步采用Mueller-Hinton倍比稀释法检测50 nmol/L浓度下,siHy brids分子干预铜绿假单胞菌野生菌PAO1前后氯霉素(CP)、红霉素(EM)、左氧氟沙星(L-OrLX)、头孢他啶(CAZ)、美洛培南(MER)的最小抑菌浓度(MIC)值。结果 不同siHybrids分子干预PAO1 12 h后,mexB基因mRNA表达量无明显差异性;但干预24 h后,mexB基因mRNA表达量：干预组（si-001,si-002,si-003）比空白对照组、阴性对照组（sc-001）有明显下降。对比干预12h、24h后mexB基因mRNA表达量,可以发现空白对照组、阴性对照组（sc-001）mRNA的表达量成上升趋势,而干预组（si-001,si-002,si-003）mexB基因mRNA表达量均呈下降趋势。siHybrids分子在干预铜绿假单胞菌野生菌24h前后的氯霉素(CP)、红霉素(EM)、左氧氟沙星( L-OFLX)、头孢他啶(CAZ)、美洛培南(MER) MIC无明显差异性。结论 在mRNA表达水平上,siHybrids分子能体外干预铜绿假单胞菌PAO1 mexB基因mRNA表达,此种沉默作用呈现时间依赖性,且在24h能有效地发挥干预作用。     

儿科对碳青霉烯类耐药铜绿假单胞菌产金属酶的研究

目的 了解目前儿科对碳青霉烯类抗生素耐药铜绿假单胞菌产金属酶的情况。方法 本研究收集了2003年12月至2005年11月，北京儿童医院住院患儿中分离出对碳青霉烯类抗生素耐药的铜绿假单胞菌59株。使用E试验法检测金属酶的耐药表型，PCR技术检测编码金属酶的IMP、VIM、SPM和GIM4种基因型。结果 本研究59株对碳青霉烯类抗生素耐药铜绿假单胞菌中，29株金属酶耐药表型结果阳性，占49．2％。39株金属酶基因型阳性，占66．1％，其中扩增出IMP型阳性35株，占89．7％，VIM型阳性4株，占10．3％。未检测出SPM和GIM型金属酶。对哌拉西林、哌拉西林-他唑巴坦产金属酶不敏感率高于非产金属酶菌株，差异有统计学意义（P〈0．05）。对产金属酶菌株β-内酰胺类抗生素头孢噻肟、头孢哌酮、头孢他啶、头孢吡肟、头孢哌酮-舒巴坦的MIC90均达到256μg／ml，MIC90均大于256μg／ml，高于非产金属酶菌株。结论 从本研究分离的菌株显示儿科铜绿假单胞菌产金属酶率高于成人报道，产金属酶是儿科分离对碳青霉烯类抗生素耐药铜绿假单胞菌的重要耐药机制。且以产IMP型金属酶为主，少部分产VIM型金属酶。产金属酶菌株对β-内酰胺类抗生素耐药比非产金属酶菌株更严重，尤其对哌拉西林和哌拉西林-他唑巴坦耐药性高。E试验法易用于铜绿假单胞菌产金属酶的初步筛选，但不能单独作为检测铜绿假单胞菌产生金属酶的确证性试验。     

ICU病房铜绿假单胞菌耐药性分析

目的了解我院重症监护室(ICU)感染铜绿假单胞菌患者耐药情况。方法对本院ICU病房所送的痰、尿、分泌物等标本进行细菌培养,采用K-B法对头孢菌素类氨基糖甙类碳青酶烯类单酰胺类等12种抗生素进行最低抑菌浓度分析。结果抗生素耐药率分别为氨苄西林100%,羧苄西林100%,头孢噻肟75%,头孢曲松61.7%,派拉西林56.9%,安曲南50.5%,替卡西林/克拉维酸59.4%,头孢哌酮/舒巴坦24%,头孢他啶27.8%,环丙沙星22.4%,阿米卡星22.4%亚胺培南21.6%等。结论铜绿假单胞菌耐药形势严峻,要加强消毒防御,控制铜绿假单胞菌医院感染的发生率并要做好该菌及其药物敏感长期的监测工作,临床医生要注意合理使用抗生素。     

耐环丙沙星铜绿假单胞菌的耐药性分析

目的 了解本地区铜绿假单胞菌的耐药情况及超广谱β-内酰酶（ESBLS）的检出率,以指导临床合理用药。方法对90株临床分离菌用纸片扩散法（K-B法）进行药物敏感性试验;纸片扩散表型确证法进行ESBLS检侧。结果本地区铜绿假单胞菌对氨苄西林、萘啶酸、哌拉西林、头胞噻肟、头胞吡肟、阿米卡星、环丙沙星、左氧氟沙星、司帕沙星、加替沙星、氨曲南、头胞他啶、亚胺培南、头胞呋辛的耐药率分别是90．0％、83．3％、77．2％、29．4％、5％、8．9％、65．0％、60．0％、62．2％、50．0％、7．2％、18．3％、0、47．2％;ESBLS的检出率为24．4％。结论本地区铜绿假单胞菌耐药情况不容乐观且多重耐药菌株较多;氟喹诺酮药物之间交叉耐药明显;产ESBLS率较高。     

生物膜铜绿假单胞菌对小白鼠的致病作用

目前生物膜菌感染的治疗是临床亟待解决的课题 ,因此对生物膜菌的致病机理需要深入的研究 ,才能有效的治疗生物膜菌引起的感染。对 6周龄、雄性清洁级小鼠 ,分别用铜绿假单胞菌悬液和生物膜状态的铜绿假单胞菌在小鼠气管内接种 ,进行 3项试验 :①以细菌浓度为 5× 10 6ＣＦＵ ｍｌ接种 2 0 μｌ 只测定鼠肺泡灌洗液 (ＢＡＬＦ)中白细胞数 ,结果见表 1。 2种细菌接种后ＢＡＬＦ中的白细胞数差异有显著性 (Ｐ <0 .0 1)。②测定 2组感染小鼠的存活率每组 30只小鼠分别将 10 6ＣＦＵ ｍｌ的 2组菌液 2 0 μｌ 只接种到鼠气管内 ,观察 10ｄ小鼠存…     

抗生素单一或联合用药诱导铜绿假单胞菌释放内毒素的比较性研究

目的 观察不同种类抗生素单独或联合应用对铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，Pa）释放内毒素（lipopolysaccharide，LPS）的影响，探讨其规律、特点及可能机制，为临床抗生素的合理选择提供参考。方法 选择临床上常用的6种抗生素：哌拉西林/他唑巴坦钠（PIP／TAZ），头孢哌酮（CPZ），亚胺培南/西司他丁钠（IPM／CIL），美罗培南（MEM），环丙沙星（CIP），阿米卡星（AMK），以0．5倍最小抑菌浓度（0．5mc）单一或联合体外作用于Pa，观察不同时相点抗生素的杀菌作用和细菌形态学改变，检测培养上清液中LPS水平。结果 6种抗生素单独应用时杀菌效应差异无统计学意义，联合用药组优于单一用药组。各种抗生素在引起细菌形态学改变的同时，诱导LPS释放程度不一。PIP／TAZ、CIP、MEM组作用后导致细菌成丝状变并伴随大量LPS释放，IMP／CIL组则引起细菌球状变，释放LPS相对较少。联合用药组及CPZ组大部分裂解，释放LPS明显减少。随作用时间延长，抗生素诱导LPS释放水平增加。结论 抗生素单独或联合体外作用于铜绿假单胞菌均可诱导LPS的释放，其释放水平与抗生素的种类、作用时间及细菌形态改变有关。临床抗感染治疗时在考虑抗菌效应同时应尽量选用低LPS诱导量的抗生素。     

三种检测铜绿假单胞菌AmpC酶方法的评价

目的探讨一种简便易行，适用于临床微生物实验室常规开展检测AmpCβ内酰胺酶（简称AmpC酶）的方法。方法对临床分离的150株铜绿假单胞菌用表型筛选试验作AmpC酶测定，对AmpC酶阳性菌株同时进行氯唑西林双纸片协同试验、氟氯西林（FCC）双抑制剂扩散协同试验、PCR基因检测。用基因检测来评价比较三种测定方法的检出率及差异。结果表型筛选试验AmpC酶阳性37株同时进行氯唑西林双纸片协同试验、氟氯西林双抑制剂扩散协同试验、基因检测，检测出阳性株分别为15、14、11株，阳性率分别是40．54％（15／37）、37．84％（14／37）、29．73％（11／37）。表型筛选试验与后三种方法比较差异有统计学意义（P〈0．01），后三种方法结果比较差异无统计学意义（P〉0．05）。结论氯唑西林双纸片协同试验、氟氯西林双抑制剂扩散协同试验检测AmpC酶特异性较表型筛选试验高，且操作简便、结果可靠，适合临床实验室常规检测应用。     

深圳地区铜绿假单胞菌医院感染及耐药性

目的了解铜绿假单胞菌(队)引起医院感染的特点以及对抗生素的耐药性的变化趋势．方法对2001-2003年分离出的317株铜绿假单胞菌选用12种抗生素进行药敏实验，按NCCLS标准判断．结果该菌主要来源于痰液和咽拭子(65％)，主要分布在呼吸科(12％)、脑外科(12％)、ICU(10％)、新生儿科(9％)、呼吸科ICU(7％)、老年病科(7％)．2001年．2003年铜绿假单胞菌对环丙沙星耐药率呈上升趋势，2001年-2002年对头孢噻肟耐药呈直线上升，2003年稍有下降．2001年．2003年对哌拉西林(PIP)、哌拉西林／他唑巴坦(TZP)、庆大霉素(GEN)、阿米卡星(AMK)、头孢吡肟(FEP)、氨曲南(ATM)、头孢他啶(CAZ)耐药率呈下降趋势．2001年-2002年对亚胺培南(IPM)、美罗培南(MEM)耐药率呈显著下降趋势，2002年-2003年稍有上升．对头孢曲松(CRO)耐药率相对稳定．结论了解铜绿假单胞菌的耐药现状，有利于为临床合理用药提供依据．     

铜绿假单胞菌的药物敏感试验结果分析

目的了解铜绿假单胞菌在本院的分布及对抗生素的敏感情况,为临床治疗提供科学依据。方法回顾性调查本院2008年1月至2009年10月住院及门诊患者各种标本分离的铜绿假单胞菌的分布及对抗生素的敏感情况。结果铜绿假单胞菌在呼吸道标本的检出率最高,占63.8%,其次是伤口分泌物标本,占18.3%,尿液标本占9.2%,血液标本占2.5%;其对11种抗生素的敏感率最高是妥布霉素,其次是哌拉西林/他唑巴坦,检出多重耐药株约占35%,未出现泛耐药株。结论根据药敏结果合理使用抗生素,并重视对多重耐药株的监测工作,可有效控制感染。     

铜绿假单胞菌对β-内酰胺类抗生素耐药机制

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa即PA)．为条件致病菌。是院内感染的常见致病菌。常引起菌血症、肺炎、泌尿系感染、烧伤感染和囊性纤维化继发感染等疾病。铜绿假单胞菌能够通过不同的机制对各类抗生素产生药物耐受性，导致抗生素治疗的失败。β-内酰胺类抗生素是一类在临床上应用最广泛的抗生素，近年来铜绿假单胞菌对其耐药率不断升高。本文对铜绿假单胞菌对β-内酰胺类抗生素耐药机制作一综述。     

铜绿假单胞菌的GM-PFGE分型的研究

目的研究全基因组ＤＮＡ稀有位点限制性内切酶酶切脉冲电场电泳图谱（ＧＭ－ＰＦＧＥ）在铜绿假单胞菌基因分型中的应用,并与表型分型比较。方法对１个月内来自两个医院的病人及环境的２０株铜绿假单胞菌进行了ＧＭ－ＰＦＧＥ图谱分析,同时进行３０种生化反应的统计分型、２３种药物的敏感性分型、胞外脂多糖的血清抗原分型;并利用数值分类软件包进行相关性比较研究。结果临床致病铜绿假单胞菌的生化表型基本稳定,但其药物抗性的获得与丢失较为明显。血清型、生化性状及药物抗性之间无明显对应关系。当２菌株ＧＭ－ＰＦＧＥ图谱条带相似系数大于８０％时,为同一菌株的不同克隆亚型,当相似系数在２５％～７０％之间时,则为不同菌株。结论ＧＭ－ＰＦＧＥ分析可显示染色体结构的区域多型性,其重复性好,分辨率明显高于表型分型,结果可靠,必将成为铜绿假单胞菌或其它病原微生物分子流行病学研究的有力工具。     

临床分离的铜绿假单胞菌对头孢噻肟的耐药性分析

目的：测定铜绿假单胞菌对头孢噻肟的耐药性。方法：采用琼脂二倍稀释法测定铜铝假单胞菌对头孢噻肟的MIC值。用铜绿假单胞菌ATCC27853标准菌株作为质控标准。按照美国临床实验标准委员会（NCCLS）2004年颁布的标准操作和判定结果。结果：铜绿假单胞菌对头孢噻肟的耐药率为59．18％。结论：临床分离的铜绿假单胞菌对头孢噻肟高度耐药，应考虑通过进行细菌培养和药敏试验，合理选用抗生素，或选用有协同作用的二联疗法来提高抗铜绿假单胞菌感染的疗效。     

应用siRNA干扰技术沉默铜绿假单胞菌外排泵基因mexB的蛋白表达

目的 观察siRNA干扰质粒转入铜绿假单胞菌后,MexB蛋白表达量的变化.方法 针对mexB基因设计合成特异性siRNA分子,与pGPU6/GFP/Neo载体连接,构建pGPU6/GFP/NeosiRNA重组质粒.构建重组表达质粒pET22b+/mexB,并转化大肠杆菌BL21( DE3) plysS,诱导表达MexB蛋白,蛋白纯化后免疫家兔制备多克隆抗体.siRNA质粒分别电转化铜绿假单胞菌野生株、临床耐药株及mexB基因高表达株,运用Western blot观察转化8、12、24h后MexB蛋白表达量的变化.结果 成功构建pGPU6/GFP/Neo-siRNA重组质粒.成功表达铜绿假单胞菌外排泵蛋白MexB,并制备多克隆兔抗.siRNA质粒对铜绿假单胞菌野生株、临床耐药株及mexB基因高表达株的mexB基因均具有良好的沉默效果,而且沉默效果存在时间差异性.结论 siRNA质粒转化3株铜绿假单胞菌后,在8h及12 h时均可观察到MexB蛋白表达量明显减少,而在24 h时MexB蛋白表达量无改变.     

烧伤患者铜绿假单胞菌感染及耐药性分析

目的探讨烧伤患者铜绿假单胞菌（PAE）感染后对抗菌药物的耐药性，为临床合理应用抗菌药物提供指导。方法回顾性分析2003年1月至2006年12月间烧伤患者并发PAE感染患者的临床资料。结果PAE对亚胺培南、头孢他啶、庆大霉素、阿米卡星、哌拉西林的耐药率逐年增高。结论PAE耐药日益严重，并出现多重耐药。临床医师应在药物敏感试验结果指导下用药，适当控制抗菌药物的应用，并注重抗菌药物以外的其他治疗。