RNA干扰survivin基因对人肝癌HepG2细胞增殖影响

目的 探讨RNA干扰技术抑制survivin基因表达对人肝癌细胞株HepG2细胞增殖的影响.方法 构建针对人肝癌HepG2细胞 survivin基因3个不同靶序列的 shRNA真核表达载体pshRNA-survivin-323/387/52,用Lipofectamine 2000脂质体介导转染法转染质粒, 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测survivin 基因mRNA表达水平.选择对survivin基因表达抑制作用最强的shRNA载体转染HepG2细胞后, 免疫细胞化学法(ICC)检测HepG2细胞survivin蛋白的表达情况,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测各组细胞的增殖情况.结果 与对照组比较,构建的3个shRNA质粒中pshRNA-survivin-387转染组survivin mRNA水平下调,差异有显著性(F=18.64,q=4.293～4.925,P<0.05),而pshRNA-survivin-323/52质粒对survivin的表达及mRNA水平的影响差异无显著性(q=0.631～0.126,P>0.05).转染pshRNA-survivin-387质粒的HepG2细胞survivin蛋白表达较对照组明显下调(F=68.39,q=13.71、14.37,P<0.01),其增殖能力较对照组显著下降(F=20.06～47.65,q=11.186、 12.601,P<0.01).结论 构建的针对人survivin基因387位靶序列的shRNA表达载体pshRNA-survivin-387可显著抑制survivin的表达及HepG2细胞增殖.     

RNAi技术沉默PTHrP基因的表达诱导软骨肉瘤细胞凋亡的实验研究

目的 研究甲状旁腺相关蛋白(parathyroid hormone-related protein,PTHrP)对软骨肉瘤细胞增殖的影响.方法 本实验设置空白对照组、空质粒组和siPTHrP转染组,每组样本数均为6.空白对照组不做处理;分别将空质粒pSilencer3.1 H1 neo(空质粒组)和重组质粒pSilencer3.1H1 neo-siPTHrP(siPTHrP转染组)转染至SW1353软骨肉瘤细胞株,通过MTT法检测各组细胞活力并绘制细胞生长曲线,利用流式细胞技术测定细胞凋亡率,半定量RT-PCR和Western blotting法检测PTHrP基因在mRNA水平及蛋白水平表达上的变化.结果 siPTHrP转染组的细胞生长较空白对照组软骨肉瘤细胞明显缓慢;siPTHrP转染组细胞凋亡率明显升高;重组质粒pSilencer3.1H1 neo-siPTHrP能明显抑制软骨肉瘤细胞的PTHrP基因在mRNA转录水平和蛋白水平上的表达.结论 重组质粒pSilencer3.1H1 neo-siPTHrP可明显抑制软骨肉瘤细胞增殖及其内源基因PTHrP在mRNA转录水平和蛋白水平的表达,为PTHrP介导的软骨肉瘤基因沉默疗法提供了理论基础.     

RNA干扰技术抑制EC-109细胞survivin基因表达及其促凋亡研究

目的:应用RNA干扰技术(RNAi)研究针对survivin基因的siRNA,抑制survivin基因的表达并诱导食管癌细胞系EC-109细胞的凋亡. 方法:构建针对survivin的siRNA表达质粒,转染至EC-109细胞,荧光显微镜判断转染效率,蛋白质印迹和半定量RT-PCR检测survivin蛋白表达及基因转录水平的变化,并在不同时间点收集转染细胞,利用流式细胞术及基因组DNA凋亡检测试剂盒,观察siRNA抑制survivin基因表达后诱导细胞凋亡的情况. 结果:荧光显微镜结果表明,重组质粒转染效率达46.70%. 半定量RT-PCR检测到pSIREN/S质粒在EC-109细胞内对survivin基因的转录抑制率为74.04%;蛋白质印迹结果表明,转染重组质粒pSIREN/S的EC-109细胞survivin蛋白表达量仅为正常组的41.64%,而对照质粒pSIREN/CN对survivin基因的蛋白表达及转录均没有抑制作用. 经pSIREN/S转染的EC-109细胞基因组DNA出现明显的DNA ladder,流式细胞仪分析结果也显示凋亡细胞为60.78%. 结论:survivin特异性siRNA可明显抑制survivin基因的转录和表达,并能有效地诱导EC-109细胞的凋亡,为下一步在体内利用pSIREN/S重组质粒沉寂survivin基因,促肿瘤细胞的凋亡提供实验基础.     

RNAi沉默survivin基因表达对膀胱癌EJ细胞增殖的影响

目的 通过RNA干扰(RNAi)阻断EJ细胞中survivin基因的表达,研究survivin基因沉默后对细胞生长和细胞凋亡的影响.方法 将合成的DNA正义链及反义链变性、退火,形成的双链DNA与pSilencer2.0线性质粒以T4 DNA连接酶连接,重组质粒经酶切、DNA测序鉴定后,用脂质体法转染EJ细胞,通过RT-PCR、免疫印迹检测干扰效果.MTT法检测细胞生长的影响,流式细胞仪检测转染后EJ细胞的凋亡变化.结果 酶切及测序证实设计合成的DNA片段已正确插入载体.RT-PCR、免疫印迹检测实验表明:pSilencer2.0-SVV1、pSilencer2.0-SVV2重组载体均能有效地阻断EJ细胞中survivin基因的表达,使survivin基因在mRNA和蛋白水平上的表达明显下调(P<0.01),后者抑制效果更佳.转染后的EJ细胞生长速度明显变慢.转染pSilencer2.0-SVV2实验组细胞的凋亡增加了17.0%.结论 重组真核载体能有效抑制EJ细胞的survivin表达,抑制细胞的增殖,诱导细胞凋亡.     

RNA干扰技术特异性抑制骨肉瘤survivin的表达

目的:体外转录合成survivin siRNA,观察其在骨肉瘤细胞株U2-OS中抑制survivin的表达情况.方法:体外转录合成survivin序列特异性双链RNA(dsRNA),转染U2-OS细胞株中,用RT-PCR和Western blot法检测转染前后survivin基因的mRNA和蛋白的表达,MTF法检测细胞增殖,观察U2-OS细胞生物学特性的改变.结果:转染特异性siRNA的细胞其survivin mRNA及蛋白表达均下调,干涉后细胞的增殖受到抑制.结论:体外转录合成特异性survivin siRNA能有效抑制骨肉瘤细胞株U2-OS中survivin的表达,抑制细胞的增殖,RNA干扰技术为骨肉瘤的治疗提供了一种新策略.     

RNA干扰技术特异性抑制肾癌survivin表达的实验研究

目的:体外转录合成survlvin siRNA(Small interference RNA,siRNA),观察其在肾癌786-O细胞株中抑制survivin的表达情况.方法:体外转录合成3组survivin序列特异性双链RNA(Double-stranded RNA,dsRNA),转染786-O细胞株中,用RT-PCR和Western blot检测转染后survivin基因的mRNA和蛋白的表达,MTT法检测细胞活性.结果:有2组转染特异性siRNA的786-O细胞表达survivin mRNA及蛋白均下调.活性受到抑制,另一组效果不明显.结论:体外转录合成特异性survivin siRNA能有效抑制肾癌786-O细胞中survivin的表达,抑制细胞的活性,RNA干扰(RNA interfering,RNAi)技术可能为肾癌的基因治疗提供一种新策略.     

survivin特异性RNAi表达载体的构建及其干扰效果鉴定

目的 构建survivin基因的RNAi真核表达载体并观察其对转染腺样囊性癌细胞株ACC-2后survivin表达变化以及对细胞凋亡的影响.方法 设计、合成siRNA(small interfering RNA),构建表达载体pGenesil-shRNA-survivin,将重组质粒导入人腺样囊性癌ACC-2细胞株.采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测转染后的ACC-2细胞中survivin mRNA表达的变化,用TUNEL检测细胞凋亡的变化.结果 经测序模版序列和设计序列完全正确,在pGenesil-shRNA-survivin转载ACC-2细胞株中,survivin mRNA表达明显降低,转染的ACC-2细胞凋亡显著增加.结论 成功构建了survivin基因的RNAi真核表达载体,且其对腺样囊性癌细胞有一定的干扰效果.     

siRNA干扰survivin表达对腺样囊性癌细胞株ACC-M的抑制作用

目的探讨靶向survivin基因RNAi对腺样囊性癌增殖的抑制效应。方法设计、合成siRNA(small interfering RNA),构建表达载体pGenesil-shRNA-survivin,将重组质粒导入人腺样囊性癌ACC-M细胞株。采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western-blot法分别检测转染后的ACC-M细胞中survivin mRNA和蛋白表达的变化,用噻唑蓝(MTT)法来检测细胞的增殖。结果测序证实表达载体构建成功,在pGenesil-shRNA-survivin的ACC-M细胞株中,survivin mRNA及蛋白表达明显降低,ACC-M细胞增殖受到抑制。结论pGenesil-shRNA-survivin重组质粒能有效抑制腺样囊性癌细胞增殖。     

ATM基因siRNA真核表达载体的构建及其对转染宫颈癌细胞株ATM表达的抑制作用

目的:研究特异性siRNA对宫颈癌ATM基因的阻抑效果以及用RNAi效应对宫颈癌做基因治疗的可行性. 方法:构建可表达人ATM基因siRNA的重组真核表达质粒pSuppressorNeo-ATM,电穿孔法转染Siha宫颈癌细胞株. 应用RT-PCR,Western blot,流式细胞术、免疫荧光法等方法检测转染的宫颈癌细胞中ATM基因的表达水平. 结果:RT-PCR, Western-blot均表明瞬时转染pSuppressorNeo-ATM的宫颈癌细胞中ATM 基因的表达受到明显抑制,流式细胞术、免疫荧光法检测表明ATM蛋白含量明显下降. 结论:pSuppressorNeo-ATM质粒构建成功,瞬时转染宫颈癌细胞后可以明显抑制ATM基因的表达.     

RNA干扰技术阻断EJ细胞中survivin基因的表达

目的:用真核转录载体pSilencer2.0构建针对survivin基因的重组真核转录载体,并转染膀胱肿瘤细胞系EJ,通过RNA干扰(RNAi)阻断EJ细胞中survivin基因的表达.方法:将合成的DNA正义链及反义链变性、退火,形成的双链DNA与psilencer2.0线性质粒以T4DNA连接酶连接,重组质粒经酶切、DNA测序鉴定后,用脂质体法转染EJ细胞,通过RT-PCR、免疫印迹检测干扰效果.结果:酶切及测序证实设计合成的DNA已正确插入载体.RT-PCR、免疫印迹检测实验表明:pSilencer2.0-SVV1、pSilencer2.0-SVV2重组载体有效地阻断了EJ细胞中survivin基因的表达,survivin基因在mRNA和蛋白水平上的表达明显下调(P<0.01),其中pSilencer2.0-SVV2重组载体干扰效果更佳.结论:成功构建了针对survivin基因的真核转录载体pSilencer2.0-SVV1、pSilencer2.0-SVV2,两者均可有效地阻断膀胱癌细胞系EJ细胞中survivin基因的表达,pSilencer2.0-SVV2重组载体效果更佳,这为后继实验研究打下基础.     

Induction of apoptosis of human colon cancer cells by siRNA recombinant expression vector targeting survivin gene

This study constructed siRNA recombinant expression vector targeting survivin gene and observe the apoptosis induction effect of it in human colon cancer cells, siRNA recombinant expression vector targeting survivin gene was constructed and transfected into human colon cancer cells. The effect of siRNA recombinant expression vector was detected by RT-PCR, Western blot, MTT reduction assay and flow cytometry. It was confirmed by restriction endonuclease and sequence analysis that siRNA recombinant expression vector targeting survivin gene was constructed successfully. Inhibition rate of survivin siRNA at mRNA and protein levels was 36.33% and 44.65% respectively. Growth of cancer cells was inhibited and the apoptosis rate was （17.24±2.13）%. The siRNA recombinant expression vector targeting survivin gene has been constructed successfully. It not only can inhibit the expression of survivin gene, but also can induce apoptosis in human colon cancer cells remarkably.     

靶向survivin的siRNA诱导胰腺癌细胞凋亡的实验研究

目的 采用RNA干扰技术（siRNA）阻断survivin基因的表达,观察其抑制胰腺癌细胞增殖及诱导胰腺癌细胞凋亡的作用。方法 构建靶向survivin的siRNA质粒表达载体,采用Lipofectamine^TM2000转染胰腺癌细胞PC-2,采用半定量RT-PCR、免疫组化技术检测转染前后PC-2细胞survivin基因表达的变化;采用MTT法检测对PC-2细胞增殖的抑制作用：采用流式细胞术检测其诱导PC-2细胞凋亡的作用。结果 靶向survivin的序列特异性的siRNA可以高效地抑制PC-2细胞survivin基因表达,在mRNA水平其表达抑制率为81．25％,在蛋白质水平其表达抑制率为74．24％。转染靶向survivin的siRNA质粒表达载体可以显著抑制PC-2细胞的增殖,细胞接种24、48h后其增殖抑制率分别为28．00％和33.38％：转染后24、48h可以诱导8．46％、7．53％的细胞凋亡。结论 所构建的靶向survivin的siRNA质粒表达载体可以有效地阻断PC-2细胞survivin基因表达。阻断survivin基因表达可以显著地抑制PC-2细胞的增殖并在一定程度上诱导其凋亡,靶向survivin的siRNA在胰腺癌的基因治疗中具有一定的价值。     

siRNA对HepG2细胞survivin表达的抑制作用

目的　研究siRNA对肝癌细胞株HepG2中survivin基因表达的抑制作用。 方法　设计、合成一对survivin编码基因的反向重复序列 ,中间间隔 9个核苷酸序列 ,通过定向克隆至载体PSilencer 2 .1,构建siRNA真核表达载体 ,经稳定转染HepG2细胞后应用RT PCR及流式细胞术检测肝癌细胞中survivin基因mRNA及蛋白质表达的抑制情况。 结果　测序证实siRNA真核表达载体构建成功。通过RT PCR及流式细胞术检测 ,siRNA在mRNA及蛋白质水平抑制survivin基因表达分别达 73%和 75 %。结论　构建的PSilencer( ) survivin重组质粒能有效抑制survivin基因在肝癌细胞株HepG2中的表达 ,从而为肿瘤的生物学治疗提供了新的方法和材料。     

Effect of siRNA Targeting Survivin Gene on the Biological Behavior of Hepatocellular Carcinoma

To study the influence of siRNA targeting survivin gene on the biological behavior of hepatocellular carcinoma (HCC), one pair of 21bp reverse repeated motifs of survivin target sequence with 9 spacers were synthesized and inserted into plasmid psilencer2.1 to generate siRNA eukaryotic expression vector. After stable transfection into HepG2 cells, the biological behaviors of the survivin siRNA transfected HCC cells were observed. After the recombinant plasmid Psilence( )-survivin was successfully constructed, survivin mRNA and protein expression inhibition ratio reached 73% and 75% respectively compared to control groups. Transfected cells with survivin siRNA demonstrated significantly inhibited cell growth and increased apoptosis. Subsequent study in nude mouse model demonstrated lower succeeding rate in cells transfected with survivin siRNA and slow growth rate. The results elucidated the siRNA targeting survivin gene could specially suppress its expression in HepG2 cells and inhibit tumor cells growth both in vivo and in vitro. This provides a theoretical basis to turn the drug resistance in tumor cells.     

RNA干涉下调survivin基因对人肝癌细胞的生长抑制及促凋亡作用

目的：探讨RNA干涉技术下调survivin基因表达对人肝癌细胞的生长抑制及促凋亡的作用,为肝癌的基因治疗提供有效靶点及技术。 方法：构建pSU6-si-survivin重组质粒,转染人肝癌细胞株Bel7402,设空白组、阴性组和治疗组,采用MTT法检测肝癌细胞的增殖活性,RT-PCR检测survivin基因mRNA水平,Western blotting及免疫组化法检测survivin蛋白表达,流式细胞技术(FCM)及AO/EB染色观察细胞凋亡。结果：MTT法检测,治疗组24、48〖JP3〗和72　h细胞生长抑制率(%)分别为21.43±1.67、39.07±3.80和59.72±〖JP〗7.05,与阴性组比较差异有显著性 (P<0.01）。RT-PCR及Western blotting检测,治疗组细胞survivin基因在mRNA及蛋白水平上表达均下降,上述产物量与β-actin的比值与空白组和阴性组比较差异均有显著性（P<0.01）。FCM检测治疗组细胞阻滞于G₀/G₁期,凋亡率为（20.65±1.28）%,与空白组及阴性组比较差异有显著性(P<0.01)。AO/EB双染色治疗组细胞呈早中期凋亡。结论：重组质粒pSU6-si-survivin可抑制survivin基因在人肝癌细胞中的表达,抑制肝癌细胞生长,促进肝癌细胞凋亡;survivin基因可作为肝癌基因治疗的重要靶点。     

短发夹RNA靶向抑制suvivin基因对人胶质瘤U251细胞凋亡和细胞周期的影响

目的: 构建表达靶向抑制survivin基因的表达短发夹结构 (shRNA)的RNA干扰载体,导入人胶质瘤细胞U251中,研究靶向抑制survivin基因对U251细胞的凋亡诱导以及细胞周期阻滞作用. 方法: 在survivin全长序列中选取设计3条含19个核苷酸(19nt)靶序列两条反向重复序列,中间以9个核苷酸的茎环序列,两端分别加上对应的酶切位点,分步酶切连接,构建出含有3条shRNA模板且能独立编码shRNA的重组干扰载体pGenesil-1/survivin; 采用Metafectene转染试剂将干扰质粒导入到胶质瘤细胞U251;采用荧光定量PCR以及Western bloting分别从mRNA和蛋白水平检测干扰效果;采用Annexin-V/PI双色标记的流式细胞仪法检测siRNA诱导的细胞凋亡,PI染色检测细胞周期阻滞. 结果:实时荧光定量PCR以及Western blotting检测显示,survivin基因的mRNA转录水平以及蛋白水平的表达均得到显著抑制;流式细胞仪检测分析显示,survivin基因表达被抑制后,U251细胞凋亡率明显增高,细胞周期出现明显的G2/M阻滞. 结论: 靶向survivin基因的重组siRNA干扰载体pGenesi-l/survivin介导的RNAi显著靶向抑制了survivin基因在人胶质瘤细胞U251中的表达, 并明显地诱导了U251细胞发生凋亡和G2/M期细胞周期阻滞.     

小分子干扰RNA靶向抑制suvivin基因诱导U251细胞凋亡的实验研究

目的 构建靶向survivin基因的小分子干扰RNA（siRNA）表达载体,导入人胶质瘤细胞U251中,研究siRNA靶向抑制survivin基因对U251细胞的凋亡诱导作用。方法根据siRNA设计原则,在survivin全长序列中选取设计含19个核苷酸（19nt）靶序列两条反向重复序列,间以9个核苷酸的茎环序列,两端分别加上对应的酶切位点．形成siRNA的DNA模板并克隆到siRNA表达载体pGenesil-1中,获得靶向抑制survivin基因的siRNA表达载体pGenesil-1／survivin;采用Metafectene转染试剂将干扰质粒导入到胶质瘤细胞U251;分别采用实时荧光定量PCR以及Western bloting从mRNA和蛋白水平检测干扰效果;采用Annexin—V／PI双色标记的流式细胞仪法检测siRNA诱导的细胞凋亡。结果实时荧光定量PCR以及Western blotting显示：survivin基因的mRNA转录水平以及蛋白水平的表达均得到显著抑制：流式细胞仪检测结果显示：survivin基因表达被抑制后,U251细胞凋亡率明显增高。结论靶向survivin基因的重组siRNA干扰载体pGenesi—l／survivin介导的RNAi显著靶向抑制了survivin基因在人胶质瘤细胞U251中的表达,并明显诱导了U251细胞发生凋亡。