MTB39A蛋白在昆虫细胞-杆状病毒系统中的表达与鉴定

目的 旨在获得具有免疫原性的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)MTB39A蛋白。方法 选择H37Rv株中的MTB39A(Rv1196)基因序列(GenBank ID:NC＿000962.3)克隆至pFastBac-Dual载体pH启动子下游并进行鉴定。将鉴定正确的重组质粒转化入感受态细胞DH10 Bac中进行蓝白斑筛选,获得的重组杆状质粒Bacmid利用脂质体转染至昆虫细胞Sf9中进行病毒拯救。转染后96 h,收取上清病毒液,盲传3代后采用直接和间接免疫荧光法及Western blot检测MTB39A蛋白的表达。结果 重组质粒pFastBac-dual-MTB39A-mCherry和重组Bacmid构建正确,Western blot检测显示MTB39A蛋白能被His-tag抗体识别,IFA鉴定出现特异性红色荧光。结论 通过昆虫杆状病毒表达系统成功表达具有反应原性的MTB39A蛋白,为新型结核疫苗候选物和潜在特异性诊断标志物的研制奠定了实验基础。     

恶性疟原虫pfK13-F446I基因重组杆状病毒质粒的构建及其在昆虫细胞SF9中的表达

目的构建恶性疟原虫Kelch 13-F446I(pfK13-F446I)基因重组杆状病毒质粒,并在昆虫细胞SF9中表达。方法体外合成恶性疟原虫Kelch 13野生型和F446I蛋白结构域片段碱基,定向克隆至转移载体pFastBac,构建pfK13-WT-Bac和pfK13-F446I-Bac质粒,转化大肠埃希菌DH10Bac感受态细胞后进行基因重组。提取重组病毒,PCR和Western blot验证后转染草地贪夜蛾细胞(SF9)。收集亲代重组病毒反复感染SF9细胞进行病毒扩增,优化可溶性蛋白的纯化条件,采用SDS-PAGE电泳分析重组蛋白表达情况。结果构建了含恶性疟原虫pfK13-F446I基因的重组质粒pfK13-F446I-Bac,大小约3 430 bp。转染SF9细胞后获得有感染力的重组杆状病毒,并在SF9细胞中表达pfK13-F446I蛋白,经梯度洗脱、去标签、透析等获得大小为44 ku的单一电泳条带的pfK13-F446I蛋白。结论成功构建pfK13-F446I基因重组杆状病毒质粒,并在昆虫细胞SF9中进行成功表达。     

猪流感H1N1亚型NP基因杆状病毒表达载体构建及其在昆虫细胞中的表达

目的获得研发A型猪流感病毒ELISA检测试剂盒和制备NP蛋白单克隆抗体的抗原物质。方法根据已报道的猪流感病毒H1N1亚型NP基因序列(GenBank登录号:GQ422386)人工合成NP基因,通过XbaⅠ和EcoRⅠ特异性酶切,将NP基因克隆于昆虫杆状病毒表达载体pFastBacHTB,经PCR、酶切、测序鉴定后,获得携带NP基因的重组质粒pFast-BacHTB-NP。该重组质粒转化含有杆状病毒穿梭载体的DH10Bac感受态细胞,经抗生素、PCR筛选,获得转座的杆粒Bac-mid-NP。在脂质体介导下转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒,再感染细胞,收获目的蛋白。结果通过SDS-PAGE和Westernblotting分析表明该蛋白得到表达,且具有良好的生物活性,大小约为57KD。结论实验结果表明已成功构建了携带NP基因的重组质粒pFastBacHTB-NP和转座的杆粒Bacmid-NP,转染后在sf9昆虫细胞上成功的表达。     

基于昆虫细胞-杆状病毒表达系统的SARS-CoV-2 S1蛋白的高效表达

目的 设计、构建表达新型冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2) S1蛋白的重组杆状病毒,建立并优化其在昆虫细胞中的生产工艺,为新型冠状病毒肺炎(COVID-19)血清学诊断方法的建立及疫苗开发奠定基础。方法 利用分子克隆技术将S1基因插入pFastBac^TM 1质粒,获得重组质粒pFastBac-S1,经转座获得重组杆粒rbacmid-S1,转染Sf9细胞后包装获得重组杆状病毒rBV-S1,通过rBV-S1感染High Five^TM(Hi5)细胞表达S1蛋白,使用Western blot分析鉴定S1蛋白的表达。在此基础上,建立优化rBV-S1扩增和蛋白表达的工艺,以实现S1蛋白的高效表达。结果 通过特异性引物PCR扩增重组质粒pFastBac-S1与重组杆粒rbacmid-S1,获得大小分别为2 367 bp、4 370 bp的基因片段,表明S1基因成功克隆入pFastBac^TM 1质粒与bacmid;采用Western blot分...     

昆虫杆状病毒系统表达人流感多表位基因盒的研究

目的 通过昆虫-杆状病毒表达系统表达人流感病毒多表位基因盒,为进一步研发通用型流感疫苗提供实验依据。方法 将甲型流感病毒H1N1颈部区(345aa-566aa)和H1/H3/B亚型HA2片段经4GS Linker串联M2e及ferritin蛋白构成的HA2-M2e-ferritin(简称HMf),参照A/Jilin/JYT-01/2018(H1N1)毒株的全基因组序列,将其HA2基因和HMf基因序列按照昆虫细胞密码子偏好性进行优化合成,经两次双酶切后分别克隆至pFastBacTM双载体中。热激法将重组质粒转化入DH10BacTM大肠埃希菌感受态,含目的基因的pFastBacDual-HA2-HMf转移载体与DH10Bac的Bacmid质粒重组,构建重组转移质粒rBacmid-HA2-HMf。在脂质体介导下,用rB-HA2-HMf转染Sf9细胞进行重组杆状病毒的拯救。通过限制性酶双酶切、测序、重组Bacmid PCR、Western blot和间接免疫荧光法(IFA)鉴定目的蛋白的表达。用重组杆状病毒感染悬浮sf9细胞,收取细胞悬液,经超速离心、蔗糖密度梯度离心获得重组蛋白,利用透射电镜...     

利用杆状病毒系统表达重组HBV聚合酶RT区段

目的利用杆状病毒表达载体系统制备重组HBV聚合酶RT区段蛋白。方法构建含有HBVP基因RT区段的杆状病毒转移载体pFastBac HT-RT，转化大肠埃希菌DH10B-ac进行重组，提取重组BacmidDNA质粒，转染昆虫细胞SD获得含有HBVP基因RT区段的重组杆状病毒。重组的杆状病毒再感染SO细胞进行HBVP基因RT区段蛋白表达，通过Western blot检测表达情况。结果成功构建了含HBVP基因RT区段的重组杆状病毒，昆虫细胞Sf9中能检测到HBVP基因RT区段蛋白的表达。结论利用杆状病毒表达系统能成功地表达HBVP基因RT区段蛋白。     

II型登革病毒NS1基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达

目的获得II型登革热病毒NS1基因并在昆虫细胞中表达,为进一步研发登革热血清学检测试剂盒提供抗原。方法RT-PCR扩增II型登革热病毒NS1基因并测序列,并定向克隆入杆状病毒转移载体pFastBac-HTA,获得重组转移载体pFastBac-NS1。并将pFastBac-NS1转化到DH10Bac感受态细胞中,筛选到重组转座子rBacmid-NS1。在脂质体介导下将rBacmid-NS1转染Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒rBV-NS1。rBV-NS1感染Sf9细胞后,通过SDS-PAG和Western blot检测NS1重组蛋白。结果成功克隆II型登革病毒NS1基因,SDS-PAGE、间接免疫荧光和Western blot检测表明NS1基因在昆虫细胞得到表达,能与登革患者血清发生特异性免疫反应,具有免疫原性。结论II型登革病毒非结构蛋白NS1在昆虫中表达,为进一步研究NS1的生物学特性和血清学检测奠定基础。     

H5N1亚型禽流感病毒NS1基因在大肠杆菌和昆虫细胞中的表达

目的构建大肠杆菌表达载体pET-NS1和昆虫杆状病毒转移载体pFast-NS1,将H5N1亚型禽流感病毒NS1基因分别在大肠杆菌和昆虫细胞中进行表达,表达产物用Western blot进行检测分析。方法酶切含有NS1基因的质粒pUC-NS1,分别克隆进大肠杆菌表达载体pET-28a(+)和杆状病毒转移载体pFastBac HT A中,分别获得表达载体pET-NS1和pFast-NS1。将pET-NS1转化大肠杆菌BL21,以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达;将pFast-NS1转化DH10Bac感受态细胞,提取重组Bac-NS1DNA,以M13为通用引物作PCR鉴定,阳性Bac-NS1用脂质体转染sf9细胞,72h后收集感染细胞。大肠杆菌表达产物和细胞表达产物分别裂解后作SDS-PAGE和Western blot分析。结果成功构建了大肠杆菌表达载体pET-NS1和昆虫杆状病毒转移载体pFast-NS1,大肠杆菌和昆虫细胞中表达的融合蛋白Western blot都能检测到特异性条带。结论NS1基因在大肠杆菌和昆虫细胞中得到成功表达,为获得大量NS1蛋白进行功能研究及抗体制备奠定了基础。     

虎α干扰素与虎白蛋白融合蛋白的表达与鉴定

目的通过杆状病毒表达系统表达虎干扰素蛋白及其融合白蛋白后的长效干扰素蛋白。方法合成虎α干扰素基因IFN-α和融合虎白蛋白的长效干扰素基因IFN-α+ALB,经双酶切和酶连后转化大肠埃希菌DH5α获得重组质粒,鉴定正确后转化DH10Bac感受态,经蓝白斑筛选获得重组杆状病毒质粒,测序验证后转染昆虫细胞Sf9,并进行盲传。提取P3代细胞的上清基因组,检测目的基因表达情况并大量培养。收集细胞,超声破碎,取上清,经镍柱纯化后获得蛋白IFN-α和IFN-α+ALB,用SDS-PAGE和Western blot鉴定蛋白的表达。并通过MDCK-H5N1系统进行重组蛋白的体外活性验证试验。结果构建的重组杆状病毒质粒测序验证正确,转染昆虫细胞Sf9后表达分子质量与预期相一致的两种蛋白,其体外活性试验显示长效干扰素抗病毒效果更好。结论成功构建了虎长效干扰素重组质粒,表达的IFN-α融合虎白蛋白具有长效干扰素作用,为进一步研究对比其与干扰素蛋白的功能奠定了基础。     

亚洲1型口蹄疫病毒衣壳蛋白前体P1-2A基因和蛋白酶3C基因在昆虫细胞中的共表达

目的在昆虫细胞中表达亚洲1型口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)衣壳蛋白前体P1-2A基因和蛋白酶3C基因,为进一步研究FMDV空衣壳抗原和疫苗奠定基础。方法从质粒pTOP-P1-2A和pTOP-3C中分别扩增出编码亚洲1型口蹄疫病毒衣壳蛋白前体P1-2A基因和3C蛋白酶基因,构建转移载体pDual-P1-2A-3C并与大肠杆菌(Escherichia coli)DH10Bac中的Bacmid质粒重组,构建重组转座质粒rBacmid-P1-3C。在脂质体介导下将rBacmid-P1-3C转染Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒。在Sf9昆虫细胞中共表达P1-2A和3C蛋白,通过SDS-PAGE、Western blot和Dot-ELISA试验鉴定重组蛋白。结果目的基因在昆虫细胞中得到了正确的表达,表达蛋白与抗亚洲1型FMDV血清发生特异性反应,有良好的抗原性。结论成功在昆虫细胞中表达亚洲1型口蹄疫病毒衣壳蛋白前体P1-2A基因和蛋白酶3C基因。     

猴B病毒gB基因在昆虫细胞中的表达

为了研发猴B病毒ELISA检测试剂盒中替代全病毒的抗原。根据已报道的猴B病毒E2490株gB蛋白基因序列（genbank登录号：AF533768）人工合成gB基因,通过XbaⅠ和EcoRⅠ特异性酶切,将gB基因克隆于昆虫杆状病毒表达载体pFastBacHTA,经PCR、酶切、测序鉴定后,成功构建了携带gB基因的重组质粒pFastBacHTA-gB。该重组质粒转化含有杆状病毒穿梭载体的DH10BAC感受态细胞,经抗生素、PCR筛选,获得转座的杆粒Bacmid-gB。在脂质体介导下转染sf9昆虫细胞,细胞变大变圆细胞核扩大,收获重组杆状病毒,再感染细胞,收获目的蛋白。通过SDS-PAGE和Western bloting及间接免疫荧光检测,结果表明该蛋白得到表达,且具有良好的生物活性,大小约为98kDa。实验结果表明已成功构建了携带目的基因的重组质粒pFastBacHTA-gB和转座的杆粒Bacmid-gB,转染后在sf9昆虫细胞上得到表达。此研究结果为下一步以表达的gB蛋白为诊断抗原,替代现阶段以病毒作为抗原的猴B病毒ELISA检测试剂盒的研制奠定了基础。     

MERS-CoV S1蛋白的表达及鉴定

目的真核表达具有天然构象的中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)S1蛋白,并进行免疫反应性鉴定。方法以pcDNA3.1-S重组质粒为模板,PCR扩增S1基因,连接至pFastBac1质粒,构建重组质粒pFB1-S1。将pFB1-S1转化至DH10Bac感受态中,构建重组杆粒BpFB1-S1,然后转染sf9细胞获得重组杆状病毒rpFB1-S1并连续传代。将第四代rpFB1-S1接种sf9细胞后悬浮培养96h,取上清,用PEG8000浓缩并进行免疫亲和层析纯化,采用SDS-PAGE和Western blot鉴定其分子质量及免疫反应性;另取感染rpFB1-S1 48h的sf9细胞进行IFA鉴定。结果 S1基因PCR扩增产物大小为2 212bp,与预期相符。重组质粒pFB1-S1经酶切和测序分析鉴定构建正确。重组杆粒BpFB1-S1经PCR鉴定构建正确。IFA试验可见感染rpFB1-S1的sf9细胞出现特异性绿色荧光,即有目的蛋白表达。SDSPAGE显示纯化的重组S1为单一100×103(Mr)蛋白条带,Western blot检测该蛋白能被鼠抗S-RBD蛋白单克隆抗体识别。结论成功表达了具有免疫反应性的MERS-CoV S1蛋白,为MERS-CoV快速诊断方法的建立及候选疫苗的构建奠定了基础。     

FAT10真核质粒的构建、转染及其蛋白的表达

目的构建类泛素基因FAT10的真核表达质粒,观察其蛋白在转染人胚肾细胞系293T中的表达。方法采用RT-PCR法扩增FAT10全长基因片段后,克隆至pMD18-T载体进行测序分析,将FAT10克隆至pcDNA5-FRT表达载体并行酶切鉴定;用脂质体LipofectamineTM2000分别介导空质粒（空载组）及重组质粒（FAT10质粒组）转染293T细胞,以脂质体混合PBS（PBS组）及未加入脂质体（未转染组）作为对照。转染48 h后,收集细胞。采用Western blot法检测293T细胞中的FAT10蛋白。结果 pMD18-FAT10重组质粒经双酶切获得498 bp片段,对PCR产物及498 bp片段进行测序,结果与GenBank报道序列完全一致。FAT10质粒组、未转染组、空载体组和PBS组FAT10蛋白表达量分别为1.556±0.072、0.334±0.051、0.425±0.095、0.382±0.063,FAT10质粒组与未转染组、空载体组和PBS组比较,P均〈0.05。结论成功构建了FAT10的真核表达质粒pcDNA5-FRT-FAT10,FAT10蛋白在293T细胞中高表达。     

狂犬病毒核蛋白基因的克隆表达及其免疫原性

目的构建狂犬病毒核蛋白(NP)基因的重组杆状病毒表达载体,在昆虫细胞中表达出具有免疫原性的抗原,用于狂犬病的检测及诊断。方法应用RT-PCR方法扩增ERA株狂犬病毒NP基因后克隆到PCR2.1TA载体,转化OneShortTMTOP10感受态细胞构建TA克隆载体,并与pFastBacTM1转座质粒载体分别用KpnΙ和NotΙ双酶切,用T4连接酶连接,构建pFast ERA-NP重组转座质粒,经双酶切、PCR扩增及插入序列方向鉴定后,转化到DH10BacTME.coli感受态细胞,经三抗培养基筛选和PCR扩增鉴定后获得重组Bacmid质粒,将重组Bacmid质粒转染Sf9昆虫细胞制备重组杆状病毒毒液,并继续扩增重组杆状病毒,以第三代毒液感染Sf9昆虫细胞,96h收获细胞,用直接免疫荧光(DFA)、SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行检测和分析。结果构建了含有ERA NP基因的重组杆状病毒,并在昆虫细胞中获得表达。结论本研究成功表达出了具有免疫原性的狂犬病毒核蛋白。     

弓形虫主要抗原基因（SAG1）在昆虫细胞中表达的研究

用PCR技术从弓形虫DNA扩增出一段长约902bp编码弓形央主要膜蛋白抗原（SAG1）的基因，将SAG1基因插入带有转座子供体的pFastBacl质粒，得到重组质粒pFT9，pFT9转化含有杆状病毒穿梭载体的DH10Bac感受态细胞，通过转座重组作用使SAG1基因整合到杆状病毒载体上，将两株转座重组子BaC101和Bac304DNA分别转染Sf9昆虫细胞，用弓形虫免疫血清所作的免疫印迹试验证实这两株重组杆状病毒的昆虫细胞株均表达了SAG1蛋白。本文首次报告弓形虫SAG1蛋白在昆虫细胞中的表达。     

CCHFV S基因的重组杆状病毒的构建及鉴定

目的　利用杆状病毒表达系统（baculovirus expression vector systems, BEVS）构建含有克里米亚-刚果出血热病毒（Crimean-Congo hemorrhagic fever virus, CCHFV）S基因的重组杆状病毒,并在sf9昆虫细胞中表达出核衣壳蛋白（nucleoprotein, NP）。方法　将合成的CCHFV S基因定向克隆入杆状病毒转移载体pFastBac? Dual,获得重组的转移载体pFastBac? Dual-CCHFV-S。将其转化到E. coli DH10Bac?感受态细胞中,筛选得到重组杆状病毒杆粒rBV-Bacmid-S。用Cellfectin? II试剂将rBV-Bacmid-S转染入sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒rBV-CCHFV-S。通过IFA和Western blot检测CCHFV S基因的表达。结果　构建了含有S基因的rBV-CCHFV-S,在sf9昆虫细胞中成功表达CCHFV NP。结论　利用BEVS 可以成功表达CCHFV NP,这为研究CCHFV NP的生物学特性,研制特异性的治疗药物和预防控制疫苗奠定基础。     

鼠IL-2基因的克隆及其杆状病毒表达载体的构建

目的构建携带鼠IL-2基因的重组杆状病毒表达载体。方法将目的基因鼠IL-2克隆入杆状病毒表达载体pFastBacDual中,构建重组质粒pFB-CMV-IL-2并予酶切和PCR鉴定;将pFB-CMV-IL-2转化到含杆状病毒穿梭载体Bacmid的DH10Bac感受态菌中,筛选阳性克隆,获得重组杆状病毒载体Bacmid-pFB-CMV-IL-2,抽提质粒;用脂质体转染法将Bacmid-pFB-CMV-IL-2转染Sf9昆虫细胞包装病毒;收获完整重组杆状病毒,反复感染Sf9细胞扩增病毒,提取杆状病毒基因组,用PCR验证重组杆状病毒的正确性。结果成功构建鼠IL-2基因杆状病毒表达载体。结论本试验为进一步在哺乳细胞中表达鼠IL-2基因、开发研究IL-2奠定了基础,同时亦为其他蛋白质的真核细胞表达提供了方法参考。     

人纤维介素蛋白2在昆虫杆状病毒系统中的表达及活性检测

目的:利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞(Sf9细胞)中表达人纤维介素蛋白2(hfgl2)凝血酶原酶并检测其蛋白活性.方法:首先将PCR扩增的目的基因hfgl2和pENTR/D-TOPO载体连接,再将pENTR/D-TOPO-hfgl2质粒与BaculoDirectTM线性DNA进行体外基因重组,采用脂质体转染法将重组DNA转染到生长良好的Sf9细胞中进行病毒包装,经过对重组杆状病毒三轮扩增后,用RT-PCR和Western blotting从基因和蛋白水平检测hfgl2表达情况,一期凝固试验检测其蛋白活性.结果:重组杆状病毒感染后,Sf9细胞停止生长,体积变大,细胞开始悬浮,破裂,呈现颗粒样外观.RT-PCR扩增和Western blotting从基因和蛋白水平证实Sf9细胞能够表达hfgl2,蛋白分子量约为63kDa.同时,在细胞上清液中检测到了可溶性hfgl2的表达,蛋白分子量约为50kDa.一期凝固试验证明表达的跨膜型hfgl2具有凝血活性.结论:hfgl2在昆虫杆状病毒表达系统中成功表达并具有生物学活性,为进一步研究hfgl2跨膜型以及可溶性蛋白功能提供了工具,亦可应用于开发重型肝炎蛋白芯片或ELISA诊断试剂盒.     

重组人GDNF基因逆转录病毒真核表达载体的构建及表达

目的 构建含有胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)和加强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)的逆转录病毒载体,将其导入包装细胞PT67,检测基因在细胞中的表达.方法 PCR法扩增GDNF基因及IRES2-EGFP基因,测序验证正确后与逆转录病毒载体pLXSN连接,构建重组逆转录病毒质粒pLXSN-IRES2-EGFP-GDNF.EcoR I酶切鉴定重组质粒.脂质体Lipofectamine 2000介导下转染包装细胞PT67,G418筛选并检测病毒滴度.流式细胞仪和荧光显微镜分别检测转染效率和基因表达.结果 PCR扩增得到大小约558 bp和1 308 bp的特异性条带,测序证实,获得正确的人GDNF序列和EGFP序列.经EcoR I酶切鉴定,成功构建重组质粒pLXSN-IRES2-EGFP-GDNF.荧光显微镜检测显示GDNF基因获得良好表达,流式细胞仪检测转染效率为24.4%.结论 正确克隆了人GDNF基因全序列并构建重组逆转录病毒pLXSN-IRES2-EGFP-GDNF质粒.基因转染包装细胞PT67获良好表达.     

APP基因真核表达载体的构建及其在SH-SY5Y细胞中的稳定表达

目的 构建淀粉样前体蛋白(APP)基因真核表达载体,转染SH-SY5Y细胞,建立稳定转染细胞系.方法 从质粒pcDNAs-APP中经PCR扩增出APP基因,利用DNA重组技术将其插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,经酶切和测序鉴定后,脂质体转染法转染SH-SY5Y细胞,通过G418选择培养,建立稳定转染细胞系,通过印迹法(Western blot)检测APP的表达. 结果 pcDNA3.1(+)-APP重组体经PCR扩增后片段大小约为2 300 bp,与预期相同.测序结果与目的序列相同,重组体载体构建成功.Western印迹检测到SH-SY5Y细胞中APP的表达. 结论 成功构建pcDNA3.1(+)-APP真核表达载体并稳定转染SH-SY5Y细胞,成功表达了目的基因,为进一步研究阿尔茨海默病分子学机制奠定了基础.