云南省通海县蚊虫2株乙型脑炎病毒的分离鉴定北大核心CSCD

目的了解云南省通海县蚊虫携带的乙型脑炎病毒(JEV)情况、分子特征及基因分型。方法2015年7月在云南省玉溪市通海县采用诱蚊灯在调查点通宵捕捉蚊虫,蚊虫研磨后分别接种BHK-21和C6/36细胞进行病毒分离,使用黄病毒属特异引物进行初步鉴定,使用乙型脑炎病毒E基因特异引物进行RT-PCR扩增及测序,使用Megalign、Genedoc、Mega7等软件进行序列分析。结果共捕获三带喙库蚊、中华按蚊、致倦库蚊和骚扰阿蚊2300只,其中三带喙库蚊为优势蚊种(78%)。分46批进行病毒分离,获得2株阳性分离物,接种BHK-21细胞96h,引起细胞病变。使用黄病毒属特异引物和乙型脑炎病毒E基因特异引物扩增均为阳性。序列分析结果显示,2株新分离乙型脑炎病毒与疫苗株SA14-14-2在E基因存在12个氨基酸差异位点,在8个与乙脑病毒毒力相关的位点上存在6个差异位点。E基因遗传进化分析显示,2株新分离病毒与基因Ⅰ型乙型脑炎病毒位于同一进化分支,核苷酸和氨基酸同源性分别为91.8%~99.1%和98.0%~100%。遗传进化分析显示,其与云南2016年蚊虫中分离的乙脑病毒株JEV/mosq/YN/2016亲缘关系较近,核苷酸和氨基酸同源性分别为99.1%和99.8%。结论云南省通海县分离的2株病毒鉴定为基因Ⅰ型乙型脑炎病毒,其与云南省近年来流行的毒株遗传进化关系较近。2毒株的E基因上与毒力相关的关键位点中有2个位点发生突变,结构域Ⅲ的关键抗原未发生改变,因此SA14-14-2减毒疫苗株仍可用于该地区人群的免疫接种,以预防乙型脑炎的发生和流行。     

中国首次分离的二株基因Ⅰ型流行性乙型脑炎病毒全基因组序列分析

目的 分析中国首次分离的基因Ⅰ型流行性乙型脑炎病毒(JEV)全基因组的基因组特征。方法 设计JEV全基因组扩增引物,RT-PCR扩增片断,PCR产物直接测序,拼接后获得全基因组序列。采用生物学软件进行同源性和系统进化分析。结果 1977和1982年分离自云南蚊虫的M28和BN82215病毒株基因组全长分别为10 969 bp和10 970 bp,5′非编码区均含有96个核苷酸,3′非编码区含有573和574个核苷酸。它们的开放阅读框(ORF)都从97到10 396位,共10 299个核苷酸,编码3 433个氨基酸。M28和BN82215株与来自GenBank的5个基因型JEV株的全基因组核苷酸和氨基酸同源性分别为78.4％～96.3％和91.4％～99.6％,与近几年国内外基因Ⅰ型流行株的同源性最高,进化关系最接近,都属于基因Ⅰ型。这两株病毒与JEV疫苗株SA14-14-2相比,有56个氨基酸差异,其中E基因有11个氨基酸差异,但都不属抗原关键位点。结论 本研究阐明了中国首次分离的基因Ⅰ型JEV的全基因组分子特征,决定病毒抗原和毒力的E蛋白关键位点无明显变化。证实20世纪70和80年代云南省就有基因Ⅰ型JEV流行。     

黄病毒属病毒RT-heminested-PCR方法的建立并用于蚊虫检测

目的 建立适合检测蚊虫携带黄病毒属病毒通用引物反转录半巢式PCR(RT-heminested-PCR)方法.方法 根据GenBank黄病毒属病毒非结构蛋白基因(nonstructuralproteins gene) NS5序列,在保守区设计2对(3条)黄病毒属病毒通用引物,以日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV) cDNA、登革病毒(Dengue virus,DENV)Ⅰ～Ⅳ型cDNA为模板优化条件建立RT-heminested-PCR方法;以日本脑炎病毒减毒活疫苗(SA14-14-2 strain)测定该方法的敏感度,并用于野外采集蚊虫检测.结果 在50只淡色库蚊中RT-heminested-PCR方法检测减毒活疫苗JEV最低检出浓度为1×10-2 PFU/mL.用该方法检测云南省普洱市采集的54组(540只)蚊虫,扩增产物经测序确认9组含有乙型脑炎病毒、3组含有登革病毒Ⅱ型、1组合有登革病毒Ⅰ型、1组含未报道的黄病毒属病毒,该病毒与Quang Binh virus同源性最高.结论 黄病毒属病毒通用引物RT-heminested PCR方法适合于蚊虫种群黄病毒属病毒监测.其不但适应已知黄病毒属病毒的检测,而且具备检测新型黄病毒属病毒的潜能.     

首次从云南蚊虫分离到辛德毕斯病毒及其鉴定

目的了解云南省虫媒病毒的存在和流行情况。方法2005年8月,在云南省勐海县采集蚊虫,蚊虫标本经研磨后,上清液接种BHK21细胞以分离病毒,用间接免疫荧光试验和RT-PCR等方法进行鉴定,并对病毒的分子生物学特征进行分析。结果采集到蚊虫标本9400只,其中分离到一株对BHK-21细胞能产生明显细胞病变的病毒(MX10)。该病毒经间接免疫荧光试验提示为甲病毒。用甲病毒属特异引物和Sindbis病毒E1基因特异引物对MX10病毒的RT-PCR扩增为阳性,经核酸序列测定分析证实该序列与Sindbis病毒泰国分离株(AF492770)同源性最高,为90.0%;与1987年分离自云南发热患者的YN87448株和1991年新疆按蚊分离株XJ-160的同源性分别为73.1%和72.0%。结论本次从勐海县蚊虫分离到的MX10病毒株为Sindbis病毒,并可能是Sindbis病毒的新亚型或新株系。     

2019—2020年哈密市蚊虫种类分布及携带病毒调查

目的　了解新疆维吾尔自治区哈密市蚊虫种类及病毒携带情况,并鉴定该市尖音库蚊所属亚种。方法　分别于2019、2020年7月中旬,在新疆维吾尔自治区哈密市伊州区、伊吾县、巴里坤县采用诱蚊灯法捕捉蚊虫,鉴定所捕获蚊虫种属及尖音库蚊种属。采用逆转录PCR技术检测捕获蚊虫携带黄病毒属、甲病毒属、布尼亚病毒属、流行性乙型脑炎病毒、辽宁病毒、Tahyna病毒、蜱传脑炎病毒及西尼罗病毒情况。结果　在哈密市伊州区、伊吾县、巴里坤县共捕获蚊虫1 496只,分属于3属3种。尖音库蚊为优势蚊种,占所捕获蚊虫总数的65.91%（986只）;其次为里海伊蚊,占30.55%（457只）;阿拉斯加脉毛蚊最少,仅占3.54%（53只）。所捕获尖音库蚊经雄蚊尾器鉴定为尖音库蚊指名亚种。经逆转录PCR法检测,所捕获蚊虫黄病毒属、甲病毒属、布尼亚病毒属、流行性乙型脑炎病毒、辽宁病毒、Tahyna病毒、蜱传脑炎及西尼罗病毒均为阴性。结论　2019—2020年哈密市存在尖音库蚊、里海伊蚊、阿拉斯加脉毛蚊3种蚊虫,以尖音库蚊为优势蚊种;所捕获尖音库蚊均为指名亚种,未发现蚊类携带相关虫媒病毒。     

重庆三峡库区2012年乙脑病毒分离株基因序列分析

目的 通过分析2012年重庆三峡库区蚊虫中分离乙脑病毒株PrM及E基因序列,揭示毒株的遗传特性。方法 对新分离乙脑病毒的PrM及E基因进行PCR扩增,将扩增产物测序。用分子生物学软件进行核苷酸及氨基酸序列分析,并绘制系统进化树。结果 新分离的8株乙脑病毒株均为基因I型,与我国其他省市的既往分离株进化关系较近;分离株与减毒活疫苗株SA14-14-2相比较,PrM区核苷酸同源性在85.1%～86.7%之间,氨基酸同源性在95.1%～96.3%之间;E基因区核苷酸同源性在87.6%～87.8%之间,氨基酸同源性在96.9%～97.1%之间。所有新分离株与疫苗株在E基因存在14个氨基酸差异位点。结论 2012年8株重庆乙脑分离株为基因I型,在E基因区域与疫苗株相比有部分差异。     

云南省德宏州蚊虫分布特点及乙型脑炎病毒分离

１９８３年５月以及１９８４年和１９８９年７￣８月，在云南省德宠州路西，瑞丽和盈江三县，市捕获成年雌性蚊虫９属４４种１９０８３只。三带喙库蚊，霜背库蚊，棕头库蚊和中华按蚊是农村畜圈的主要蚊种。伪白纹伊蚊和白纹伊蚊是野外竹林区的优势蚊种。对所获蚊虫用Ｃ６／３６细胞和乳鼠方法分离病毒，结果从三带喙库蚊中分离到乙型脑炎病毒２株，从霜背库蚊，白纹伊蚊和窄翅伊蚊中各分离出１株乙型脑炎病毒。分析认为，三带喙库蚊     

云南楚雄2014年蚊媒及其病毒感染调查

目的了解云南楚雄元谋、武定和双柏3县蚊虫及其主要虫媒病毒种类,为制定出有效的虫媒传染病防控对策提供依据。方法2014年6-7月采用诱蚊灯在调查点通宵捕捉蚊虫,对现场采集蚊虫进行形态分类鉴定;采用C6/36细胞培养法和RT-PCR扩增目的基因片段对蚊虫体内病毒进行分离、鉴定。结果共捕获4属15种12 384只蚊虫,三带喙库蚊、中华按蚊、致倦库蚊和微小按蚊分别占捕获蚊虫总数的59.95%、19.31%、10.90%和 4.13%;C6/36细胞培养处理116组蚊虫,其中29组发生细胞病变,经基因鉴定为版纳病毒(BAV)、Totivirus 病毒(TOV)、乙型脑炎病毒(JEV)和Nam Dinh病毒(NDiV)4种,其中,三带喙库蚊的JEV、BAV、TOV和NDiV基因扩增批阳性率分别为1.87%、11.32%、3.77%和9.43%;希氏库蚊的NDiV基因扩增批阳性率为25.00%;致倦库蚊和中华按蚊的BAV、NDiV批阳性率分别为20.00%、33.34% 和5.00%、7.50%。结论楚雄地区蚊虫种类多,且以三带喙库蚊和中华按蚊为优势蚊种,从两种蚊虫标本中能分离到JEV、TOV、BAV和NDiV病毒,表明调查地区发生乙脑及其它虫媒病毒性疾病流行的危险较大。     

云南景东县乙型脑炎流行状况调查

目的调查云南省景东县流行性乙型脑炎的流行现状。方法媒介蚊虫调查采用诱蚊灯通宵捕蚊方法,蚊虫乙脑病毒检测采取RT-PCR方法,健康人群血清乙脑病毒抗体检测采用ELISA。结果共采集到蚊虫4属15种6653只,其中三带喙库蚊和中华按蚊属于当地的优势种群,分别占总捕获蚊数的82.07%和10.46%。RT-PCR检测三带喙库蚊和中华按蚊共16批1310只,各有1株感染乙脑病毒;ELISA检测当地健康人群血清乙脑病毒抗体阳性率为72.96%,不同年龄组人群乙脑病毒抗体水平差异有统计学意义(χ2=51.589,P0.01)。结论云南景东县蚊虫种类较多,三带喙库蚊和中华按蚊有传播乙型脑炎的作用。     

基因Ⅲ型乙型脑炎病毒Real-time PCR检测方法的建立及应用

目的建立针对云南地区流行的基因Ⅲ型乙型脑炎病毒株Real-time PCR检测方法。方法根据云南地区分离株乙型脑炎病毒株(Yunnan0901)基因组核苷酸序列设计特异性引物,构建pMD18-T-JEV-E质粒,以此为模板进行SYBR GreenⅠReal-time PCR扩增并制作标准曲线,摸索最佳反应体系条件,建立乙型脑炎病毒荧光定量PCR检测方法,并与普通RT-PCR方法相比较。结果建立的SYBR GreenⅠReal-time PCR标准曲线呈现良好的重复性和特异性,与模板浓度呈现良好的线性关系。与RT-PCR方法相比,SYBR GreenⅠReal-time PCR的灵敏度高10倍,而且不与猪瘟病毒、猪蓝耳病毒、猪圆环病毒、基孔肯雅病毒、辛德毕斯病毒核酸发生非特异性扩增,具有良好的特异性。用该方法检测云南部分地区的蚊虫样品,其中库蚊、按蚊乙型脑炎病毒阳性率分别为17.4%和30.7%,且主要为基因型Ⅲ型。结论本实验建立的检测基因Ⅲ型乙型脑炎病毒的SYBR GreenⅠReal-time PCR方法具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等特点,可应用于乙型脑炎疫情的监测。     

基因Ⅲ型乙型脑炎病毒Real-time PCR检测方法的建立及应用北大核心CSCD

目的建立针对云南地区流行的基因Ⅲ型乙型脑炎病毒株Real-time PCR检测方法。方法根据云南地区分离株乙型脑炎病毒株(Yunnan0901)基因组核苷酸序列设计特异性引物,构建pMD18-T-JEV-E质粒,以此为模板进行SYBR GreenⅠReal-time PCR扩增并制作标准曲线,摸索最佳反应体系条件,建立乙型脑炎病毒荧光定量PCR检测方法,并与普通RT-PCR方法相比较。结果建立的SYBR GreenⅠReal-time PCR标准曲线呈现良好的重复性和特异性,与模板浓度呈现良好的线性关系。与RT-PCR方法相比,SYBR GreenⅠReal-time PCR的灵敏度高10倍,而且不与猪瘟病毒、猪蓝耳病毒、猪圆环病毒、基孔肯雅病毒、辛德毕斯病毒核酸发生非特异性扩增,具有良好的特异性。用该方法检测云南部分地区的蚊虫样品,其中库蚊、按蚊乙型脑炎病毒阳性率分别为17.4%和30.7%,且主要为基因型Ⅲ型。结论本实验建立的检测基因Ⅲ型乙型脑炎病毒的SYBR GreenⅠReal-time PCR方法具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等特点,可应用于乙型脑炎疫情的监测。     

广西中越边境口岸地区1株乙型脑炎病毒全基因组特征分析

目的对在广西中越边境口岸地区分离的乙型脑炎病毒株Jc19095zj的全基因组进行测定和分析,了解其结构及与其他毒株的进化关系和抗原变异情况。方法采用PCR方法分段扩增Jc19095zj的全基因组并测序,利用Genestudio软件拼接毒株的全基因组序列,利用MegaⅩ软件构建全基因组和E基因的系统进化树,采用Bioedit 7.0软件比较核苷酸及氨基酸序列的差异性。结果 Jc19095zj基因组总长10 965个核苷酸,共编码3 432个氨基酸;系统进化树显示,Jc19095zj与广东GⅠb亚型毒株(MH184573)的亲缘关系较近,与越南株90VN70(1990年)处于同一大分支上,而广西本地毒株131V(2007年)在另一个不同的大分支上。E基因系统进化树显示,该毒株与4株近期引起疫情爆发的毒株在同一个分支上。比较全基因组核苷酸序列的同源性,Jc19095zj与进化树中23株JEV毒株的同源性为78.9%～99.1%,其中与GⅠb毒株的同源性为97.9%～99.1%。该毒株与疫苗株SA14-14-2核苷酸差异率为11.5%,氨基酸差异率为2.0%。进一步分析E蛋白的氨基酸位点,Jc19095zj和4株引起乙脑疫情爆发的JEV毒株均与疫苗株SA14-14-2之间存在14个共同的差异位点,但与引起乙脑疫情爆发的4个毒株之间不存在差异。结论 Jc19095zj属于GⅠb亚型,推测目前广西流行株JEV存在GⅠ和GⅢ两种基因型,其中GⅠ型为优势基因型,且决定Jc19095zj毒力和抗原性的关键位点未明显改变,因此疫苗株SA14-14-2理论上对该毒株引起的感染仍具有保护力。     

云南登革4型病毒的鉴定及NS1和NS2a基因序列分析

目的对1989年8月分离自云南省盈江县蚊虫的2株登革病毒进行生物学及分子特征的鉴定,明确这两株病毒的血清型及基因型。方法蚊虫用BHK21细胞和乳鼠法分离病毒,用间接免疫荧光试验、RT-PCR等方法进行鉴定,并对这两株病毒的分子生物学特征进行分析。结果从白纹伊蚊和达勒姆阿蚊中各分离到一株病毒,分别命名为M110和M113,这两株病毒对BHK21细胞能产生明显的细胞病变,脑内接种乳鼠4d左右导致乳鼠死亡。该病毒经血凝、血凝抑制和间接免疫荧光试验提示为黄病毒。分别用黄病毒属特异引物、登革4型病毒NS1和NS2a基因片段特异引物进行RT-PCR扩增、序列测定,证实为登革4型病毒。NS1和NS2a基因序列片段分析表明,M110和M113的NS1核苷酸序列与登革4型病毒基因Ⅰ型的H241株(Y19176)同源性最高,分别为99%、98%;NS2a基因片段与H241的核苷酸序列的同源性分别为96.5%、97.1%。结论从盈江县蚊虫分离到的M110和M113病毒为登革4型病毒基因Ⅰ型,表明云南省西部边境地区在20世纪80年代发生过登革4型病毒的流行。     

甘肃省庆阳市媒介蚊虫类携带病毒调查

目的了解甘肃省庆阳市区域媒介蚊虫类分布特点及携带病毒情况,为防控虫媒病毒相关疾病提供科学依据。方法采用电子诱蚊灯、捕虫网诱捕,并进行分类;用细胞培养法分离病毒,用血清学分子生物学方法进行病毒鉴定。结果2012年捕获蚊虫5种,4238只,其中淡色库蚊2459只,占58．0％;中华按蚊794只,占18．73％;三带喙库蚊652只,占15．38％;刺扰伊蚊215只,占5．08％;济南按蚊118只,占2．8％;捕获的三带喙库蚊中分离出1株盖塔病毒,淡色库蚊检出6株库蚊黄病毒。结论淡色库蚊是庆阳市区域的优势蚊种,蚊虫携带黄病毒和盖塔病毒等虫媒病毒,应加大对该地区蚊虫及虫媒病毒的监测、调查、研究及防治工作。     

三带喙库蚊和致倦库蚊经口感染乙型脑炎病毒疫苗SA14-14-2株的研究

目的通过实验，确定被SA14—14—2乙脑减毒活疫苗免疫的宿主动物和人在被媒介蚊虫叮咬后，是否存在感染和传播的可能。方法建立三带喙库蚊和致倦库蚊的实验室种群，用乙型脑炎SA14—14—2疫苗株病毒和乙脑野毒株经口感染两种库蚊，感染后不同时间取一定数量的蚊，研磨制成悬液，应用空斑试验方法检测感染后不同时间蚊体内的病毒存在情况和病毒滴度。结果在用6．0610gPFU／ml SA14～14—2病毒经口感染的两种库蚊中，没有检测到病毒空斑，即没发现蚊虫的感染；在用较高的6．1810gPFU／ml病毒经口感染的三带喙库蚊和致倦库蚊中，分别有一组蚊虫出现低滴度感染，空斑形成单位分别是1．24和1．11log10PFU／ml；在用野毒株经口感染的两种库蚊，共计19组蚊虫中，有14组发生感染，空斑形成单位在3．18～4．7910g10PFU／ml。结论作为乙脑主要传播媒介的三带喙库蚊和致倦库蚊对SA14—14—2疫苗株病毒的经口感染和病毒在体内的复制严重受限，当叮咬接种疫苗的人后，不具备发生乙脑病毒感染和传播的能力。     

基于mtDNA?COⅠ基因的山东省蚊种群遗传多样性分析

目的　探讨山东省不同地理株及实验室不同抗性品系淡色库蚊及5种常见蚊种的线粒体DNA细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（mtDNA?COⅠ）基因序列特征,分析其遗传多样性。方法　采用山东省济南、济宁、青岛等地现场采集及实验室选育的淡色库蚊成蚊,以济宁市现场采集的5种蚊（淡色库蚊、三带喙库蚊、中华按蚊、白纹伊蚊、骚扰阿蚊）作为样本,PCR扩增mtDNA?COⅠ基因并测序,分析序列特征并构建系统进化树。结果　PCR特异扩增8个不同地理株及4个实验室抗性品系的淡色库蚊mtDNA?COⅠ区域,获得长度均为528 bp的扩增片段,A+T含量为67.4%,存在两个变异位点。不同地理株淡色库蚊mtDNA?COⅠ基因同源性为99.95%,不同抗性品系淡色库蚊基因序列相同,所有蚊虫COⅠ基因具有高度保守性。5种常见蚊虫的mtDNA?COⅠ基因片段长度均为528 bp,有408个保守位点,120个变异位点,42个简约信息位点,78个单态位点,A+T含量为65.7%～68.0%,同源性分析发现蚊种间基因同源性为86.17%～92.05%,所有蚊虫的COⅠ基因分子鉴定与其形态学相吻合。系统进化关系显示,同种和同属之间呈明显的聚集,但阿蚊属成单独的分支,与其他蚊种亲缘关系较远。结论　线粒体COⅠ作为不同地理株及实验室不同品系淡色库蚊的遗传进化分子标记不够理想,但该基因具有种间和属间特异性,可用于蚊虫属和种的区分。     

云南省乙型脑炎几个重要流行区的传播媒介调查

目的了解云南省乙型脑炎重要流行区传播媒介种群密度和地区分布。方法现场CDC诱蚊灯诱捕成蚊;吸蚊管人工捕蚊2种方法调查。结果CDC诱蚊灯诱捕成蚊法调查了5个县,捕获蚊虫6属37种8023只,其中思茅6属34种6786只,三带喙库蚊占49.01%;麻栗坡、马关、砚山、邱北、捕获蚊虫6属21种1237只,其中三带喙库蚊占71.06%;人工捕成蚊法调查了7个地区,捕获蚊虫5属21种11301只,其中思茅翠云区调查4个乡(镇)捕获蚊虫5属21种10482只,三带喙库蚊占64.44%,其它6个地区捕获蚊虫4属16种819只,乙型脑炎主要传播媒介三带喙库蚊景谷占49.13%,孟连占46.15%,陇川占35.59%;结论调查结果显示:这些地区乙型脑炎疾病传播媒介品种较多,特别是三带喙库蚊在乙型脑炎流行区种群大密度较高,地区分布较广,大量危险因素存在。     

黄病毒基因检测技术及应用系列研究

黄病毒是一类危害人类健康的虫媒病毒,也是热带、亚热带地区重要传染病的病原体,该病毒感染的临床表现比较复杂,常常被误诊或冠以“无名热”,目前我国已经证实对军民健康威胁较大的黄病毒有登革病毒(DEN)和乙型脑炎病毒(JEV)。本研究在黄病毒的NS1基因序列自行设计了一对通用引物和5对内引物,建立了特异性强,敏感性高的基因检测技术。构建了登革病毒国内分离株     

浙江省猪血清中乙脑病毒的分离鉴定及抗体的测定

目的对浙江嘉兴地区采集的猪血清进行乙型脑炎病毒分离鉴定以及了解该地区猪感染乙型脑炎病毒的状况。方法在浙江省嘉兴地区采集猪血清标本,利用病毒分离方法检测猪血清是否携带乙脑病毒,利用间接免疫荧光法对猪血清进行抗体检测。应用荧光定量RT PCR方法对新分离病毒进行鉴定;设计特异性引物,利用RT PCR方法扩增新分离乙脑病毒PrM-E基因,并对新分离病毒进行基因分型和E基因的分析。结果共采集240份猪血清标本,抗体检测阳性率为61.6%。其中6月中旬50%以上的猪乙脑病毒抗体呈阳性。分离出3株病毒。经荧光定量RT PCR鉴定3株病毒均为乙脑病毒,基因分析表明3株病毒均属于基因I型乙脑病毒。对这2株乙脑病毒的E基因区段进行分析,它们之间核苷酸和氨基酸的同源性均为100%。与疫苗株SA14 14 2相比,核苷酸同源性在87.7%,氨基酸同源在97.0%以上。结论浙江省嘉兴地区猪群中存着乙脑病毒的隐性感染或曾经感染过,提示在该地区自然界中存在着乙脑病毒。