汉坦病毒东方田鼠分离株ZT10的分子特性研究

目的 测定从东方田鼠分离到的汉坦病毒ZT10株的全基因序列,了解该株分子基础.方法 提取ZT10病毒总RNA,对L、M、S基因进行RT-PCR扩增,产物经琼脂糖电泳分析,回收纯化后,将其克隆至pGEM-T载体中,然后进行核苷酸序列的测定及分析.结果 L基因组片段长度为6530个核苷酸,编码2151个氨基酸,与3株Seoul型汉坦病毒的L片段同源性为95.8%～99.7%,而与HTN型汉坦病毒的同源性则较低.将推导的ZT10株编码的氨基酸序列与其他汉坦病毒L片段氨基酸序列进行比较.显示ZT10编码的RNA聚合酶也有6个比较保守的区域.基因组M片段长度为3651个核苷酸,编码1133个氨基酸.结论 序列分析表明,与Seoul型汉坦病毒的M片段同源性为84.0%～96.3%,而与HTN型汉坦病毒的同源性则较低,与从田鼠分离的汉坦病毒(Prospect Hill virus,Tula virus,khabarovsk virus,Isla vista virus)M片段核苷酸同源性仅为57.5%～60.9%.S基因片段与SEO型病毒核苷酸和氨基酸同源性分别为87.9%～96.0%和96.9%～97.9%,与HTN型病毒株76～118的核苷酸和氨基酸同源性分别为71.3%和81.9%,与其他型汉坦病毒的同源均很低.表明ZT10属于SEO型汉坦病毒.     

汉坦病毒Z10株全基因序列的测定及分析

目的 测定我国肾综合征出血热疫苗株Z10的全基因序列，了解其分子结构特征，并分析Z10与基他汉坦病毒株的遗传差异，为疫苗生产提供依据。方法 从Z10病毒感染的细胞提取总RNA，将逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）扩增的产物纯化后克隆于T载体并进行序列测定，应用BNAS－TAR软件分析比较。结果 序列测定表明，Z10株L，M，S片段的全基因序列分别由6553，3615，1701个核苷酸组成，单一读码框架分别编码2151，1135，429个氨基酸。基因比较分析表明，Z10株与HTN型外其他汉坦病毒同源性较低，与HTN型病毒接近，但与HTN型病毒核苷酸序列的同源性亦仅为83.6%-87.4%，而其氨基酸序列的同源性高达94.2%-96%，据此绘出了三个片段的核苷酸和氨基酸的种系发生树。结论 测定了Z10株的全基因组序列，首次发现Z10株为已报道的HTN型中的另一亚型。     

广东省SARS流行株M基因序列分析

目的：测定广东省不同流行时期13份SARS病毒(SARS CoV)标本的M基因序列，通过分析该基因序列的变异情况，初步了解广东省SARS病毒在流行过程中是否发生了变异。方法：提取病毒RNA，用M基因特异引物进行RT-PCR，将产物纯化后直接测定核苷酸序列。结果：13份标本M基因核苷酸序列同源性很高，为99．7％～100％，M基因核苷酸序列只在2个位点(80和203位)发生变异，1株80位点的变化引起编码的氨基酸从苯丙氨酸(F)变为半胱氨酸(C)，3株203位变化为无义突变。结论：M基因核苷酸序列变异不大，初期和后期M基因核苷酸序列与流行高峰期的毒株相差1个碱基，但氨基酸序列相同；从香港感染病人分离的1株病毒M基因与广东本地感染分离株存在1个氨基酸的差异。     

我国新分离乙脑病毒02-76株的全基因序列特征

目的对我国新分离乙脑病毒02-76株进行全基因序列测定和分析，了解乙脑病毒基因组结构及毒力特性。方法设计乙脑病毒全基因组扩增引物，RT-PCR扩增片段，PCR产物直接测序，拼接后获得全基因序列。通过Clustal X（1．8）、DNASTAR、GENEDOC（3．2）等生物学软件进行核苷酸序列及氨基酸序列分析和病毒的系统进化分析。结果新分离乙脑病毒02．76株全基因组全长10977个核苷酸，从96位到10391位，共10296个核苷酸编码一个开放阅读框，编码3432个氨基酸。与我国1949年分离的Beijing-1株相比较共存在248个核苷酸差异，16个氨基酸差异。与GenBank中选择的29株乙脑病毒全基因序列比较发现，其核苷酸总体差异率为0．6％-15．1％，氨基酸总体差异率为0．2％-4．6％。通过PrM／C区段、E区段、3’NTR区段及全基因序列进行系统进化分析均显示该毒株属于基因3型乙脑病毒。结论新分离的乙脑病毒02-76株属于基因3型，与中国分离株SA-14进化关系最接近。     

汉坦病毒84Fli株S和M片段基因克隆、序列分析及在真核细胞中表达的研究

目的 克隆汉坦病毒84Fli株S，M片段，测定这些基因的核苷酸序列，用瞬时表达了解S和M片段在真核细胞中的表达。方法 以我国分离的汉坦病毒84Fli株感染的Vero-E6细胞提取总RNA，用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术扩增其S及M片段的全长cDNA，然后将84Fli株的2，M片段cDNA基因分别克隆入pCR2.1-TOPO载体中，随机挑选其中的3个克隆测定核酸序列，确定汉坦病毒84Fli株S和M片段核苷酸序列，根据S和M片段核苷酸序列设计引物，PCR扩增S及M片段的编码区，构建了真核表达质粒pcDNA3/84SC ey 实验室/84MC。用质脂体法把质粒转入COS7细胞，瞬时表达NP及G1和G2糖蛋白，用免疫荧光（IFA）、Western blot和免疫沉淀方法检测核蛋白及糖蛋白的表达。结果 汉坦病毒84Fli株的基因组S片段长度为1688个核苷酸，编码430个氨基酸，汉坦病毒84Fli株的基因组M片段长度为3616个核苷酸，编码1136个氨基酸，用免疫荧光（IFA）检测S和M片段在COS细胞中的瞬时表达为阳性。Western blot结果显示，存在有相对分子质量为50000左右的核蛋白表达，免疫沉淀法显示有核蛋白、G1和G2糖蛋白的表达。结论 84Fli株病毒和其他汉滩病毒在核苷酸序列上虽有差异。但在氨基酸水平上的同源性仍很高，成功地在COS7细胞中瞬时表达了汉滩病毒的核蛋白及糖蛋白。     

天津地区汉坦病毒分离株TJJ16S基因片段克隆和序列分析

目的 了解天津地区汉坦病毒分离株TJJ16S基因的分子特征。方法采用细胞培养法从鼠肺标本中分离汉坦病毒，命名为TJJ106，提取TJJ16感染Vero-E6细胞的总RNA，经逆转录扩增病毒cDNA，继而进行PCR扩增S基因片段，纯化后兜隆于pMD-18T载体，测定核苷酸序列并进行分析。结果天津地区首次从社鼠中分离出汉坦病毒TJJ16，其S基因片段全序列长为1701nt。只有1个编码N蛋白的开放读码框架（ORF），起始密码子为第37nt，终止于1326nt，推导其编码的蛋白长为429个氨基酸。经核苷酸系统发生树分析，TJJ16株应归属为汉坦病毒的汉滩型（HTN型）毒株，与HTN型新亚型A16株同属一个亚型。结论TJJ16病毒株的分离与S基因片段序列分析，证实在天津市鼠间存在HTN型汉坦病毒感染，对临床和流行病学的研究具有重要意义。     

汉坦病毒Z37株基因组全序列分析

目的 测定Z37株的全基因组序列，了解我国汉坦病毒疫苗生产株分子基因，分析其遗传学和抗原性差异等。方法 设计出针对各片段的特异性引物，用PCR方法从Z37病毒感染的细胞提取细胞总RNA，逆转录扩增、产物克隆T载体，纯化后测序，测定的序列应用DNASTAR软件比较分析。结果 Z37株全基因组由L片段6530nt、M3651nt、S1754nt组成，分别编码2151、1133、429个氨基酸，与同型病毒间同源率高达95．2％－99．5％，绘出了3个片段的核苷酸和氨基酸的系统发生树。结论 测定得到了Z37株的全基因组序列，为研究疫苗毒株的生物学特性、致病机理等提供了分子基础。     

汉坦病毒ZJ5株M和S全片段的分子特性及序列的比较分析

目的 对浙江新分离的汉坦病毒疫苗后备筛选毒株ZJ5株的M和S全片段进行基因序列测定与基因分型,了解该毒株分子基础,并分析与其他病毒株以及20年前浙江分离的汉坦病毒ZIO、Z37疫苗株的差异.方法 提取汉坦病毒Z15株感染细胞总RNA,进行逆转录PCR扩增,产物纯化后克隆于T载体并测定序列.结果 扩增出ZJ5病毒M和S全片段并测定了序列,经对核苷酸和氨基酸序列分析表明,与汉城型(SEO)病毒有最高的同源性,为SEOV,但与国内外已知的SEOV核苷酸差异高达11.7%～19.2%和6.7%～14.5%;用M和S片段核苷酸序列所构建的系统进化树显示,病毒株分在SEOV发生群,与SEOV的Gou3株亲缘关系最近,但独自构成一进化支.结论 ZJ5株为一不同于现已报道的SEO型毒株的新亚型.     

汉坦病毒浙江分离株的基因分型

目的对浙江省汉坦病毒（HV）分离株进行基因分型,为制定肾综合征出血热防制对策提供科学依据。方法应用RT—PCR的方法,使用汉坦病毒型特异性引物,对汉坦病毒浙江分离株型特异性M和S片段进行扩增和测序,并与其他已知病毒序列进行比较,以明确浙江株的基因型和亚型。结果本研究中18株HV浙江株11株为汉滩型（HTN）,分为5个亚型,另7株为汉城型（SEO）,分为3个亚型。HTNV ZNB-1、ZNB-2毒株和A3毒株以及SEOV Gou3、ZJ5毒株在种系发生上与其他HTNV和SEOV明显不同,Gou3和ZJ5株在SEOV发生群中构成一独立分支,比较核苷酸序列发现,ZNB-1和ZNB-2病毒M片段除与HTNV Nc167株有较高的同源性外（88．7％）,与其他HTNV的同源性在69．7％-74．0％之间,A3株M片段除与HTNV B78株有较高的同源性外（99．7％）,与其他HTNV的同源性在73．6％～76．3％之间。结论浙江省是汉坦病毒中汉滩型和汉城型的混合型疫区,HTNV至少有5个亚型,SEOV至少有3个亚型,而且浙江省存在着特殊亚型的HTN毒株以及SEO毒株。     

新疆地区克里米亚刚果出血热病毒M片段的遗传分析

目的 为进一步了解克里米亚刚果出血热病毒（CCHFV）M基因的特征，对新疆地区4侏克里米亚刚果出血热病毒分离株亚东璃眼蜱的部分M片段核苷酸序列进行测定及分析。方法 从感染CCHF病毒的鼠脑中提取RNA，应用逆转录聚合酶链反应扩增，测定CCHF病毒的部分M片段核苷酸序列，与GenBank中的已登录的部分CCHF病毒M基因的同源序列进行比较分析和种系进化分析。结果 经测序得到了4株病毒的3962～4385nt位点的424bp核苷酸序列（位点依据IbAr10200的M基因序列），该序列共编码139个氨基酸。前3株病毒序列有相当高的核苷酸同源性（99．5％～99．8％），将所得到的序列与已发表的中国、尼日利亚、巴基斯坦、乌兹别克斯坦、塔吉克斯坦和俄罗斯病毒株相比，中国株之间的核苷酸同源性为78．1％～99．8％，而非中国株则为42．9％～94．8％。但它们所编码的氨基酸序列变异不大，同源性非常高。系统发生树表明，所有的毒株被分为5个进化支（所比较的M基因长度为3962～4385nt核苷酸），来自新疆南部和东部的YT05099、YL04041和YL05035共处于同一分支。结论 相比于新疆其他分离株，YT05099、YL04041和YL05035的部分M基因特征有极高的相似性。新疆株CCHF病毒M基因与中东和远东病毒株之间有较近的亲缘关系。     

三株克里米亚-刚果出血热病毒中国分离株糖蛋白基因的全序列测定与比较分析

目的 测定克里米亚－刚果出血热病毒（CCHFV）中国分离株（即新疆出血热病毒，XH－FV）BA66019、BA8402及BA88166糖蛋白（M）基因的全部序列并分析各毒株之间的相互关系。方法 病毒RNA在只与其末端互补的特异引物PCM－Tag和随机引物的共同引发下逆转录成cDNA，以单一PCM－Tag和高保守末端互补的特异引物PCM－Tag和高保真DNA聚合酶扩增出完整的M基因。扩增产物纯化后作为模板进行序列测定，并将所得序列经计算机辅助分析其种系发生与编码策略。结果 XHFV代表株BA6019的M基因与国际原型株IbAr10200的M基因比较多个5个碱基，为5365bp；比BA8402、BA88166多个4个碱基，即5364bp。3株XHFV长ORF起始于M基因的第78位碱基，比IbAr10200株提前15bp。编码的前体蛋白共1689个氨基酸，比IbAr10200株多6个。4株病毒之间核苷酸序列的同源性分别为：80.9%（IbAr10200-BA66019），80.2%（IbAr10200-BA8402),80.2%(IbAr10200-BA88166），83.7%（BA66019－BA8402),83.6%(BA66019-BA88166),99.0%(BA8402-BA88166）；对应的氨基酸序列的同源性分别为85.1%,86.3%,86.6%,87.8%,88.0%,98.8%。它们与Dugbe病毒在核苷酸和氨基酸的同源性较低，大约是55％和37.7%。结论 XHFV BA66019、BA8402和BA88166与国际原型株IbAr10200的M基因在进化上形成各自单独的分支，人源分离株BA88166可能是来自蜱的BA8402株的变异株，提示20世纪80年代在新疆疫区可能只流行一种XHFV。     

浙江东方田鼠分离汉坦病毒株S基因的克隆和序列分析

目的对国内首次从东方田鼠分离到的汉坦病毒（HV）ZT10S基因克隆进行序列分析。方法参考GenBank发表的汉坦病毒核蛋白基因序列，设计合成一对引物，提取分离株ZT10细胞培养物的总RNA，对ZT10S基因进行RT-PCR扩增，产物经琼脂糖电泳分析，呈现一条约1．7kb的条带，回收纯化后，将其克隆至pGEM．T载体中，然后进行核苷酸序列的测定及分析。结果与4株SEO型病毒（SR-11、R22、Gu03、8610）核苷酸和氨基酸同源性分别为87．9％～96．0％和96．9％～97．9％，与HTN型病毒株76-118的核苷酸和氨基酸同源性分别为71．3％和81．9％，与其他型汉坦病毒的同源性均很低，表明此分离株ZT10为SEO型汉坦病毒。结论为进一步研究其进化和变异提供了有利条件，也为生产SEO型汉坦病毒特异性核蛋白抗原，免疫血清学诊断试剂的制备和分子生物学研究奠定了基础。     

北京地区TT病毒分离株全基因的克隆及序列测定

目的 克隆和测定北京地区ＴＴ病毒（ＴＴＶ）分离株全基因序列。方法 采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术从１例临床非甲￣庚型肝炎病人血清中分段扩增ＴＴＶ全基因,获得５个互相重叠的片段,分别长１９９ｂｐ（１－１９９）,１２６７ｂｐ（９０－１３５６,８７８ｂｐ（１３５４－２２３１,１１２９ｂｐ（２１７８－３３０６,４３４ｂｐ（３３０６－３７３９）,用标准的分子生物学方法测定了这５个序列,从而得到全长ＴＴＶ基因     

中国不同民族人群中PrP蛋白基因第129位氨基酸多态性分析

目的 研究人类PrP基因（PRNP）第129位氨基酸多态性在中国汉族及维吾尔族人群中的分布。方法 从抽样人群外周血中提取白细胞DNA，进行聚合酶链反应－限制性片段长度多态性分析（PCR－RFLP），使用SAS for Windows 6.12对结果进行分析。结果 83例汉族人群129 Met基因频率为97．0％，129 Val为3．0％；35例维吾尔族人群129 Met基因频率为91．4％，129 Val为8．6％。分别比较不同人群PRNP第129位氨基酸基因型的分布情况，结果显示汉族人群和维吾尔族人群（P＝0．0490）、汉族人群和高加索人群（P＝0．0005）、维吾尔族人群和高加索人群间（P＝0．0010）差异有显著性，而汉族人群与大和民族人群间差异无显著性（P＝0．5040）。结论 中国汉族人群PRNP第129位氨基酸基因型的分布与大和民族人群相似，但与维吾尔族人群有差异。     

汉坦病毒A9株L片段部分核苷酸序列分析

目的 测定我国分离的汉坦病毒Ａ９株Ｌ片段的部分核苷酸序列。方法 用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术扩增我国分离的汉坦病毒Ａ９株部分Ｌ片段ｃＤＮＡ,测定ＰＣＲ产物的核苷酸序列。结果 ＰＣＲ扩增产物为Ｌ片段４００６ｎｔ－４４５４１ｎｔ（根据７６－１１８株序列）,和已发表的汉坦病毒Ｌ片段序列比较,Ａ９株和汉滩病毒７６－１１８株同源性最高,为８５．２％,和其他不同型别汉坦病毒代表株ＨＲ８０－３９、     

有源汉坦病毒疫苗候选株的分离鉴定及其某些特性 …

目的 对人源汉坦病毒疫苗候选株作分离鉴定及特性的研究。方法 用Ｖ ｅｒｏ细胞分离病毒,用免疫荧光法作病毒效价测定。用ＲＴ－ＰＣＲ及部分核苷酸序列分析等检定。结果 用Ｖｅｒｏ细胞从安徽省凤台县肾综合征出血热病人血清中分离一株汉坦病毒（ＨＶ）,其抗原特性及ＰＣＲ分型结果证明为汉滩病毒（Ⅰ型病毒）;其免疫血清对来源于不同地区的ＨＶ均有中和活性。Ｍ片段部分序列分析结果表明,该毒株与７６－１１８等毒株苷酸序     

Genetic properties of medium (M) and small (S) genomic RNA segments of Seoul hantavirus isolated from <Emphasis Type="Italic">Rattus norvegicus</Emphasis> and antigenicity analysis of recombinant nucleocapsid protein

A novel isolate of Seoul (SEO) hantaviruses was detected and identified in Rattus norvegicus in Shandong Province, China and designated as JUN5-14. The partial M segment and the coding region of nucleocapsid protein (NP) in the S segment of JUN5-14 were PCR-amplified and sequenced. Nucleotide sequence analysis of the partial M segment (300 bp) revealed that JUN5-14 isolate was closely related to former SEO isolates in Shandong (97.3–99.0% homology) and non-Shandong SEO viruses (84.1–97.7% homology) but distantly related to other hantaviruses (61.5–75.1% homology). Consistent with the M segment, the coding region of the NP showed 87.5–97.8% and 97.9–99.8% identity with SEO viruses and 55.2–75.8% and 47.2–84.4% homology with other hantaviruses, at nucleotide and amino acid level, respectively. The virus isolate was identified as a member of the subtype 3 (S3) of SEO viruses by phylogenetic trees generated from the nucleotide sequences of the S and M segments. In order to develop a diagnostic assay for hantavirus infection in human, the full-length NP gene of JUN5-14 was expressed in BHK21 cells using the T7 RNA polymerase expression system. The NP expression was confirmed by indirect immunofluorescence assay (IFA) and Western blotting. The expressed NP protein was used as antigen to detect antibody response against NP in patients with hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS) in an IgG-IFA. Sixteen out of seventeen serum samples showed positive for the presence of anti-NP antibodies, indicating that the recombinant NP (rNP) protein of JUN5-14 was a good antigen for detecting hantavirus infection in human. This work was supported by Key Scientific and Technological Innovative Research Plan of Shandong Province (No. CX02102), China and the Scientific Foundation of Innovative Research Team in Shandong University, China.     

Genetic diversity of the M RNA segment among Crimean-Congo hemorrhagic fever virus isolates in China

The complete nucleotide sequences of the medium (M) segment of seven Chinese isolates of Crimean-Congo hemorrhagic fever (CCHF) virus were determined. The M-segment RNA of CCHF virus comprises 5356-5377 nucleotides depending on the isolate and encodes a protein comprising 1689-1697 amino acids in a viral complementary sense. Phylogenetic analysis of the M segment showed that the Chinese CCHF virus isolates were clustered into three groups, one of which was more closely related to a Nigerian isolate. Pairwise comparison of a precursor protein showed that amino-terminal regions comprising 250 amino acids were extraordinary heterogeneous, with a 22.4% identity in amino acids being observed between the most distantly related isolates. Since all the viruses were isolated from 1966 to 1988 within a restricted area in the Xinjiang Autonomous Region in western China, the results indicate that a multisource virus population is endemic in this region.     

Coding properties of the S and the M genome segments of Sapporo rat virus: comparison to other causative agents of hemorrhagic fever with renal syndrome

Three serologically distinct groups of hantaviruses have been associated with severe, moderate, and mild forms of hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS). To gain a better understanding of the genetic variation among these viruses, we cloned and sequenced the M and the S genome segments of Sapporo rat virus, an etiologic agent of moderate HFRS, and compared the predicted gene products to those of Hantaan virus, and the H?lln?s strain of Puumala virus, which are etiologic agents of severe and mild HFRS, respectively. The SR-11 S segment consisted of 1769 nucleotides and had an open reading frame (ORF) in the virus-complementary sense RNA with a coding capacity of 429 amino acids. Deduced amino acids from the SR-11 S segment ORF displayed 83% homology with those of Hantaan nucleocapsid (N) protein. Comparison of the S segment ORFs of all three viruses revealed 58% homology. No evidence for additional nonstructural protein(s) encoded by the SR-11 S segment was obtained. The SR-11 M segment consisted of 3651 nucleotides and had an ORF in the virus-complementary sense RNA with a coding capacity of 1134 amino acids. Amino acid sequences predicted from the SR-11 M segment ORF were 75% homologous with those encoding Hantaan G1 and G2 envelope glycoproteins. Comparison of the deduced amino acid sequences of the M segment ORFs of SR-11, Hantaan, and H?lln?s viruses revealed a 43% homology for amino acids constituting the G1 proteins and a 55% homology for amino acids constituting the G2 proteins of the three viruses. The envelope proteins of SR-11 virus were localized within the M segment ORF by amino-terminal sequence analysis of purified G1 and G2. G1 initiated at amino acid 17 and G2 at amino acid 647 within the ORF. Five potential asparagine-linked glycosylation sites were identified in the SR-11 G1 coding sequences, four of which were conserved between Hantaan and SR-11 viruses and three of which were conserved among all three viruses. One potential glycosylation site was identified in the SR-11 G2 coding sequences and was conserved among Hantaan, SR-11 and H?lln?s viruses. Cysteine residues were highly conserved within the M segment ORFs of all three viruses, suggesting a similar structure and function of the G1 and G2 proteins.