RXR激动剂通过抑制PKC激活对抗高糖诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖

 目的:探讨视黄醇类X受体 (RXR)激动剂对高糖诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞(RASMCs)增殖的影响及其作用机制。方法:体外组织块干涸法培养RASMCs,以25 mmol/L葡萄糖干预,模拟糖尿病患者体内环境,通过WST-1法检测细胞增殖活性,BrdU插入法测定细胞DNA合成,流式细胞术检测细胞周期进程。用免疫印迹杂交方法检测细胞周期蛋白依赖激酶2(CDK2)、细胞周期蛋白依赖激酶抑制物p27Kip1的蛋白表达及蛋白激酶C (PKC)的磷酸化水平。结果:(1) 在高糖环境(葡萄糖终浓度为25 mmol/L)下,RASMCs的增殖活性、DNA合成速率及其在细胞周期S期的分布比例均显著增加;(2) 高糖显著增加RASMCs内CDK2蛋白的表达,但明显降低p27Kip1的蛋白表达水平;(3) RXR天然配体9-顺式维甲酸(9-cis-RA)可显著抑制高糖诱导的RASMCs增殖活性增强、DNA合成加速及RASMCs在细胞周期S期分布比例的增加幅度,且具有浓度依赖性;10-7mol/L浓度的SR11237(RXR特异性配体)与等浓度的9-cis-RA具有相似的抑制效应;(4) 9-cis-RA 和SR11237均可显著抑制高糖诱导的CDK2蛋白表达水平的增加幅度,同时上调高糖环境下p27Kip1蛋白的表达;(5) PKC抑制剂(PKC inhibitor peptide, 20 μmol/L)显著抑制高糖环境下RASMCs的增殖活性和CDK2蛋白的表达,但明显增加高糖条件下p27Kip1蛋白的表达;(6) 9-cis-RA 和SR11237可抑制高糖诱导的PKC蛋白磷酸化。结论: PKC的活化参与了高糖诱导下RASMCs的增殖过程。RXR激动剂通过抑制PKC活化对抗高糖诱导的血管平滑肌细胞增殖。     

高糖和不同浓度胰岛素对血管平滑肌细胞增殖的影响

目的:探讨高糖和不同浓度胰岛素对大鼠血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖的影响及可能机制.方法:组织贴块法原代培养大鼠胸主动脉VSMCs,用高糖和不同浓度胰岛素诱导细胞增殖.实验设对照组、高糖组、高糖和不同浓度胰岛素组.采用四甲基偶氮唑盐[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT]比色法测定VSMCs增殖;免疫细胞化学技术检测VSMCs增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)含量;RT-PCR技术检测VSMCs中PCNA mRNA的表达量;NO试剂盒检测培养基上清液中NO含量.结果:高糖能诱导VSMCs的增殖,而胰岛素则呈剂量依赖性地协同高糖诱导VSMCs增殖,最大作用效果出现在300 mU/L胰岛素培养的第5天;高糖可以使PCNA蛋白含量增加,而高糖和高浓度胰岛素(300 mU/L)合用则可使PCNA蛋白含量显著增加;高糖可使PCNA mRNA表达量增高,而高糖和高胰岛素(300 mU/L)合用则可使PCNA mRNA表达量显著增高;高糖可使NO含量降低,而高糖和高胰岛素(300 mU/L)合用则可使NO含量显著降低.结论:胰岛素呈剂量依赖性地协同高糖促进VSMCs增殖,使VSMCs PCNA蛋白含量和PCNA mRNA表达量增高,并协同高糖降低NO的产生.     

JNK信号通路介导高糖诱导的大鼠心肌成纤维细胞增殖

 目的 明确c-Jun氨基末端激酶（JNK）信号通路在高糖诱导大鼠心肌成纤维细胞增殖中的作用。方法 提取大鼠原代心肌成纤维细胞,观察不同糖浓度（12、18和25 mmol/L葡萄糖）和不同刺激时间（0、12、24和48 h）对JNK通路的影响。实验分为对照组（5.5 mmol/L葡萄糖）、高糖组（25 mmol/L葡萄糖）、JNK抑制剂SP600125组（25 mmol/L葡萄糖+SP600125 10、20 μmol/L）和高渗组（5.5 mmol/L葡萄糖+19.5 mmol/L甘露醇）培养48 h,应用MTT测定细胞增殖、Weastern blot测定JNK磷酸化水平和增殖细胞核抗原（PCNA）的蛋白表达、RT-PCR检测c-jun基因表达。结果 高糖呈时间和剂量依赖性增加JNK磷酸化水平。与对照组比较,高糖显著地促进了心肌成纤维细胞的增殖（0.44±0.02 vs 0.31±0.02, P<0.01）,并上调了c-jun的基因表达和PCNA蛋白水平。 SP600125能够浓度依赖性地抑制高糖诱导的细胞增殖和JNK通路的激活。结论 JNK信号通路部分地介导了高糖诱导的大鼠心肌成纤维细胞增殖。     

灯盏花素对高糖联合低氧诱导人视网膜色素上皮细胞分泌VEGF的影响及其机制

目的 通过观察1 μmol/L灯盏花素对高糖、低氧,及高糖联合低氧环境下人视网膜色素上皮(RPE)细胞株D407细胞分泌VEGF的影响,PKCδ的转位激活变化,以及构建PKCδ的小分子干扰载体,探讨灯盏花素对RPE细胞在糖尿病环境下分泌VEGF的调节作用及机制.方法 常规培养D407细胞,分为对照组(5.56 mmol/L葡萄糖)、高糖组(25.0mmol/L葡萄糖),低氧组(200.0 μmol/L CoC12),联合组(25.0 mmol/L葡萄糖+200.μmol/L CoCl2),灯盏花素干预联合组(25.0 mmol/L葡萄糖加200 μmol/L CoCl2加灯盏花素1.0μmol/L),ELISA检测VEGF浓度,Western blot检测PKCδ的转位激活水平;构建PKCδ小分子干扰载体转染D407细胞后,Western blot检测PKCδ表达水平,ELISA检测VEGF分泌水平.结果 高糖组、低氧组、联合组分别与对照组比较,细胞分泌VEGF与PKCδ转位激活均增加(均P＜0.05),联合组增加最明显(P＜0.01);灯盏花素在1 μmol/L的浓度下可以显著降低高糖联合低氧诱导的VEGF分泌;灯盏花素可以抑制高糖联合低氧引起的PKCδ转位激活;所构建的sh3-PKCδ干扰载体可以降低PKCδ表达水平,干扰PKCδ后联合组的VEGF分泌水平降低(P＜0.05).结论 灯盏花素可以抑制高糖联合低氧诱导RPE细胞分泌VEGF,这可能与灯盏花素抑制了PKCδ转位激活有关,提示PKCδ可能是DR的一个药物靶点,灯盏花素具有作为DR治疗药物的前景.     

肌肽对高糖诱导的心肌成纤维细胞增殖的影响

目的 研究肌肽(carnosine)对高糖环境下大鼠心脏成纤维细胞(cardiac flbroblasts,CFs)增殖的影响及机制.方法 以CFs为研究对象,使用Brdu-酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immu-nosorbent assays,ELISA)检测法观察肌肽抑制高糖环境下心肌成纤维细胞DNA的合成;细胞周期的测定采用流式细胞仪法;Western blot法观察不同条件下CFs中CDK2、CyclinE、PCNA、ERK1/2、p-ERK1/2及p21和p27的蛋白表达情况.结果 肌肽能够抑制高糖环境下CFs的DNA合成,通过调节细胞周期和细胞周期的相关蛋白表达来实现这种作用.与高糖组比较,20 mmol/L肌肽组明显抑制了高糖刺激的大鼠CFs中CDK2、CyclinE、PCNA蛋白的表达增加(t CDK2=6.19、t CyclinE=5.7、t PCNA=8.56,P<0.05),差异具有统计学意义;与高糖组比较20 mmol/L肌肽则使p21、p27表达水平增加了(t p21=5.16、t p27=8.558,P<0.05),具有统计学意义;与高糖组比较20 mmol/L的肌肽或20 mol/L的PD-98059(ERK1/2抑制剂)明显抑制了高糖刺激的大CFs中p-ERK1/2的表达增加(t肌肽=5.64、t PD=8.68,P<0.05),差异具有统计学意义.结论 肌肽能够通过ERK1/2 MAPK信号通路抑制高糖环境下心肌成纤维细胞的DNA合成.     

阿司匹林对高糖和高胰岛素诱导的血管平滑肌细胞增殖的影响

目的：探讨阿司匹林对高糖和高胰岛素诱导的大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖的影响及相关机制。方法：组织贴块法培养原代大鼠胸主动脉平滑肌细胞, 用高糖和高胰岛素诱导细胞增殖。实验设对照组、高糖和高胰岛素组(HGI)、HGI +阿司匹林（0.5,1.25,2.50 mmol/L）组。采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法测定VSMCs增殖;一氧化氮(NO)试剂盒检测培养基上清液NO含量;流式细胞仪检测细胞周期。结果：阿司匹林呈剂量依赖性地抑制高糖和高胰岛素诱导的动脉VSMCs增殖,最大抑制作用出现在2.50 mmol/L阿司匹林培养5 d时(P<0.01);阿司匹林（2.50 mmol／L）干预可使高糖和高胰岛素导致下降的NO含量上升 (P<0.01);与高糖和高胰岛素组比较,阿司匹林(2.50 mmol/L)可使细胞静止期/DNA合成前期(G0/G1期)的VSMCs所占比例显著升高(P<0.05),而DNA合成期(S 期)细胞所占比例显著降低(P<0.05)。结论：阿司匹林能呈剂量依赖性地抑制高糖和高胰岛素诱导的动脉VSMCs的增殖,抑制细胞在G0/G1期,促进动脉平滑肌细胞NO的产生。     

芥子酸对高糖诱导下大鼠血管平滑肌细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨芥子酸对高糖诱导下大鼠血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖和凋亡的影响及机制。方法:将培养的A7r5细胞随机分组处理,MTT法检测细胞活力,Brd U法检测细胞DNA合成,流式细胞术检测细胞周期进程和细胞凋亡,ELISA检测细胞活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)生成,Western blot检测cyclin D1、P21和P27等蛋白的表达,以及蛋白激酶C(PKC)和P38的磷酸化水平。结果:与正常组比较,高糖组细胞活力显著升高,DNA合成加快,细胞周期加快,P21和P27表达降低,cyclin D1表达增加,ROS水平增加,细胞凋亡率降低,p-PKC和p-P38蛋白水平增加(P0.05)。而芥子酸(0.1、1和10μmol/L)处理引起细胞增殖活性降低,DNA合成减弱,细胞周期受阻,P21和P27表达增加,cyclin D1表达降低,ROS水平降低,细胞凋亡率升高,p-PKC和p-P38蛋白水平降低,且呈一定浓度依赖性(P0.05)。P38抑制剂SB203580和PKC抑制剂chelerythrine均显著抑制高糖诱导的PKC/P38活化和细胞活力(P0.05)。结论:芥子酸可通过抑制PKC/P38激活降低高糖诱导的VSMCs增殖,并促进细胞凋亡。     

氯沙坦通过ERK1/2 MAPK途径抑制高糖诱导小鼠系膜细胞CTGF表达

目的: 研究高糖环境下, 氯沙坦对CTGF的影响以及其作用机制.方法: 体外培养小鼠系膜细胞株(MMCs), 用高糖(25 mmol/L葡萄糖)刺激细胞分别作用24 h、 48 h、 72 h, 用Western blot方法检测磷酸化ERK1/2的表达.再将细胞分为低糖组(5.6 mmol/L葡萄糖), 山梨醇组(5.6 mmol/L葡萄糖+19.4 mmol/L山梨醇), 高糖组(25 mmol/L葡萄糖), 氯沙坦组(25 mmol/L葡萄糖+10-5 mol/L氯沙坦)以及 ERK抑制剂组(25 mmol/L葡萄糖+ 25 μmol/L PD98059), 48 h后采用Western blot方法检测磷酸化ERK1/2的表达, 72 h后采用Real-time PCR方法及Western blot分别检测 CTGF mRNA表达量以及蛋白的表达.结果: 高糖刺激小鼠系膜细胞后, ERK1/2磷酸化的蛋白表达逐渐增高, 呈现一定时间依赖性.与低糖组相比, 高糖组磷酸化ERK1/2、 CTGF的蛋白表达明显增加(P<0.01), 而与高糖组相比, 氯沙坦组以及ERK抑制剂组磷酸化ERK1/2的蛋白表达以及CTGF的蛋白均明显下降有统计学意义(P<0.05).与低糖组相比, 高糖组CTGF mRNA表达量明显增加(P<0.01), 而与高糖组相比, 氯沙坦组以及ERK抑制剂组CTGF mRNA表达量明显下降, 且有统计学意义(P<0.01).结论: 氯沙坦可抑制高糖对CTGF的诱导作用, 其机制可能与抑制ERK1/2 MAPK途径有关.     

硫化氢通过抑制氧化应激改善高糖诱导的内皮细胞衰老

目的:探讨外源性硫化氢对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)衰老的作用及机制。方法:建立高糖(33 mmol/L葡萄糖)诱导的HUVECs早熟型衰老模型,观察硫化氢对衰老的作用及其相关的分子机制。结果:HUVECs经高糖处理后,细胞生长缓慢,衰老相关β半乳糖苷酶染色(SA-β-Gal)阳性细胞数目增加,血浆纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI-1)表达明显增高,超氧化物歧化酶1(SOD1)显著减少,丙二醛(MDA)产量明显增多,核因子κB p65(NF-κB p65)活性增加;与模型组比较,100μmol/L和200μmol/L硫氢化钠(硫化氢供体)处理组的细胞数目明显增加,SA-β-Gal染色阳性细胞数目及PAI-1蛋白表达显著下降,SOD1表达明显增加,MDA产量明显减少,NF-κB p65活性降低。结论:硫化氢能通过抑制氧化应激反应和NF-κB p65活性而抵抗高糖诱导的HUVECs衰老。     

同型半胱氨酸诱导血管平滑肌细胞组织因子表达增强

目的: 研究同型半胱氨酸（Hcy）诱导人血管平滑肌细胞（VSMCs）组织因子（TF）表达的作用，及其对核转录因子（NF-κB）活性和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达的影响。 方法: 培养人脐动脉VSMCs，将不同浓度的Hcy和/或NF-κB抑制剂PDTC与VSMCs孵育不同时间，用RT-PCR方法检测TF mRNA表达，用Western blotting检测核NF-κB水平，用流式细胞术（FCM）检测细胞表面TF蛋白水平和iNOS水平。 结果: 10 μmol/L Hcy作用4 h，TF表达开始升高，500 μmol/L达峰值，Hcy能显著诱导VSMCs表达TF mRNA；对照组VSMCs细胞膜表面有低水平的TF蛋白表达，10 μmol/L Hcy作用4 h即可诱导VSMCs表达TF蛋白，500 μmol/L 达高峰，Hcy能显著诱导VSMCs表达TF；500 μmol/L Hcy作用1 h，细胞核NF-κB水平明显升高，Hcy可诱导VSMCs NF-κB活化;NF-κB抑制剂PDTC可明显抑制Hcy对TF mRNA和细胞TF表达的诱导作用；单独Hcy作用不能诱导VSMCs表达iNOS。 结论: Hcy能显著诱导VSMCs表达TF，增强VSMCs的NF-κB活化，从而介导TF基因表达和蛋白合成，通过NF-κB介导VSMCs表达TF可能是Hcy导致AS、血栓形成的重要机制。