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1.
目的:利用含强启动子的融合表达载体pGEX-2T对编码人单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的基因进行高效表达。方法:基因重组技术及蛋白纯化技术。结果:SDS-PAGE显示表达产物占菌体蛋白的50%。Western Blot检测表明,表达产物可与抗MCP-1抗体特异反应。 相似文献
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目的:为得到单链抗体高效表达,我们对抗人结脾性癌单链抗体CL-3在大肠杆菌中的表达、复性和纯化进行了研究。方法:以重组闰表达载体PJW2-CL-3转化大脾性杆菌DH5α,重组克隆在培基中温控诱导,以包涵体形式表达单链抗体。包涵体经溶解、复性、纯化后,以SDS-PAGE及Western Blot鉴定表达蛋白,ELIS单链抗体的免疫活性。结果:42℃诱导5h蛋白表达量占菌体蛋白30%。8mol/L尿素 相似文献
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牛脑bFGF的纯化及生物,生化性能检测 总被引:2,自引:0,他引:2
目的:提纯并研究牛脑中碱性成纤维母细胞生长因子(bFGF)生物、生化性能。方法:采用盐析、离子交换层析、亲和层析等分离纯化技术从牛脑中分离得到bFGF,用PAGE分析证实其PI〉8.9,用SDS-PAGE分析证明分子量分别为1600和16400的密切相关的两组分;用人脐静脉内皮细胞进行活性分析,结果:ED50为200ng/L,最终纯化倍数为260000。结论:此法提纯的bFGF蛋白活好、未发生降解 相似文献
4.
本文用离子交换层析、凝胶过滤等分离纯化技术从东亚钳蝎蝎毒中首次得到1个分子量为26625的蝎毒蛋白,SDS-PAGE电泳显示为一条带,激光扫描纯度为94%。结果说明,蝎毒成分非常复杂,其广泛的药理学性质可能与此有关。 相似文献
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东亚钳蝎蝎毒蛋白的分离纯化 总被引:5,自引:0,他引:5
本文用离子交换层析,凝胶过滤等分离纯化技术从东亚钳蝎蝎毒中首次得到1个分子量为26625的蝎毒蛋白,SDS-PAGE电泳显示为一条带,激光扫描纯度为94%,结果说明,蝎毒成分非常复杂,其广泛的药理学性质可能与此有关。 相似文献
6.
人心肌肌钙蛋白T的纯化和初步鉴定 总被引:6,自引:1,他引:5
从人左心室心肌中成功纯化心肌肌钙蛋白。纯化过程包括匀浆。70℃加热处理,硫酸铵盐析,咪唑盐酸缓冲液透析及DEAE纤维素层析。100g心肌获取cTnT5mh,纯度为97.6%,其特性经SDS-PAGE,氨基酸组分及间接ELISA法确定。 相似文献
7.
目的:利用含强启动子的融合表达载体pGEX-2T对编码人单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的基因进行高效表达。方法:基因重组技术及蛋白纯化技术。结果:SDS-PAGE显示表达产物占菌体蛋白的50% 。Western Blot检测表明,表达产物可与抗MCP-1 抗体特异反应。生物学活性测定结果表明,表达产物具有明显的单核细胞趋化活性。结论:融合蛋白对MCP-1 趋化活性无影响 相似文献
8.
研究了百日咳杆菌毒素S1亚单位与谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白(GST-S1)在大肠杆菌(E.coli)中的表达,并一步纯化了重组GST-S1。首先用聚合酶链反应(PCR)扩增出长度为560bp的编码百日咳毒素S1亚单位的DNA片段。该片段比原编码S1蛋白的DNA片段在其3′端缺失了138个碱基,将其按正确的阅读框克隆入质粒pGEX中GST基因的3′端,构成GST-S1融合基因表达载体pGEX-S1。经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达和十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),可见所表达的GST-S1融合蛋白存在于细菌上清,为可溶性蛋白。分子量为49ku处有明显的蛋白表达带。用谷胱甘肽(GSH)亲和层析系统,一步纯化出GST-S1融合蛋白。最后经凝血酶的消化,得到23ku的重组百日咳杆菌毒素S1亚单位蛋白。为百日咳疫苗的发展提供了依据 相似文献
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为了制备足量、高纯度的供血吸虫保护性免疫力研究的多价分子疫苗。通过制备型SDS-PAGE和电渗方法从日本血吸虫成虫分离纯化出28KD,31/32KD及97KD蛋白。经BCA法检测蛋白含量,SDS-PAGE检测蛋白纯度和分子量,Westrn-blot及ELISA检测其抗原活性。结果日本血吸虫成虫28KD,31/32KD及97KD三种纯化蛋白经SDS-PAGE检测均为单一条带并与所分离的蛋白分子量相符 相似文献
10.
掌叶半夏凝集素A的分离纯化及分析 总被引:5,自引:0,他引:5
首次从中草药堂叶半夏(Ptnellia pedatisecta Sehott)中通过Sephadex G-100分子筛层析、DE-32离子交换层析和制备电泳分离纯化出一种对兔红血球有血凝生的凝信要素,称之为掌叶半夏凝集素A(pinellia pedtaisecta lectin A,PPL-A)d PAGE'SDS-PAGE和等电聚焦电泳上PPL-A均显示出一条蛋白质着色带。经SDS-PAGE测定 相似文献
11.
目的: 利用大肠杆菌表达体系制备带有胶原结合结构域(CBD)的骨形态发生蛋白2(BMP2),研究CBD-BMP2表达、纯化及复性的条件和方法。方法: 将具有胶原结合能力的CBD基因序列克隆入BMP2基因序列的N端,构建重组蛋白表达质粒pet21b/CBD-BMP2,转化入工程性大肠杆菌BL21菌株内;37℃条件下添加诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)持续诱导表达;采用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化;运用超纯水稀释复性法对纯化后的CBD-BMP2进行复性;0.22 μm微孔滤膜对复性后蛋白除菌,通过除菌前后蛋白浓度比值计算回收率;聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测重组蛋白表达、纯化以及复性;BCA蛋白定量法测定蛋白浓度。结果: 重组质粒pet21b/CBD-BMP2在工程性大肠杆菌中得到充分表达;CBD-BMP2以包涵体形式表达;SDS-PAGE分析,8 mol·L-1尿素存在条件下目的蛋白溶解于裂解液上清中,经纯化后目的蛋白单体存在于洗脱液B中,单体相对分子质量约为14000;稀释复性后SDS-PAGE分析,相对分子质量14000及28000处可见2条清晰条带,重组蛋白单链成功复性为二聚体结构,相对分子质量约为28000;过滤除菌前后目的蛋白浓度分别为110和80 mg·L-1,回收率约为73%。结论: 重组CBD-BMP2载体成功转化至大肠杆菌内,CBD-BMP2蛋白得到了高效的表达和复性。建立了利用原核表达体系制备重组CBD-BMP2蛋白的实验方法。 相似文献
12.
目的:表达和纯化福氏志贺菌毒力蛋白IpaC,研究福氏志贺菌的致病机制。方法:将含有ipaC基因的pET32a-i-paC表达质粒载体转化大肠杆菌BL21(λDE3),在异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导下表达,对诱导后的表达产物进行SDS-PAGE鉴定,并采用QIA expressionist^TM蛋白纯化系统来纯化目的蛋白。结果:诱导后的表达产物经SDS-PAGE发现有一相对分子质量约为63000的条带,其含量约占总蛋白量的11%,以350mmol/L咪唑洗脱液洗脱,目的蛋白纯度可达90%以上,结论:pET32a-ipaC重组表达质粒转入大肠杆菌后,可稳定,高效地表达目的蛋白,QIA-expressionistTM蛋白纯化系统是一种简便,高效的纯化系统,可获得高纯度的目的蛋白。 相似文献
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天花粉蛋白突变体的构建及其在原核系统中的表达 总被引:2,自引:0,他引:2
目的:构建天花粉蛋白(TCS)突变体,并将其在原核系统内进行表达及纯化。方法:借助计算机预测TCS可能的抗原决定簇(YFF81-83)并设计出适当的突变引物。以栝楼基因组DNA为模板,利用重组PCR技术扩增TCS突变体全长基因,经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后与原核表达载体pRSET-A连接,转化感受态E.coli DH5α,提取质粒进行酶切鉴定及测序。将所获阳性重组质粒转化感受态E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达后,对表达产物进行Western blot鉴定。最后用Ni-NTA亲和层析柱对所获突变体蛋白进行纯化。结果:成功构建了TCS突变体(TCSYFF81-83ACS),并获得了突变体蛋白在大肠杆菌内的可溶性高效表达,经Ni-NTA亲和层析柱纯化后,产生出大量均一的TCS突变体蛋白。结论:TCS的定点突变及其在原核系统内的表达,为基因工程方法改造TCS提供了新的途径。 相似文献
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目的在原核系统中表达并纯化ING4蛋白,制备多克隆抗体。方法构建表达载体pET-21a(+)-ING4,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳检测。结果构建的表达载体pET-21a(+)-hGDNF经酶切、PCR鉴定均出现750bp左右的条带,测序结果正确,用IPTG诱导转化菌有30KD大小的目的条带,表达的目的蛋白占菌体总蛋白10%以上,以包涵体形式存在,纯化后其纯度可达70%以上。用纯化的ING4蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体。结论制备的多克隆抗体为下阶段的研究提供了重要的实验材料。 相似文献
16.
目的:表达并纯化血管生成素(ANG)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合蛋白,以进一步探讨血管生成素的生物学功能。方法:PCR扩增人ANG基因,将其与EGFP基因融合后克隆到高表达载体pMFHT,构建了原核表达质粒pHIS鄄ANG鄄EGFP。该质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并用金属螯合亲和层析纯化目的蛋白。激光共聚焦显微镜和Westernblot鉴定融合蛋白的表达情况。结果:重组蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,并从破菌上清中一步纯化目的蛋白,纯度可达95%以上。Westernblot分析表明表达产物具有良好的抗原性和特异性。诱导表达的菌体在激光共聚焦显微镜下可发射明亮的绿色荧光。结论:成功的表达并纯化了ANG鄄EGFP融合蛋白,利用EGFP的荧光示踪作用,该融合蛋白可用于血管生成素核转位和胞内共定位蛋白质研究。 相似文献
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人脂联素球状结构域的表达、纯化和功能鉴定 总被引:1,自引:1,他引:1
目的表达和纯化人脂联素(adiponectin,APN)球状结构域并观察其生物学活性.方法用PCR方法复制人脂联素球状结构域(globular domain of adiponectin,gAPN)的cDNA,并克隆于pET28a(+)原核表达载体中.将重组表达质粒pET28a(+)-gAPN转化大肠埃希菌BL21(DE3),37℃培养至A600达到0.6时,加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导目的蛋白的表达.细菌经超声破菌,得到粗提的包涵体洗涤变性后经镍柱亲和层析柱一步纯化,获得纯化的gAPN重组蛋白,复性后冻干保存.然后,用链佐星(streptozocin,STZ)诱导的小鼠高血糖模型检测其生物活性.结果IPTG诱导后有Mr约为17 000大小的目的蛋白表达,免疫印迹结果进一步表明,其具有人gAPN的抗原性.表达蛋白主要以包涵体形式存在,占菌体蛋白的30%以上,表达产物经变性、纯化、复性,可获得纯度90%以上的目的蛋白.该重组蛋白能够降低STZ诱导的小鼠高血糖模型的血糖水平.结论在大肠埃希菌BL21(DE3)中成功表达了人gAPN蛋白,经变性、纯化、复性后得到具有生物学活性的蛋白. 相似文献
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目的 比较人角质细胞生长因子2(hKGF2)在不同原核表达载体和宿主菌中的表达及相应蛋白纯化及生物学活性。方法 RT-PCR法从培养的人胚胎肺成纤维细胞提取成熟hKGF2 cDNA,克隆测序后,分别与pBV220和pET-30a(+)表达载体连接,转化不同宿主菌进行诱导表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及Western blot进行蛋白鉴定。针对不同原核表达载体分别用阳离子交换层析和镍亲和层析(Ni-NTA)纯化目的蛋白,电泳分析蛋白纯化结果,并分别检测其生物学活性。结果 目的基因片段克隆入pBV220载体后在E.coli JM109中表达量最高,约占菌体总蛋白的15%;克隆入pET-30a(+)载体在E.coli BL21(DE3)中表达量约占菌体总蛋白的25%;均为可溶性表达,不同方法纯化后蛋白纯度达95%以上,均能有效促进人胚胎肾上皮细胞增殖。结论 hKGF2基因在不同的宿主菌中蛋白表达不同,以融合蛋白表达纯化效果更好。 相似文献
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目的构建在大肠杆菌中高效表达结核杆菌H37Rv异柠檬酸裂解酶(ICL)的重组质粒,实现ICL在原核表达系统的高效稳定表达.方法采用PCR和克隆技术构建含有结核杆菌H37Rv ICL基因的表达质粒pET30(a)-Rv0467,转化至E.coli BL21(DE3)中诱导表达.目的蛋白经金属螯合层析纯化后,对其活性进行初步研究.结果构建了高效表达结核杆菌H37Rv ICL的质粒;在E.coli BL21(DE3)中得到高效表达,目的蛋白占总蛋白含量的30%;表达产物以可溶性形式存在,通过金属螯合层析纯化,所得酶的纯度为90%;目的蛋白具有ICL的活性.结论利用原核表达系统成功克隆表达了结核杆菌H37Rv的ICL,为以ICL为靶点建立新型抗结核药物奠定了基础. 相似文献