成年干细胞分化为卵母细胞样细胞的研究进展

近年研究表明不仅胚胎干细胞、胚胎性腺和皮肤细胞能分化产生卵母细胞,而且成年骨髓干细胞能表达生殖干细胞的标志基因、移植雌鼠骨髓细胞可使不育的受体卵巢中重新出现卵母细胞和卵泡,卵巢表面上皮细胞能形成生殖细胞样细胞,并分化为透明带蛋白阳性的卵母细胞和组装形成新的初级卵泡,以及胰腺干细胞也能诱导出现干细胞标志物、生殖细胞标志物以及减数分裂标志基因表达,产生卵母细胞样细胞,但是这些新产生的卵母细胞是否有正常功能受到质疑,卵母细胞生成调控的分子基础正在进一步探索之中。     

胚胎干细胞体外分化为生殖细胞的研究进展

鼠胚胎干细胞体外已成功诱导分化为生殖细胞和配子,人胚胎干细胞也表现出相似的分化能力。本文重点综述了原始生殖细胞(PGC)的起源和发育、PGC发育的相关因素、体外胚胎干细胞分化为原始生殖细胞和配子的过程及其影响因素、多能成体干细胞分化为生殖细胞等方面。     

干细胞诱导分化为生殖细胞的研究进展

干细胞具有多系谱分化的可塑性,是再生医学的研究热点。通过各种调控、诱导手段从干细胞获得生殖细胞,为生殖细胞发生与发育障碍导致的不孕不育患者带来希望。本文将探讨从各种干细胞[胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)、诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,i PSCs)、原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)、精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)和卵巢干细胞(ovarian stem cells,OSCs)]获得生殖系细胞的研究进展并提出其临床应用前景与挑战。     

小鼠胚胎干细胞分化为精子细胞的研究进展

胚胎干细胞(ESCs)是一种具有分化发育为三个胚层组织细胞潜能的全能性细胞,哺乳动物的精子起源于原始生殖细胞(PGCs),ESCs可分化为PGCs,并进一步分化为精子细胞。通过在培养基中添加诱导分化因子(如维甲酸等)或与希望诱导分化的目的细胞(如Sertoli细胞等)共培养,并通过鉴别ESCs分化为生殖细胞的各阶段特异性基因标志物c-kit、VASA、DAZL、fragilis、miwi、mil1和mil2等,获取不同阶段的生殖细胞。鼠的ESCs已诱导出了不成熟的精子细胞,但到目前为止尚无成熟精子培养成功,且诱导分化的效率很低。     

胚胎干细胞研究进展

胚胎干细胞来源于着床前的囊胚内细胞团或早期胚胎的原始生殖细胞,是一类未分化的全能性(多能性)干细胞,具有无限增殖和分化潜能.人类胚胎干细胞系的成功建立以及其体外诱导分化为特定细胞、组织甚至器官的研究进展,使其在临床应用中显示出诱人的前景.就胚胎干细胞系的建立、定向分化及临床应用等研究现状作一综述.     

精原干细胞及其研究进展

精原干细胞既具有自我更新能力又能分化成精子,是雄性动物中唯一能将遗传信息传递给后代的成体干细胞。它起源于早期胚胎的原始生殖细胞,表达一些相对特异的分子标记,其增殖和分化过程受到许多基因(GDNF、Plzf和c-Kit等)的精确调控。而且最近发现精原干细胞具有很强的可塑性,能在体外诱导为胚胎干细胞样的多能干细胞。精原干细胞研究不仅能促进男性不育治疗的发展,而且在人类再生医学领域具有巨大的应用价值。     

小干扰RNA沉默胚胎生殖细胞Nanog基因的表达

目的:建立胚胎生殖细胞中沉默多能干细胞特异转录因子Nanog表达的方法。方法:通过检测碱性磷酸酶、SSEA-1和Oct4标志蛋白,鉴定体外培养的胚胎生殖细胞(EG细胞),通过脂质体介导作用,将Nanog特异性小干扰RNA(siRNA)转染EG细胞,应用半定量RT-PCR检测转染24h、36h、48h后EG细胞中Nanog mRNA的表达水平,并应用免疫荧光技术检测转染36h、48h后EG细胞中Nanog蛋白的表达水平。结果:培养细胞具有高度碱性磷酸酶活性,SSEA-1、Oct4阳性,为保持未分化状态的EG细胞。转染后Nanog mRNA和蛋白表达均受到抑制。结论:脂质体介导siRNA能有效沉默EG细胞中Nanog基因的表达,为进一步探讨Nanog对胚胎生殖细胞的调控机制奠定了基础。     

胚胎干细胞研究进展

胚胎干细胞来源于着床前的囊胚内细胞团或早期胚胎的原始生殖细胞，是一类未分化的全能性(多能性)干细胞，具有无限增殖和分化潜能。人类胚胎干细胞系的成功建立以及其体外诱导分化为特定细胞、组织甚至器官的研究进展，使其在临床应用中显示出诱人的前景。就胚胎干细胞系的建立、定向分化及临床应用等研究现状作一综述。     

小鼠胚胎干细胞在遗传和发育毒理学中的应用

小鼠胚胎干细胞是具有无限自我更新能力的未分化细胞系,在体外可以分化形成内胚层、中胚层和外胚层的所有细胞,能再现体内胚胎发育的全过程和基因表达模式。包括3种类型:①小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells, ES cells),来源于受精卵发育至囊胚阶段的内细胞团(inner cell mass, ICM);②胚胎生殖细胞(embryonic germ cells, EG cells),来源于9.5-12.5日龄胚胎生殖脊的原始生殖细胞(primordial germ cells, PGC);③胚胎癌细胞(embryonic carcinoma cells, EC cells),来源于恶性畸胎瘤的干细胞群。小鼠胚胎干细胞是唯一可以同时研究致突变物对未分化胚胎细胞和分化体细胞致突变性的细胞株,其对致突变物的敏感性因检测终点的不同而有所不同。在胚胎毒性检测方面,由于胚胎干细胞可以同时检测化学物对细胞增殖和分化的影响,从而大大提高了体外替代实验的预测符合率,有望成为化学物致畸试验的体外替代实验模型。同时,转基因技术的广泛应用和人源胚胎干细胞的建系将更有助于提高化学物胚胎毒性和致畸性体外预测符合率,但同时也存在较大的伦理学争议。     

输卵管:间充质干细胞的新来源

目的:探讨临床上废弃的输卵管组织中是否存在间充质干细胞(MSC)。方法:收取2013年6月至9月在北京海军总医院手术治疗的6例因子宫颈癌、子宫肌瘤、子宫内膜癌及卵巢癌等疾病行输卵管切除术的输卵管组织,体外细胞培养、流式细胞学及体外诱导分化鉴定此类细胞为输卵管MSC。结果:体外分离、培养及扩增的输卵管细胞形态呈长梭型,细胞排列均一并呈漩涡状生长。流式细胞术检测结果显示,≥95%的MSC表达MSC相关表面标记物CD105、CD73和CD90,CD13、CD29、CD44、CD166、HLA-ABC均阳性表达,CD14、CD19、CD34、CD45、HLA-DR均阴性表达。体外诱导分化显示,输卵管干细胞具有成骨、成脂肪及成软骨分化的能力;RT-PCR结果显示,输卵管干细胞经诱导分化后,成脂相关基因AP2,成骨相关基因Osteopontin及成软骨相关基因Sox-9和COMP表达均阳性。结论:临床废弃的输卵管组织中存在MSC,提示临床中废弃的输卵管组织是MSC的新来源。     

精原干细胞在支持细胞饲养层上的长期增殖特征

目的:建立体外研究精原干细胞与支持细胞共培养的细胞模型,探讨体外精原干细胞在支持细胞层上的增殖特点。方法:应用两步酶消化法,分别从12-15d及6d龄昆明小鼠睾丸中分离支持细胞及精原干细胞,并用免疫细胞化学方法鉴定。将精原干细胞接种在支持细胞层上,观察不同时间点精原干细胞形成的细胞集落形态及数目。结果:精原干细胞与支持细胞层共培养24h,开始增殖分裂,呈双细胞形态。随着培养时间延长,双细胞集落数逐渐减少,而链状细胞集落逐渐增加。培养120h后,链状细胞局部融汇堆积,且细胞集落维持在相对稳定数量。在每4-5d更换培养液的条件下,细胞集落维持稳定状态的平均时间为51.2±5.8d。结论:精原干细胞在体外支持细胞层上呈集落样生长,并能长时间维持细胞集落形态及数目,这为体外研究药物或毒物干扰精原干细胞功能提供了细胞模型。     

支持细胞对体外培养精原干细胞的作用途径研究

目的:探讨支持细胞对体外培养精原干细胞的作用途径。方法:选用7 d龄雄性昆明种小鼠,两步酶消化法获得睾丸组织细胞悬液,差异时间贴壁法分离精原干细胞和支持细胞,免疫荧光法和油红O染色法分别对其进行生物学鉴定,流式细胞仪对精原干细胞进行纯度分析。按培养条件的不同将实验分为3组:精原干细胞与支持细胞共培养组(A组)、条件培养基组(B组)、常规培养基组(C组)。其中条件培养基按单纯支持细胞培养清液∶双倍浓缩的DMEM/F12∶胎牛血清=4.5∶4.5∶1的比列配置;常规培养基即含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12。台盼蓝法测定各组贴壁率,四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定各组精原干细胞的吸光度并绘制增殖曲线。倒置显微镜下观察各组精原干细胞增殖特点及集落形成情况。比较各组精原干细胞24 h贴壁率、增殖曲线及存活时间的不同。结果:A组精原干细胞24 h贴壁率大于B组及C组(P<0.05),而B、C组间无差异(P>0.05);A组精原干细胞接种起即稳定增殖,于7~10 d形成稳定集落并维持约30 d的特性。B组和C组均表现为精原干细胞经短暂的增殖后呈现快速减少的趋势,培养1周后,精原干细胞数目明显减少。结论:支持细胞对体外精原干细胞的作用是依靠两者之间的直接联系和支持细胞的旁分泌2种途径;而仅依靠支持细胞的旁分泌作用不能促进精原干细胞的贴壁和增殖。     

亮丙瑞林可促进供体精原干细胞(SSCs)在受体小鼠睾丸的归巢效率

目的:研究亮丙瑞林(GnRH-激动剂)处理受体小鼠促进精原干细胞(SSCs)移植后克隆率的作用时间、方式。方法:使用亮丙瑞林(7.6 mg/kg)或其载体剂(生理盐水)皮下注射处理受体小鼠,然后将供体SSCs(具有GFP标记)通过睾丸输出管注射法移植到经白消胺处理过的受体睾丸曲细精管内,分别于移植后1周和4周采样,在荧光显微镜下观察供体细胞在受体睾丸曲细精管中的归巢数量,供体细胞来源的睾丸数量及曲细精管数量;反转录PCR检测移植后1周和4周睾丸组织中β1-整合素(β1-integrin)mRNA表达水平。结果:在SSCs移植1周后,显微镜下可见亮丙瑞林处理组(实验组)曲细精管中SSCs的归巢数量为20.4±4.3个/曲细精管,显著高于对照组(11.5±3.8个/曲细精管)(P<0.05);在SSCs移植后4周,处理组显示绿色荧光的曲细精管比率(24.1±4.5%)也显著高于对照组(13.4±5.3%,P<0.05)。用反转录PCR检测mRNA表达量,在移植后1周时实验组小鼠睾丸内β1-整合素明显增加(P<0.05),而在移植后4周时β1-整合素与对照组相比无显著差异(P>0.05)。结论:GnRH-激动剂对SSCs的归巢具有重要促进作用,并且提示其归巢作用的发生可能是通过β1-整合素来完成的,从而使SSCs在受体小鼠曲细精管的数量一直(到移植后4周)保持着高于对照组的数量优势。     

Co-culture of mouse spermatogonial stem cells with sertoli cell as a feeder layer,stimulates the proliferation and spermatogonial stemness profile

Objectives

Sertoli cells effect the fate map of spermatogonial stem cells (SSCs) to self-renew via providing the special microenvironments. Maintenance of proliferation and self-renewal activity of SSCs may be usable as a therapeutic strategy, leads to increase the recovery of male fertility. This research was aimed to evaluate the effect of mouse sertoli cells on spermatogonia stem cells proliferation and the expression pattern of stemness markers.

Recent advances of in vitro culture systems for spermatogonial stem cells in mammals

Background

Spermatogonial stem cells (SSCs) in the mammalian testis are unipotent stem cells for spermatozoa. They show unique cell characteristics as stem cells and germ cells after being isolated from the testis and cultured in vitro. This review introduces recent progress in the development of culture systems for the establishment of SSC lines in mammalian species, including humans.

Methods

Based on the published reports, the isolation and purification of SSCs, identification and characteristics of SSCs, and culture system for mice, humans, and domestic animals have been summarized.

Results

In mice, cell lines from SSCs are established and can be reprogrammed to show pluripotent stem cell potency that is similar to embryonic stem cells. However, it is difficult to establish cell lines for animals other than mice because of the dearth of understanding about species‐specific requirements for growth factors and mechanisms supporting the self‐renewal of cultured SSCs. Among the factors that are associated with the development of culture systems, the enrichment of SSCs that are isolated from the testis and the combination of growth factors are essential.

Conclusion

Providing an example of SSC culture in cattle, a rational consideration was made about how it can be possible to establish cell lines from neonatal and immature testes.     

多囊卵巢综合征源性人胚胎干细胞系的建立

目的:利用多囊卵巢综合征(PCOS)患者体外受精周期中废弃胚胎建立人胚胎干细胞(hESCs)系。方法:收集PCOS患者体外受精-胚胎移植周期中废弃的新鲜或冷冻胚胎,序贯培养至囊胚,机械分离内细胞团,接种于混合饲养层(小鼠胚胎成纤维细胞∶人包皮成纤维细胞为1∶1),传代培养。对稳定传代的hESCs进行形态学观察、碱性磷酸酶染色、阶段特异性胚胎抗原-4、转录因子OCT-4的表达、核型分析、体内、外分化潜能鉴定。结果:①收集到59枚新鲜废胚,培养后获得14枚囊胚,分离11个内细胞团,贴壁、传代后建立5株hESCs系,均具备hESC特性。②收集到解冻胚胎19枚,培养后获得6枚囊胚,分离5个内细胞团,形成5个原代克隆,目前传至3~4代。结论:建立了PCOS源性hESCs系,为研究PCOS发病机理、筛选候选基因、基因定位及基因治疗等提供良好的生物学模型;废弃的新鲜及冷冻胚胎均可作为hESC建系的材料来源。     

骨髓间充质干细胞条件培养液促进小鼠卵母细胞体外成熟的研究

目的:研究骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)条件培养液对小鼠未成熟卵母细胞体外成熟、受精及胚胎发育的影响。方法:分离、培养小鼠MSC,获取MSC条件培养液(conditioned medium of MSC,CM)。收集小鼠生殖泡(germinal vesicle,GV)期卵母细胞,根据有无完整颗粒细胞层包裹颗粒细胞-卵母细胞复合物(cumulus-oocyte complex,COC)分为2类,分别在4种培养基(CM、DMEM、α-MEM、HTF)中培养不同时间,观察卵母细胞核成熟情况,荧光标记后激光共聚焦检测皮质颗粒(cortical granules,CG)分布和含量变化;体外受精后观察受精率和囊胚形成率。结果:2类COC卵母细胞的成熟率CM组明显高于DMEM组、α-MEM组、HTF组(P<0.01);体外受精率和囊胚形成率CM组明显高于DMEM组、HTF组(P<0.01),与α-MEM组和体内成熟组间差异无统计学意义(P>0.05);CM组卵母细胞内CG分布和含量变化与核成熟同步。结论:CM能使小鼠卵母细胞核、质同步成熟,提高了成熟率和卵母细胞质量。     

Long-term survival of human spermatogonial stem cells in mouse testes

OBJECTIVE: To evaluate colonizing ability of human spermatogonial stem cells in mouse testes. DESIGN: Transplantation of human testis cells into the seminiferous tubules of immunodeficient mice. SETTING: University hospital and academic laboratory. PATIENT(S): Men with obstructive azoospermia or maturation arrest of spermatogenesis.Analyzed up to 6 months after transplantation. Also analyzed: cryopreservation of donor cells, donor cell concentrations, and leuprolide treatment of recipients. MAIN OUTCOME MEASURE(S): Detection of human donor cells in recipient testes using whole-mount immunohistochemistry with antibodies that react with human germ cells. RESULT(S): Mouse testes were colonized by human testis cells obtained from each of 6 patients; overall, human spermatogonia were found in 16 of 22 (73%) recipient testes. Human spermatogonial stem cells survived in mouse testes for at least 6 months and proliferated during the first month after transplantation. No human-differentiating spermatogonia were identified, and meiotic differentiation did not occur in mouse testes. In this initial study, human stem cell colonization was not influenced by cryopreservation of donor cells, donor cell concentration, or leuprolide treatment of recipient mice. CONCLUSION(S): Xenogeneic transplantation of human germ cells using mice as recipients is feasible and could be used as a biological assay system to further characterize human spermatogonial stem cells. This study might provide a mechanism to evaluate the status of the stem cell population in selected infertile male patients.