曼氏迭宫绦虫钙/钙调素依赖蛋白激酶Ⅰ(SmCaMK Ⅰ)基因的生物信息学分析与表达鉴定

目的 开展SmCaMK Ⅰ(曼氏迭宫绦虫钙/钙调素依赖蛋白激酶Ⅰ)的潜在生物学特征分析和功能研究.方法 利用相关网站和软件对SmCaMK Ⅰ的同源性核苷酸序列比对分析、保守位点预测、构建分子进化树、编码氨基酸的淋巴细胞表位进行分析预测.此外,SmCaMK Ⅰ进行扩增,并克隆到表达载体pET-28α(+)中进行蛋白的表达纯化,制备大鼠免疫血清进行虫体免疫组织定位分析.结果 SmCaMK Ⅰ是一个全长基因,由1 068 bp组成,编码355个氨基酸.SmCaMK Ⅰ与细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫的CaMK Ⅰ保守功能域的氨基酸序列一致性分别为89％和88％,与人的CaMK Ⅰ氨基酸序列一致性仅仅只有44 ％.分子进化树分析中SmCaMK Ⅰ与绦虫属的亲缘关系最近,与其他物种亲缘性较远.与人类CaMK Ⅰ相比,淋巴细胞表位具有统计学差异.SmCaMK Ⅰ能够定位在成虫的睾丸和虫卵,在裂头蚴中大量表达和特异定位于体表.结论 SmCaMK Ⅰ是参与虫体生长发育繁殖的重要蛋白分子,还可能是一个潜在的疫苗靶标蛋白.     

细粒棘球蚴可溶性耐药相关钙结合蛋白的生物信息学分析及反应原性鉴定北大核心CSCD

目的采用在线生物信息学软件对细粒棘球蚴可溶性耐药相关钙结合蛋白(EgSorcin)的理化特性、结构和功能进行预测和分析,原核表达细粒棘球蚴sorcin基因,鉴定重组蛋白的反应原性,为研发细粒棘球蚴病新型防控制剂提供依据。方法从GenBank数据库下载EgSorcin的氨基酸序列及其编码基因的核苷酸序列,运用在线生物信息学软件预测EgSorcin蛋白的理化性质、保守结构域、翻译后修饰位点、T细胞和B细胞抗原表位、二级和三级结构;比对分析不同物种间Sorcin序列的一致性,构建系统发育进化树。提取细粒棘球绦虫原头蚴总RNA,RT-PCR扩增egsorcin基因片段,构建重组质粒pET-28a-egsorcin,转化大肠埃希菌,原核表达重组EgSorcin蛋白,利用Western blot鉴定该蛋白的反应原性。结果生物信息学软件预测EgSorcin编码基因长519 bp,编码172个氨基酸残基。该蛋白含有5个EF-Hand结构域,属于EF-Hand蛋白家族;含有10个潜在的B细胞表位、6个CTL细胞表位和11个Th细胞表位;二级结构以α螺旋为主,占58.14%;EgSorcin的三级结构模型为同型二聚体。成功扩增egsorcin基因片段并构建重组质粒pET-28a-egsorcin,利用原核表达系统表达的重组EgSorcin蛋白分子质量约为20 ku,与预期相符。Western blot分析显示,该重组蛋白可与细粒棘球蚴感染羊血清、细粒棘球绦虫感染犬血清反应,而不与健康羊血清、健康犬血清反应。结论EgSorcin蛋白含有5个EF-Hand结构域及多个B、T细胞表位;原核表达的重组EgSorcin蛋白具有良好的反应原性,可能成为潜在的细粒棘球蚴病诊断候选抗原分子。     

细粒棘球蚴可溶性耐药相关钙结合蛋白的生物信息学分析及反应原性鉴定

目的采用在线生物信息学软件对细粒棘球蚴可溶性耐药相关钙结合蛋白(EgSorcin)的理化特性、结构和功能进行预测和分析,原核表达细粒棘球蚴sorcin基因,鉴定重组蛋白的反应原性,为研发细粒棘球蚴病新型防控制剂提供依据。方法从GenBank数据库下载EgSorcin的氨基酸序列及其编码基因的核苷酸序列,运用在线生物信息学软件预测EgSorcin蛋白的理化性质、保守结构域、翻译后修饰位点、T细胞和B细胞抗原表位、二级和三级结构;比对分析不同物种间Sorcin序列的一致性,构建系统发育进化树。提取细粒棘球绦虫原头蚴总RNA,RT-PCR扩增egsorcin基因片段,构建重组质粒pET-28a-egsorcin,转化大肠埃希菌,原核表达重组EgSorcin蛋白,利用Western blot鉴定该蛋白的反应原性。结果生物信息学软件预测EgSorcin编码基因长519 bp,编码172个氨基酸残基。该蛋白含有5个EF-Hand结构域,属于EF-Hand蛋白家族;含有10个潜在的B细胞表位、6个CTL细胞表位和11个Th细胞表位;二级结构以α螺旋为主,占58.14%;EgSorcin的三级结构模型为同型二聚体。成功扩增egsorcin基因片段并构建重组质粒pET-28a-egsorcin,利用原核表达系统表达的重组EgSorcin蛋白分子质量约为20 ku,与预期相符。Western blot分析显示,该重组蛋白可与细粒棘球蚴感染羊血清、细粒棘球绦虫感染犬血清反应,而不与健康羊血清、健康犬血清反应。结论 EgSorcin蛋白含有5个EF-Hand结构域及多个B、T细胞表位;原核表达的重组EgSorcin蛋白具有良好的反应原性,可能成为潜在的细粒棘球蚴病诊断候选抗原分子。     

基于线粒体COX Ⅰ基因犬复孔绦虫的分子鉴定及功能分析

目的探讨从犬复孔绦虫的固定标本和新鲜虫体中扩增保守序列线粒体COXⅠ鉴定虫种并分析功能。方法从犬小肠内获取犬复孔绦虫成虫节片提取DNA,PCR扩增线粒体COXⅠ,进行电泳鉴定并测序;用BLAST比对序列、构建进化树并预测生物信息学功能。结果固定标本和新鲜标本中DNA扩增产物电泳后均显示特异性明显的条带,测序显示COXⅠ基因总长为415 bp,其编码的蛋白为疏水性蛋白,具有3个典型的跨膜螺旋,7个B细胞抗原表位。结论虫体经70%乙醇固定处理后,不影响犬复孔绦虫的基因组提取和COXⅠ序列扩增,且线粒体COXⅠ适合作为犬复孔绦虫虫种鉴别的分子标记。     

细粒棘球绦虫TSP11基因在不同发育期的差异表达及生物信息学分析

目的研究细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus,Eg)TSP基因家族TSP11基因的分子特性及其在虫体不同发育期的差异表达,为细粒棘球绦虫疫苗的研发奠定基础。方法从NCBI GenBank数据库中获得TSP11基因序列并设计特异性引物,以Eg原头节RNA为模板进行RT-PCR。将PCR产物克隆到pMD19-T载体后测序,通过生物信息学软件分析预测TSP11基因编码蛋白的结构与功能;通过SYBR GreenⅠqRT-PCR检测TSP11基因在虫体原头蚴以及成虫mRNA相对转录情况。结果生物信息学分析TSP11基因全长765个核苷酸,编码蛋白含254个氨基酸,理论等电点为8.91,为稳定蛋白分子。编码TSP11基因的氨基酸序列共含有3个跨膜区域,推测含有7个优势B抗原表位,与已登录的细粒棘球绦虫TSP11序列(XP024352489.1)同源性为99.61%。qRT-PCR显示TSP11基因在原头蚴及成虫阶段均有表达,且表达水平差异无统计学义(P>0.05)。结论成功克隆了细粒棘球绦虫TSP11基因,该基因在Eg原头蚴及成虫期均有表达,其编码蛋白为稳点蛋白,含有B细胞抗原表位,为进一步揭示其分子生物学功能奠定了基础。     

细粒棘球绦虫TAK1基因ORF的克隆及其蛋白生物信息学分析北大核心CSCD

目的克隆细粒棘球绦虫(Eg)TAK1基因的开放阅读框(ORF)全长,预测其编码的蛋白EgTAK1的结构特点和生物学功能。方法从新疆株细粒棘球蚴中扩增EgTAK1-ORF全长,克隆至载体pMD20-T上并测序;从NCBI蛋白质数据库中下载EgTAK1的氨基酸序列,利用生物信息学分析软件分别对EgTAK1的理化性质、磷酸化位点、O-糖基化位点、N-糖基化位点、亲/疏水性、保守结构域、跨膜结构域、信号肽序列进行预测;采用MEGA 7.0软件对不同物种来源的TAK1蛋白进行多序列比对并构建系统进化树。采用实时荧光定量PCR检测细粒棘球绦虫在不同发育阶段TAK1基因mRNA的相对表达量。结果EgTAK1基因ORF全长1116 bp,编码371个氨基酸,理论等电点为5.97,不稳定指数为49.59,属于不稳定蛋白;脂肪系数为87.22,总平均亲水系数为-0.291,为亲水性蛋白;EgTAK1蛋白含有64个磷酸化位点,3个O-糖基化潜在位点,4个N-糖基化位点;EgTAK1蛋白属于蛋白激酶C类似(PKC-like)家族;无跨膜结构和信号肽,亚细胞可能定位于细胞膜、细胞质及细胞核内。该蛋白含有7个优势B细胞抗原表位,具有良好的免疫原性。二级结构包含34.77%的α-螺旋,5.12%的β-转角,40.97%的无规卷曲,19.14%的延伸链。TAK1蛋白同源序列比对中与多房棘球绦虫的TAK1同源性最高为83%。实时荧光定量PCR显示,细粒棘球绦虫在不同发育阶段EgTAK1表达有差异,成虫阶段相对表达量最高。结论基因EgTAK1可能是细粒棘球绦虫发育分化的重要调控基因,预测该基因编码的蛋白含有B细胞抗原表位,有可能成为包虫病免疫学预防及药物研制的靶标抗原。     

细粒棘球绦虫丙酮酸脱氢酶的重组表达及生物信息学分析

目的 目的 克隆表达细粒棘球绦虫丙酮酸脱氢酶 （EgPDH） 基因, 并对其进行生物信息学预测与分析。 方法 方法 提取细粒棘球绦虫Total?RNA并反转录成cDNA, 以此为模板扩增目的基因。将目的基因连接至pET28b构建重组质粒并转化大肠杆菌BL21 （DE3） 进行重组表达。采用SignalP4.1、 TMHMM sever v.2.0和TargetP1.1对EgPDH编码蛋白序列分别进行信号肽、 跨膜区及亚细胞定位的预测。采用SMART分析EgPDH编码蛋白结构域, 用BLASTP和GeneDoc进行EgPDH同源序列比对及保守位点分析, 并采用MEGA6软件邻接法构建系统进化树。 结果 结果 成功克隆并构建重组质粒pET28b? EgPDH, 目的基因大小约1 080 bp, 重组蛋白以可溶性形式表达。EgPDH为信号肽的分泌蛋白, 并含转酮酶结构域, 其高度保守酶活性位点分别为Glu57 、 Leu72 、 Ile86 、 Phe114 。系统进化树分析显示EgPDH与多房棘球绦虫PDH亲缘关系最近。 结 结论 论 成功克隆表达了细粒棘球绦虫EgPDH基因并进行了生物信息学预测分析, 为进一步研究该蛋白功能奠定了基础。     

结膜吸吮线虫巨噬细胞迁移抑制因子的生物信息学分析北大核心CSCD

目的运用生物信息学方法预测分析结膜吸吮线虫MIF蛋白的结构与功能。方法基于结膜吸吮线虫转录组数据库筛选出MIF基因并进行PCR验证;利用在线软件Expasy分析该基因编码Tcp-MIF蛋白的理化性质和亲疏水性;利用HMMTOP version 2.0和SignalP 4.1 server分别预测Tcp-MIF蛋白的跨膜结构域以及信号肽;运用NetPhos、NCBI-Conserved domains、SOPMA、SWISS-MODEL、IEDB在线程序分别预测Tcp-MIF蛋白潜在的磷酸化位点、保守域结构、蛋白二级、三级结构及其抗原表位;对其编码的氨基酸序列进行同源比对,利用MEGA X软件构建系统进化树,通过STRING数据库对其蛋白互作网络进行预测。结果Tcp-MIF基因全长620 bp,开放阅读框为345 bp,编码115个氨基酸;无信号肽和跨膜结构域,蛋白局部亲水性好,有潜在的磷酸化位点和保守域结构,具有α螺旋、β折叠结构和互变异构酶活性。推测其有4个抗原表位,在STRING数据库共鉴定出包括10个基因在内的21个互作关系。结论生物信息学预测结膜吸吮线虫MIF蛋白基因并对其编码蛋白存在潜在的抗原表位区域,具有多个磷酸化位点,可为结膜吸吮线虫感染疫苗的研发提供理论基础。     

日本血吸虫童虫期体被蛋白Th细胞表位预测及初步鉴定

目的预测并鉴定日本血吸虫童虫体被蛋白分子的Th细胞表位。方法利用在线服务器分别对有关序列进行跨膜区与信号肽的预测分析;采用结合基序扫描与计分矩阵等算法,以及基于多种分子动力学算法的配体受体相互对接的分子建模方法等进行Th细胞表位预测;人工合成肽采用以多聚赖氨酸为核心的含4个表位肽分支臂的复合抗原多肽;表位肽刺激免疫鼠脾淋巴细胞增殖效果的鉴定采用改良的MTT法。结果从373条日本血吸虫肝期童虫体被蛋白序列中筛得14条具有开放阅读框及信号肽结构的序列;预测得到至少与小鼠的1个MHCⅡ类分子结合的5个15肽表位序列;淋巴细胞增殖试验初步鉴定获得了1个SSLVISYSTVDRLVC（AY815893）候选体被蛋白Th细胞表位。结论初步鉴定了1个潜在的体被蛋白Th细胞表位,为进一步筛选抗血吸虫保护性Th细胞表位提供了理论和实验依据。     

曼氏迭宫绦虫果糖-1,6-二磷酸酶的生物信息学分析、基因克隆及蛋白表达

目的通过生物信息学分析预测曼氏迭宫绦虫果糖-1,6-二磷酸酶(SmFBPase)的生物学特性,同时对SmFBPase进行基因克隆及蛋白原核表达。方法通过NCBI网站对SmFBPase基因序列进行开放阅读框分析和核苷酸序列同源性分析。通过ExPASy网站预测SmFBPase的理化性质、结构及表位等特性。构建pET-28α-SmFBPase重组质粒,并转化入~E.coli~BL21(DE3)菌株,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷对其诱导表达,用Western blot进行鉴定。结果 SmFBPase由337个氨基酸组成,无信号肽、无跨膜区,理论相对分子质量约37×10~3,为稳定胞内蛋白。SmFBPase的氨基酸序列与人FBPase的氨基酸序列一致性为61.77%,且进化树中两者亲缘性较远,该蛋白含有13个B细胞表位。PCR、双酶切鉴定及测序分析,证明重组质粒构建成功。Western blot显示重组质粒转化BL21后成功诱导表达SmFBPase蛋白。结论生物信息学分析SmFBPase是一个具有潜在研究价值的药物靶点,原核表达的SmFBPase具有反应原性,为研究其糖代谢规律奠定了基础。     

Screening of hepatocyte proteins binding to complete S protein of hepatitis B virus by yeast-two hybrid system

AIM: To investigate the biological function of complete S protein and to look for proteins interacting with complete S protein in hepatocytes. METHODS: We constructed bait plasmid expressing complete S protein of HBV by cloning the gene of complete S protein into pGBKT7, then the recombinant plasmid DNA was transformed into yeast AH109 (a type). The transformed yeast AH109 was mated with yeast Y187 (α type) containing liver cDNA library plasmid in 2×YPDA medium. Diploid yeast was plated on synthetic dropout nutrient medium (SD/-Trp-Leu-His-Ade) containing X-α-gal for selection and screening. After extracting and sequencing of plasmids from positive (blue) colonies, we underwent sequence analysis by bioinformatics. RESULTS: Nineteen colonies were selected and sequenced. Among them, five colonies were Homo sapiens solute carrier family 25, member 23 (SLC25A23), one was Homo sapiens calrer.iculin, one was human serum albumin (ALB) gene, one was Homo sapiens metallothionein 2A, two were Homo sapiens betaine-homocysteine methyltransferase, three were Homo sapiens Na+ and H+coupled amino acid transport system N, one was Homo sapiens CD81 antigen (target of anti-proliferative antibody 1) (CD81), three were Homo sapiens diazepam binding inhibitor, two colonies were new genes with unknown function. CONCLUSION: The yeast-two hybrid system is an effective method for identifying hepatocyte proteins interacting with complete S protein of HBV. The complete S protein may bind to different proteins i.e., its multiple functions in vivo.     

T7 cDNA噬菌体展示文库筛选乙型肝炎病毒前S2蛋白结合蛋白

目的以乙型肝炎病毒前S2蛋白（HBV Pre-S2）为靶蛋白，寻找该蛋白相应的结合蛋白。方法应用噬菌体表面展示技术，以纯化的HBV前S2蛋白为固相筛选蛋白，用正常人肝细胞的噬菌体T7 cDNA文库进行5轮生物筛选，经噬斑PCR，对筛选克隆进行DNA序列分析，将推断的氨基酸序列在蛋白质库中进行搜索，自GenBank中获得与HBV Pre-S2有结合作用蛋白的cDNA和基因组的全长序列，并用ELISA验证筛选的结合蛋白。结果噬菌体经过5轮生物富集后，将随机筛选的200个噬斑裂解液做PCR，得到120个插入片段长短不一的克隆，ELISA证实获得43个阳性克隆。将其PCR产物序列测定后进行同源搜索，初步确定30个人体肝脏中固有的与乙型肝炎病毒前S2蛋白结合的蛋白，其中含细胞色素P450Ⅰ类A型亚基克隆2个、3个PI-3激酶相关激酶SMG-1同类蛋白、2个细胞生长抑制蛋白42，1个膜联蛋白All转录变异体、3个转录激活因子5、2个α酸性糖蛋白、5个未知功能蛋白等。结论应用T7 cDNA噬菌体表面展示技术和生物信息学方法筛选并验证了HBV Pre-S2蛋白结合蛋白，为进一步研究Pre-S2蛋白的生物学功能提供新了思路。     

应用噬菌体展示技术筛选丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5A-TP9启动子DNA的结合蛋白

目的：筛选丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5A-TP9启动子DNA结合蛋白，探索NS5A-TP9的表达调节机制。方法：应用噬菌体展示技术，以聚合酶链反应(PCR)技术扩增的NS5A-TP9启动子DNA片段作为固相筛选分子，对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”富集过程，噬斑裂解液PCR扩增后，回收产物构建克隆载体，对所筛选克隆进行DNA序列分析和同源性生物信息学搜索。结果：噬菌体经富集后，筛选出10个阳性克隆，成功构建了克隆载体。序列测定后经过同源性搜索，确定了与HCV非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5A-TP9启动子DNA结合的蛋白有：补体C3、甲胎蛋白、人血清白蛋白、人核糖体蛋白20S和α1微球蛋白。结论：用噬菌体人肝cDNA文库筛选得到HCV NS5A蛋白反式激活基因NS5A-TP9启动子DNA结合蛋白，分析了这些蛋白的功能，为研究NS5A-TP9基因的转录调节机制，进一步阐明HCV非结构蛋白NS5A的致病机制奠定了基础。     

粉尘螨13.8 kDa溶菌酶的克隆表达、纯化鉴定及生物信息学分析

目的 克隆表达粉尘螨13.8 kDa 溶菌酶(Bac)基因, 纯化鉴定蛋白的过敏原性, 并进行生物信息学分析。方法 挑取经纯培养的粉尘螨,提取总RNA,根据已知基因序列设计引物,经RT-PCR扩增Bac基因片段,产物连入pMD-32T载体中。扩增后,利用限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切将目的基因片段连接到Pet-44a表达载体上,转化到大肠杆菌BL21( DE3)中经IPTG诱导表达;间接ELISA法检验重组Bac蛋白特异性过敏原性;clustalw2进行同源性分析,MEGA5工具包来构建系统进化树,ProtParam Tools 预测其理化性质,PSIPRED预测其二级结构,SWISS-MODEL预测其三级结构。利用网络服务器 IEDB内相关软件和Preprod,对Bac蛋白T细胞抗原表位进行预测。用DNAStar对Bac的B细胞抗原表位进行预测。结果 经测序鉴定,本研究成功克隆出了粉尘螨Bac基因,其开放阅读框396 bp,编码131组氨基酸。将Bac基因导入大肠杆菌E.coliBL21 (DE3),经IPTG诱导后高效表达Bac重组蛋白。该蛋白主要以可溶性形式存在,蛋白分子量约14 kDa。间接ELISA法证明Bac能与粉尘螨过敏患者血清IgE结合。测序发现本实验室克隆的粉尘螨Bac基因与GenBank上公布的GenBank KF113885.1同源性为96%。系统进化树结果显示粉尘螨与屋尘螨亲缘关系比较近。理化性质预测显示Bac蛋白质较稳定。二级结构及三级结构预测结果显示Bac的结构主要以无规则卷曲组成。T细胞抗原表位预测得到 4个肽序列(6-14、38-46、85-99、122-130)。B细胞抗原表位预测得到6个肽序列(15-30、26-40、44-59、58-73、95-110、101-116)。结论 成功克隆并表达了粉尘螨Bac,并证实重组Bac蛋白具有良好的免疫原性,为进一步研究尘螨过敏原的结构成分及其理化性质奠定理论基础。     

阴道毛滴虫RRas同源基因的克隆和序列分析

目的 克隆和分析阴道毛滴虫RRas同源基因，以探讨其在细胞内信号传导通路中的功能。 方法 从已构建的阴道毛滴虫cDNA表达文库中分离得到一个与人类RRas同源的cDNA克隆，用PCR扩增该cDNA克隆TvRRas相对应的基因组DNA，并对cDNA克隆及其对应的基因组DNA进行测序。利用BLASTP，RPS-BLAST和ClustalW等工具进行序列分析。 结果 TvRRas cDNA序列全长705对碱基，读码框含615对碱基，推测蛋白质序列具205个氨基酸。序列分析显示该基因的基因组DNA序列含有5′端ATG起始密码子和3′端的终止密码子，与cDNA序列完全一致，提示该基因无内含子；进一步分析表明该基因系RRas亚家族的同源基因，其氨基酸序列与人类和小鼠的RRas同源性最高（两者的一致性均为51%，相似性均为70%），同时拥有人类RRas基因高度保守的结合GTP的结构域和完全一致的效应结构域。进化树分析表明该基因与人类的RAS原癌蛋白基因分支及RRas分支聚类。 结论 获得了阴道毛滴虫RRas同源基因。     

噬菌体表面展示技术筛选隐源性肝炎血清蛋白结合蛋白

目的:通过筛选隐源性肝炎血清蛋白结合蛋白,为隐源性肝炎的发病机制研究探索新途径.方法:应用噬菌体表面展示技术,将隐源性肝炎患者血清作为固相筛选蛋白,用噬菌体正常人肝细胞T7cDNA文库进行5轮生物筛选,经噬斑PCR,对筛选克隆进行DNA序列分析,将推断的氨基酸序列在蛋白质库中进行搜索,自GenBank中获得结合蛋白的cDNA和基因组的全长序列,然后再探讨该蛋白在隐源性肝炎发病机制中的作用.结果:噬菌体经过5轮生物富集后,从随机筛选的60个克隆中得到24个阳性克隆,经序列测定后进行同源搜索,初步确定人类HCVNS5A转化调节蛋白13(NS5ATP13)为人体肝脏中固有的与隐源性肝炎血清蛋白结合的蛋白.结论:应用T7cDNA噬菌体表面展示技术,我们发现隐源性肝炎血清蛋白与人类肝细胞HCVNS5A转化调节蛋白13相互作用,在隐源性肝炎发生及抗病毒治疗有重要意义.     

Complete sequence of the gamma chain from the fetal hemoglobin of the baboon, Papio cynocephalus

The amino acid sequence of the hemoglobin gamma chain from a baboon, Papio cynocephalus, was determined by automated sequencing of the intact chain and six fragments generated by specific clevage reactions. The existence of structural heterogeneity at position 75, where both valyl and isoleucyl residues were found, is suggestive of the presence of nonallelic V gamma- and I gamma-chain genes in this species, and further emphasizes the extent to which the genetic basis of hemoglobin production among many higher primates is similar. Comparison of the sequences of those gamma chains from Homo sapiens, Pan troglodytes, Macaca nemestrina and P. cynocephalus that have been well characterized attests to the conservative nature of gamma-chain evolution among the Anthropoidea, the differences in sequence between any two of these chains ranging from none (between the A gamma and G gamma chains of P. troglodytes and H. sapiens) to no more than five (between the V gamma chains of P. cynocephalus and the A gamma chains of H. sapiens).     

细粒棘球绦虫磷酸甘油酸变位酶的表达、定位和诊断价值的初步评价

目的克隆、表达细粒棘球绦虫磷酸甘油酸变位酶(EgPGAM),分析其免疫反应性及其在原头节、包囊及成虫中的分布情况,对EgPGAM的诊断价值进行初步评价。方法提取细粒棘球蚴原头节RNA,逆转录为cDNA,PCR扩增EgPGAM基因,测序。通过多种生物信息学软件分析EgPGAM的理化性质、保守结构域、抗原表位和同源性等。利用Mega 5.0软件进行序列特征分析,采用邻接法构建系统进化树。将EgPGAM基因连接至pET32a表达载体,转入大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)中进行诱导表达,镍柱纯化,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析其表达情况并进行蛋白质免疫印迹(Western blotting)分析。免疫荧光定位分析EgPGAM在原头节、包囊及成虫中的分布。采用ELISA评价EgPGAM的诊断价值。结果EgPGAM长756 bp,共编码251个氨基酸,编码蛋白的相对分子质量(Mr)约28000,等电点为8.29,不含信号肽,无跨膜区。EgPGAM含有12个高保守的氨基酸位点、3个保守的催化活性位点、1个底物结合位点和7个B抗原表位。EgPGAM的氨基酸序列与多房棘球绦虫、猪带绦虫、华支睾吸虫、秀丽隐杆线虫、人和羊的PGAM序列相似性分别为99%、94%、78%、45%、57%和4%。SDS-PAGE分析结果显示,EgPGAM在E.coli BL21(DE3)中大量表达,主要以可溶形式存在;Western blotting分析结果显示,EgPGAM可与感染细粒棘球蚴的绵羊血清发生反应。免疫荧光定位显示,EgPGAM主要分布在原头节表皮层和顶突沟,包囊生发层和成虫薄壁组织。建立的间接ELISA敏感性为55.6%(15/27),特异性为86.4%(89/103)。结论EgPGAM广泛分布于细粒棘球蚴和细粒棘球绦虫中,具有较好免疫反应性,但敏感性较低,不适合作为细粒棘球蚴病的候选诊断抗原。     

Identification and bioinformatics analysis of lactate dehydrogenase genes from Echinococcus granulosus

ObjectiveTo identify full length cDNA sequence of lactate dehydrogenase (LDH) from adult Echinococcus granulosus (E. granulosus) and to predict the structure and function of its encoding protein using bioinformatics methods.MethodsWith the help of NCBI, EMBI, Expasy and other online sites, the open reading frame (ORF), conserved domain, physical and chemical parameters, signal peptide, epitope, topological structures of the protein sequences were predicted and a homology tertiary structure model was created; Vector NTI software was used for sequence alignment, phylogenetic tree construction and tertiary structure prediction.ResultsThe target sequence was 1 233 bp length with a 996 bp biggest ORF encoding 331 amino acids protein with typical L-LDH conserved domain. It was confirmed as full length c DNA of LDH from E. granulosus and named as EgLDH (GenBank accession number: HM748917). The predicted molecular weight and isoelectric point of the deduced protein were 3 5516.2D a and 6.32 respectively. Compared with LDH s from Taenia solium, Taenia saginata asiatica, Spirometra erinaceieuropaei, Schistosoma japonicum, Clonorchis sinensis and human, it showed similarity of 86%, 85%, 55%, 58%, 58% and 53%, respectively. Eg LDH contained 3 putative transmembrane regions and 4 major epitopes (54aa-59aa, 81aa-87aa, 97aa-102aa, 307aa-313aa), the latter were significant different from the corresponding regions of human LDH. In addition, some NAD and substrate binding sites located on epitopes 54aa-59aa and 97aa-102aa, respectively. Tertiary structure prediction showed that 3 key catalytic residues 105R, 165D and 192H forming a catalytic center near the epitope 97aa-102aa, most NAD and substrate binding sites located around the center.ConclusionsThe full length c DNA sequences of Eg LDH were identified. It encoded a putative transmembrane protein which might be an ideal target molecule for vaccine and drugs.     

Expression and immunoreactivity of an epitope of HCV in a foreign epitope presenting system

AIM: To construct and highly express an epitope of hepatitis C virus (HCV) in a foreign epitope presenting vector based on an insect virus, and to study the antigenicity of the epitope. METHODS: The HCV epitope sequence (amino acid residues 315 to 328: EGHRMAWDMMMNWS) of the El region was constructed at different positions of a foreign epitope presenting vector based on an insect virus, flock house virus (FHV) capsid protein encoding gene as a vector, and expressed in E. coli cells. Western blotting and ELISA were used to detect the immunoreactivity of these recombinant proteins. RESULTS: The gene encoding of the concerned B-cell epitope of HCV El envelope protein was expressed on FHV capsid carrier protein at positions I1 (aa 106), 12 (aa 153) and 13 (aa 305), respectively, on the surface of FHV capsid protein. The recombinant proteins in this system could be highly expressed in more than 40% of total cell protein of E. coli BL21. All the expressed recombinant proteins were in inclusion body form, and showed obvious immunoreactivity by Western blotting. Further purified recombinant proteins were detected by indirect ELISA as coating antigen respectively. All recombinant proteins could still show immunoreactivity. CONCLUSION: The epitope of HCV El envelope protein can be highly expressed in FHV carrier system as a chimeric protein with high immunoreactivity. This system has multiple entry sites conferring many possible conformations closer to the native one for a given sequence.