人羊膜诱导胚胎干细胞向表皮样干细胞的定向分化

目的 探索体外定向诱导胚胎干细胞（ES细胞）分化为表皮样干细胞的条件,为研究其分化机理及寻找新的皮肤组织工程种子细胞奠定基础。方法 将小鼠胚胎干细胞单独（对照组）或与人羊膜共培养4－5d,观察其形态分化,分别用β1整合素免疫组化和流式细胞仪检测胚胎干细胞向表皮样干细胞的分化。结果 与人羊膜共培养4－5d后,ES细胞分化为表皮细胞样的单层细胞,细胞排列紧密,呈多边形,免疫组织化学染色后,多数细胞呈现β1整合素阳性,对照组大量细胞死亡,未见β1整合素阳性细胞,流式细胞仪检测结果显示：实验组和对照组β1整合素细胞分别为81．4％和8．4％,两者比较差异显著,Z检验P＜0．01。结论 人羊膜组织可在体外诱导胚胎干细胞分化为表皮样干细胞。     

人羊膜诱导胚胎干细胞向表皮样干细胞的定向分化

[目的]探索体外定向诱导胚胎干细胞(ES细胞)分化为表皮样干细胞的条件,为研究其分化机理及寻找新的皮肤组织工程种子细胞奠定基础.[方法]将小鼠胚胎干细胞单独(对照组)或与人羊膜共培养4～5 d,观察其形态分化,分别用β1整合素免疫组化和流式细胞仪检测胚胎干细胞向表皮样干细胞的分化.[结果]与人羊膜共培养4～5 d后,ES细胞分化为表皮细胞样的单层细胞,细胞排列紧密,呈多边形,免疫组织化学染色后,多数细胞呈现β1整合素阳性,对照组大量细胞死亡,未见β1整合素阳性细胞;流式细胞仪检测结果显示实验组和对照组β1整合素阳性细胞分别为81.4%和8.4%,两者比较差异显著,Z检验P<0.01.[结论]人羊膜组织可在体外诱导胚胎干细胞分化为表皮样干细胞.     

体外定向诱导人胚胎干细胞分化为表皮样干细胞的研究

目的 探索体外定向诱导人胚胎干细胞（hES细胞）分化为表皮样干细胞的条件，为研究其定向分化机理及寻找新的皮肤组织工程种子细胞奠定基础。方法 将人胚胎干细胞单独（对照组）或与人羊膜上皮面向上全铺或半铺布半孔底共培养4－5d，观察其形态变化并分别用β1整合素，CK15及CK19免疫组化检测人胚胎干细胞向表皮样干细胞的分化。结果 人胚胎干细胞与人羊膜共培养4－5d后，在人羊膜上皮面形成表皮样干细胞集落，表达高水平的表皮干细胞异标记物β1整合素，CK15和CK19。在无羊膜覆盖处，细胞贴壁生长，形成单层表皮样细胞，细胞呈多边形，排列紧密，大部细胞表达β1整合素。对照组大理细胞死亡，未见β1整合素阳性细胞。结论 在体外人羊膜可定向诱导人胚胎干细胞分化为表皮样干细胞，并提示在羊膜上皮面的细胞克隆可能是表皮样干细胞，而贴壁生长的细胞可能大部分是表皮样瞬间放大细胞。     

体外定向诱导人胚胎干细胞分化为表皮样干细胞的研究

[目的]探索体外定向诱导人胚胎干细胞(hES细胞)分化为表皮样干细胞的条件,为研究其定向分化机理及寻找新的皮肤组织工程种子细胞奠定基础。[方法]将人胚胎干细胞单独(对照组)或与人羊膜上皮面向上全铺或半铺布半孔底共培养4~5 d,观察其形态变化并分别用β1整合素,CK15及CK19免疫组化检测人胚胎干细胞向表皮样干细胞的分化。[结果]人胚胎干细胞与人羊膜共培养4～5 d后,在人羊膜上皮面形成表皮样干细胞集落,表达高水平的表皮干细胞特异标记物β1整合素、CK15和CK19。在无羊膜覆盖处,细胞贴壁生长,形成单层表皮样细胞,细胞呈多边形,排列紧密,大部分细胞表达β1整合素。对照组大量细胞死亡,未见β1整合素阳性细胞。[结论]在体外人羊膜可定向诱导人胚胎干细胞分化为表皮样干细胞,并提示在羊膜上皮面的细胞克隆可能是表皮样干细胞,而贴壁生长的细胞可能大部分是表皮样瞬间放大细胞。     

胚胎干细胞源性表皮干细胞在腹腔微环境中分化潜能的初步研究

【目的】 探讨胚胎干细胞源性的表皮干细胞在腹腔微环境中的分化情况,为研究其在不同微环境中的分化稳定性和全能性及寻找新的皮肤工程种子细胞奠定基础?【方法】 小鼠ES E14细胞与人羊膜共培养4～5 d,定向诱导其分化为表皮样干细胞克隆,它们呈β1整合素?CK15和CK19阳性,移植入裸鼠腹腔?对移植后细胞的分化情况进行形态学和CEA?CK10?CK18?CK19免疫组织化学观察?【结果】 小鼠胚胎干细胞源性表皮样干细胞在裸鼠腹腔内1～4周,细胞分化为由单层或复层上皮样细胞构成的管状和泡状结构?种植5周后,除上述结构外,可见角化复层扁平上皮?毛囊样?汗腺样及皮脂腺样等结构?免疫组化表明汗腺样结构分别呈CEA和CK18阳性,而角化复层扁平上皮的基底层细胞分别呈CK19和CK10阳性?【结论】 初步结果表明小鼠胚胎干细胞源性表皮样干细胞在腹腔微环境下同样具有分化为角化复层上皮?毛囊样?汗腺样和皮脂腺样结构的潜能?     

胚胎干细胞源性表皮干细胞在腹腔微环境中分化潜能的初步研究

【目的】探讨胚胎干细胞源性的表皮干细胞在腹腔微环境中的分化情况，为研究其在不同微环境中的分化稳定性和全能性及寻找新的皮肤工程种子细胞奠定基础。【方法】小鼠ES E14细胞与人羊膜共培养4～5d，定向诱导其分化为表皮样干细胞克隆，它们呈B1整合素、CK15和CK19阳性，移植入裸鼠腹腔。对移植后细胞的分化情况进行形态学和CEA、CK10、CK18、CK19免疫组织化学观察。【结果】小鼠胚胎干细胞源性表皮样干细胞在裸鼠腹腔内l～4周，细胞分化为由单层或复层上皮样细胞构成的管状和泡状结构。种植5周后，除上述结构外，可见角化复层扁平上皮、毛囊样、汗腺样及皮脂腺样等结构。免疫组化表明汗腺样结构分别呈CEA和CK18阳性，而角化复层扁平上皮的基底层细胞分别呈CK19和CK10阳性。【结论】初步结果表明小鼠胚胎干细胞源性表皮样干细胞在腹腔微环境下同样具有分化为角化复层上皮、毛囊样、汗腺样和皮脂腺样结构的潜能。     

ES细胞源性表皮干细胞与胶原海绵构建组织工程皮肤

【目的】以胚胎干细胞（ES细胞）源性表皮干细胞为种子细胞与胶原海绵构建组织工程皮肤，探讨其对皮肤缺损修复的作用。【方法】胎鼠皮肤成纤维细胞与胶原海绵构建类真皮，植入小鼠全层皮肤缺损创面。以生物膜为载体，把羊膜诱导后带有核标记的ES细胞源性表皮干细胞覆盖在类真皮上，术后1～8周连续取材，HE染色，B1整合素、CK15、CK19、CK10和CEA免疫荧光双标和免疫组化观察。【结果】植入后3周，创面完全长合。较厚新生皮完全覆盖创面，基底层细胞增生，形成许多大小不一的细胞柱伸向真皮层，新生表皮中可见核标记的细胞呈B1整合素、CK15、CK19阳性，真皮中的管腔样结构呈核荧光和β1整合素、CEA免疫组化双标阳性，4～8周新生表皮基底层细胞呈CK19、CK10阳性，新生表皮下可见毛囊样、皮脂腺样结构。【结论】ES细胞源性表皮干细胞为种子细胞与胶原海绵构建的组织工程皮肤可以修复缺损皮肤，在其下真皮层有分化为毛囊样、皮脂腺样和汗腺样的结构，但是是否来源于ES细胞源性表皮干细胞仍需进一步证实。     

ES细胞源性表皮干细胞与胶原海绵构建组织工程皮肤

【目的】以胚胎干细胞(ES细胞)源性表皮干细胞为种子细胞与胶原海绵构建组织工程皮肤,探讨其对皮肤缺损修复的作用。【方法】胎鼠皮肤成纤维细胞与胶原海绵构建类真皮,植入小鼠全层皮肤缺损创面,以生物膜为载体,把羊膜诱导后带有核标记的ES细胞源性表皮干细胞覆盖在类真皮上,术后1～8周连续取材,HE染色,β1整合素、CK15、CK19、CK10和CEA免疫荧光双标和免疫组化观察。【结果】植入后3周,创面完全长合,较厚新生皮完全覆盖创面,基底层细胞增生,形成许多大小不一的细胞柱伸向真皮层,新生表皮中可见核标记的细胞呈β1整合素、CK15、CK19阳性,真皮中的管腔样结构呈核荧光和β1整合素、CEA免疫组化双标阳性,4～8周新生表皮基底层细胞呈CK19、CK10阳性,新生表皮下可见毛囊样、皮脂腺样结构。【结论】ES细胞源性表皮干细胞为种子细胞与胶原海绵构建的组织工程皮肤可以修复缺损皮肤,在其下真皮层有分化为毛囊样、皮脂腺样和汗腺样的结构,但是是否来源于ES细胞源性表皮干细胞仍需进一步证实。     

ES细胞源表皮样干细胞与胶原海绵体外构建组织工程化皮肤

【目的】 探讨以ES细胞源表皮样干细胞构建组织工程皮肤的方法，为构建新的组织工程皮肤奠定基础。【方法】 先把成纤维细胞放置于胶原海绵真皮支架内，体外培养2d，再放置ES细胞源表皮样干细胞，体外培养3d，观察其形态和进行免疫组化检测。【结果】 成纤维细胞与ES细胞源表皮样干细胞均在真皮支架内黏附，免疫组化表明ES细胞源表皮样干细胞仍呈Bl整合素强阳性和CK15、CK19阳性。【结论】 结果提示ES细胞源表皮样干细胞在体外构建的组织工程化皮肤内仍维持未分化状态。     

ES细胞源表皮样干细胞与胶原海绵体外构建组织工程化皮肤

 【目的】 探讨以ES细胞源表皮样干细胞构建组织工程皮肤的方法，为构建新的组织工程皮肤奠定基础。【方法】 先把成纤维细胞放置于胶原海绵真皮支架内，体外培养2d，再放置ES细胞源表皮样干细胞，体外培养3d，观察其形态和进行免疫组化检测。【结果】 成纤维细胞与ES细胞源表皮样干细胞均在真皮支架内黏附，免疫组化表明ES细胞源表皮样干细胞仍呈Bl整合素强阳性和CK15、CK19阳性。【结论】 结果提示ES细胞源表皮样干细胞在体外构建的组织工程化皮肤内仍维持未分化状态。     

人胚胎干细胞源性表皮样干细胞分化潜能

【目的】探讨人胚胎干细胞源性表皮样干细胞的分化潜能，为研究其分化的调控机制及寻找新的人皮肤组织工程种子细胞奠定基础。【方法】将人胚胎干细胞与人羊膜共培养4d，定向诱导其分化为表皮样干细胞克隆，用胰酶消化后移植裸鼠皮下20d、30d及50d。对移植后细胞的分化情况进行了形态学和免疫组织化学观察分析。【结果】人胚胎干细胞源性表皮样干细胞在裸鼠皮下20～30d后，细胞分化为由单层或复层上皮样细胞构成的管状或泡状结构，它们可分别呈CEA和CK18阳性。种植50d后，除上述结构外，可见角化复层扁平上皮、毛囊样、汗腺样及皮脂腺样等结构。【结论】研究结果提示人胚胎干细胞源性表皮样干细胞具有分化为角化复层扁平上皮及毛囊样、汗腺样和皮脂腺样等结构的潜能。     

ES细胞源性表皮干细胞与类真皮构成皮肤类似物的分化

 【目的】以ES细胞源性表皮干细胞为种子细胞构建皮肤类似物,探讨其在皮下的分化潜能。【方法】Hoechst33342标记E14-ES细胞,经羊膜诱导4d后,形成表皮干细胞克隆,并以其作为种子细胞,取129胎鼠成纤维细胞与复合凝胶-明胶海绵复合,形成皮肤类似物,埋植于129小鼠皮下组织。术后2周、4周、6周、8周取材,做HE染色观察,β1整合素、CK15、CK19、CEA、CK18免疫组化荧光双标和免疫组化观察。【结果】术后2周和4周,植块内可见单层立方或柱状上皮构成的管状和泡状结构,6周和8周后,可见角化复层上皮、毛囊样、汗腺样、皮脂腺样等结构,免疫双标结果显示,植入2周和4周,带有蓝色核标记的细胞形成的管状或泡状结构呈β1整合素、CK15、CK19、CEA和CK18阳性,6周和8周后,HE染色中汗腺样结构呈CEA、CK18阳性。【结论】ES细胞源性表皮干细胞与类真皮构建的皮肤类似物,在同种小鼠皮下有分为角化复层上皮、汗腺样、毛囊样、皮脂腺样等结构的潜能。     

ES细胞源性表皮干细胞与类真皮构成皮肤类似物的分化

【目的】以ES细胞源性表皮干细胞为种子细胞构建皮肤类似物，探讨其在皮下的分化潜能。【方法】Hoechst33342标记E14-ES细胞，经羊膜诱导4d后，形成表皮干细胞克隆，并以其作为种子细胞，取129胎鼠成纤维细胞与复合凝胶-明胶海绵复合，形成皮肤类似物，埋植于129小鼠皮下组织。术后2周、4周、6周、8周取材，做HE染色观察，B1整合素、CK15、CK19、CEA、CK18免疫组化荧光双标和免疫组化观察。【结果】术后2周和4周，植块内可见单层立方或柱状上皮构成的管状和泡状结构，6周和8周后，可见角化复层上皮、毛囊样、汗腺样、皮脂腺样等结构，免疫双标结果显示，植入2周和4周，带有蓝色核标记的细胞形成的管状或泡状结构呈B1整合素、CK15、CK19、CEA和CK18阳性，6周和8周后，HE染色中汗腺样结构呈CEA、CK18阳性。[结论]ES细胞源性表皮干细胞与类真皮构建的皮肤类似物。在同种小鼠皮下有分为角化复层上皮、汗腺样、毛囊样、皮脂腺样等结构的潜能。     

Nestin-GFP小鼠胚胎干细胞的建系及体外神经分化

【目的】 建立Nestin-GFP转基因小鼠的胚胎干细胞(mESC)系,并观察其示踪ES细胞系的神经分化过程。【方法】将E3.5的Nestin-GFP小鼠囊胚接种于小鼠胚胎成纤维细胞上(MEF经γ射线照射失去增殖活性)。4 ~ 6 d后将自囊胚长出的内细胞团(ICM)继续培养并传代扩增 ,检测所得细胞Oct-4、SSEA-1和AKP等胚胎干细胞特异性标志物的表达及在体内外向三胚层分化的能力;之后,诱导细胞向神经元样细胞及神经胶质样细胞分化,利用免疫荧光检测其标志性抗原。【结果】 免疫组化可见Nestin-GFP小鼠胚胎干细胞表达未分化细胞特异性标志Oct-4、SSEA-1、AKP染色呈强阳性,并具有向体内外三胚层分化潜能;在体外诱导其向神经分化,第6 d可见到明显的绿色荧光,并与免疫组化Nestin表达部位基本吻合。第12 d及第16 d分别可见神经元及神经胶质细胞特异性标志物表达,而此时Nestin的表达较前明显下降。【结论】 成功建立了Nestin-GFP小鼠胚胎干细胞系,该细胞具有自我更新的特性及多向分化潜能,并可用于在体外更直观的监测神经分化的阶段性变化并由此进行调控。     

川芎含药血清对小鼠胚胎干细胞增殖和分化的影响

【目的】观察川芎含药血清对小鼠胚胎干细胞(ES细胞)增殖及分化的影响。【方法】川芎含药血清与ES细胞共培养,采用CCK-8法检测细胞活性,逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)法检测心肌细胞特异基因肌球蛋白重链(β-MHC)m RNA的表达水平。【结果】与大鼠血清组和胎牛血清组比较,川芎含药血清组的ES细胞活性差异无统计学意义(P0.05),川芎含药血清组心肌细胞特异基因β-MHC表达水平显著升高,差异有统计学意义(P0.05)。【结论】川芎含药血清对ES细胞向心肌细胞分化有促进作用。     

体外诱导胚胎干细胞来源表皮干细胞向汗腺细胞分化的研究

目的:探讨体外诱导胚胎干细胞来源表皮干细胞向汗腺上皮分化可行性及条件,为汗腺组织工程探索新的种子细胞提供来源。方法:体外分离培养、扩增并鉴定人汗腺细胞。将胚胎干细胞培养于人羊膜表面诱导其向表皮干细胞转化后,与人汗腺细胞直接共同培养,诱导其分化为汗腺细胞。采用倒置显微镜进行形态学观察,并用免疫细胞化学染色方法检测诱导分化结果。结果:体外培养的人汗腺细胞CK19、CEA阳性表达。培养于人羊膜表面的胚胎干细胞β1整合素呈强阳性表达,符合表皮干细胞的表面抗原标志。经与人汗腺细胞共培养2周后,有部分胚胎干细胞来源的表皮干细胞表达CEA,表明通过汗腺细胞分泌的细胞因子、细胞间直接接触等可能的作用途径,使其表型向汗腺细胞表型转化。结论:胚胎干细胞来源表皮干细胞可能成为汗腺组织工程种子细胞的重要来源。     

Study on the differentiation of embryonic stem cells derived epidermal stem cells into sweat gland cells in vitro

目的:探讨体外诱导胚胎干细胞来源表皮干细胞向汗腺上皮分化可行性及条件,为汗腺组织工程探索新的种子细胞提供来源.方法:体外分离培养、扩增并鉴定人汗腺细胞.将胚胎干细胞培养于人羊膜表面诱导其向表皮干细胞转化后,与人汗腺细胞直接共同培养,诱导其分化为汗腺细胞.采用倒置显微镜进行形态学观察,并用免疫细胞化学染色方法检测诱导分化结果.结果:体外培养的人汗腺细胞CK19、CEA阳性表达.培养于人羊膜表面的胚胎干细胞β1整合素呈强阳性表达,符合表皮干细胞的表面抗原标志.经与人汗腺细胞共培养2周后,有部分胚胎干细胞来源的表皮干细胞表达CEA,表明通过汗腺细胞分泌的细胞因子、细胞间直接接触等可能的作用途径,使其表型向汗腺细胞表型转化.结论:胚胎干细胞来源表皮干细胞可能成为汗腺组织工程种子细胞的重要来源.     

ES细胞源性表皮干细胞分化潜能的研究

目的探讨人羊膜诱导的ES细胞源性表皮干细胞在肾被囊内的分化,研究其在不同微环境中的分化潜能和稳定性,为组织工程皮肤寻找新的种子细胞奠定基础。方法Hoechst33342标记129小鼠E14胚胎干细胞,与人羊膜共培养4d,定向诱导其分化为的表皮干细胞克隆,诱导后的细胞移植入129小鼠肾被囊内,术后4,6和8周取材。对移植后细胞的分化进行形态学和免疫荧光双标CK19及CK18检测。结果ES细胞源性表皮干细胞在小鼠肾被囊内4周,分化为由单层或复层上皮样细胞构成的管状和泡状结构,种植6周和8周,除上述结构外,可见角化复层上皮、汗腺样、皮脂腺样及毛囊样等结构。管泡状结构免疫荧光双标染色呈CK19及CK18阳性。结论ES细胞源性表皮干细胞在肾被囊内,仍具有分化为角化复层上皮、汗腺样、皮脂腺样及毛囊样结构的潜能。     

体外构建的皮肤模型Inspectskin Ⅰ修复裸鼠全层皮肤缺损

【目的】探讨胚胎来源表皮干细胞构建的人工皮肤模型InspectskinⅠ修复全层皮肤缺损的作用,为构建含皮肤附属结构的检验用皮肤奠定基础。【方法】将人羊膜和BMP-4定向诱导小鼠胚胎细胞分化为表皮干细胞,采用筏式培养在体外与PHBV和成纤维细胞共培养构建组织工程皮肤,经短暂培养后移植于裸鼠皮肤缺损创面,对移植物进行形态学和免疫组织化学观察。【结果】移植物可封闭皮肤缺损,在其表面可形成复层表皮样结构,真皮部分可见大小不等的由单层或复层上皮样细胞构成的管状和泡状结构、汗腺样结构和毛囊样结构。免疫组化和免疫双标结果表明新生表皮的基底层分别呈CK19和CK10阳性,腺管样结构分别呈CEA和CK18阳性。【结论】体外重建的人工皮肤能修复裸鼠全层皮肤缺损,胚胎来源表皮干细胞具有分化为复层扁平上皮、汗腺样结构和毛囊样结构的潜能。