东方田鼠血清及其不同部分对日本血吸虫童虫的体外杀伤作用

目的 对东方田鼠血清及其不同部分对日本血吸虫童虫的体外杀伤的可能机制进行初步探讨。方法 将血清初步分离成含蛋白部分及分子量小于20kDa的小分子部分，并分别观察了东方田鼠全血清、去补体血清、蛋白及小分子血清成分对体外培养童虫的杀伤，此外，还观察了蜕皮素对东疗田鼠血清杀伤作用的影响。结果 东方田鼠热灭活去补体血清对童虫的杀伤显著低于正常血清；感染及正常东方田鼠血清小分子在第48h及72h表现出一定杀伤作用(30％)，而血清蛋白在24h就有显著杀伤，但杀伤作用略低于全血清；蜕皮素对东方田鼠血清的杀伤无明显影响。结论 补体在东方田鼠血清杀伤机制中有重要作用。血清蛋白为体外杀伤的主要成分，可能与小分子成分协同参与杀伤。     

东方田鼠血清组分对日本血吸虫童虫的体外杀伤力

目的 探讨东方田鼠血清不同组分对日本血吸虫童虫的杀伤力，以期发现东方田鼠血清中参与其天然抗日本血吸虫的相关蛋白质。 方法 以离子交换柱层析及分子筛柱层析技术对东方田鼠血清蛋白质进行分离，将所得血清不同组分加入体外培养的2日龄日本血吸虫童虫中（100±20条/孔），计算童虫死亡率以判断血清不同组分对童虫的杀伤力。 结果 从东方田鼠血清分离出58个蛋白组分，其中6个组分具有明显的杀伤日本血吸虫童虫的活性，童虫死亡率均在37% 以上，特别是组分18.1的童虫死亡率达87.5%，而阴性对照组童虫死亡率为25.0%（P＜0.01）。 结论 东方田鼠血清中某些蛋白质参与其抗日本血吸虫的过程。     

东方田鼠血清体外杀伤日本血吸虫童虫效果的初步观察

目的　观察灭活补体和未灭活补体的东方田鼠血清体外杀伤日本血吸虫童虫的效果。方法　将血吸虫童虫分别与灭活补体和未灭活补体的东方田鼠阳性 /阴性血清、昆明鼠阳性 /阴性血清共同培养于 37℃ 5 %CO2 培养箱中 ,在培养 16～ 2 0h、4 0～ 4 4h观察记录各孔内死、活童虫数 ,并计算童虫死亡率。结果　培养 2 0～ 2 4h和 4 4～ 4 8h ,各种血清样本孔中的平均童虫死亡率分别为 :东方田鼠阳性血清 37.92 %± 16 .36 %和 4 0 .15 %± 15 .81%、灭活东方田鼠阳性血清 13.4 0 %± 4 .5 3%和 12 .2 9%± 1.84 %、东方田鼠阴性血清 17.79%± 9.2 1%和 2 4 .73%± 6 .2 5 %、灭活东方田鼠阴性血清血清 8.6 7%± 2 .0 6 %和 10 .4 5 %± 2 .71%、昆明鼠阳性血清 7.5 4 %± 1.85 %和 16 .39%± 2 .6 0 %、灭活昆明鼠阳性血清 7.2 3%± 1.83%和 12 .2 3%± 1.94 %、昆明鼠阴性血清 6 .5 0 %± 2 .76 %和 18.85 %± 6 .2 9%、灭活昆明鼠阴性血清 7.4 9%± 6 .2 8%和 14 .99%± 5 .16 %、血清空白 3.2 3%和 8.2 9%。结论　东方田鼠血清具有明显的杀伤日本血吸虫童虫作用 ,其中的补体可能是在东方田鼠抗血清杀伤日本血吸虫童虫中起决定作用的因子。     

正常东方田鼠血清及脾细胞体外杀血吸虫童虫作用的初步观察

目的研究野生和繁殖东方田鼠血清和/或脾细胞在体外对日本血吸虫童虫的杀伤作用.方法东方田鼠血清和/或脾细胞与童虫在体外共培养,16～18h后在倒置显微镜下观察,计算童虫死亡率.结果东方田鼠血清或脾细胞对童虫的校正死亡率分别为67.36%土4.00%(野生鼠)和64.39%±5.86%(繁殖鼠)、66.02%±1.40%(野生鼠)和66.38%±2.18%(繁殖鼠);东方田鼠血清加脾细胞的童虫校正死亡率为76.68%±6.27%(野生鼠)和79.03%±8.00%(繁殖鼠),均显著高于单纯血清或脾细胞的校正死亡率;野生鼠和繁殖鼠对童虫的杀伤作用无显著性差异.结论东方田鼠血清和脾细胞均具有体外杀童虫作用,并表现出一定的协同杀伤作用,且野生鼠与繁殖鼠之间无显著性差异.     

东方田鼠天然抗日本血吸虫感染相关蛋白质的分离和纯化

目的从东方田鼠血清中分离纯化与其天然抗日本血吸虫感染特性相关的蛋白质。方法以分子筛色谱及高效液相色谱技术对东方田鼠血清蛋白质进行分离和纯化,以体外日本血吸虫童虫杀伤实验确定具有抗日本血吸虫童虫活性蛋白质,并对活性蛋白质进行N端氨基酸序列测定,通过检索蛋白质数据库以确定活性蛋白质的性质和种类。结果利用分子筛色谱及高效液相色谱技术从东方田鼠血清中获得了三个对日本血吸虫童虫具有明显杀伤活性的蛋白质组份1-1、4-1、6-3,经对4-1的N末端氨基酸序列进行测定,其序列为DAHKSEIAHR,检索蛋白质数据库,该蛋白质为白蛋白样蛋白质,但与人或其它动物的白蛋白进行比较,存在较大程度的氨基酸残基变。结论东方田鼠血清中的白蛋白是东方田鼠天然抗日本血吸虫感染的重要效应分子。     

东方田鼠IgG3抗体抗血吸虫病作用研究

采用ELISA方法, 平行检测东方田鼠、 BALB/c小鼠和昆明小鼠在攻击感染前、 后的血清抗血吸虫童虫(SSA)、 成虫 (SAWA) 和虫卵(SEA) IgG3抗体水平, 并进行体内、 外试验, 观察IgG3抗体抗血吸虫效应。结果攻击感染后第4周, 东方田鼠抗SSA和SAWA的IgG3抗体水平增幅较大, 分别较感染前增加79.6%和49.6%, BALB/c小鼠IgG3抗体在攻击感染后无明显增加。野生和室内繁殖的东方田鼠的IgG3抗体所致童虫死亡率分别为昆明小鼠的5.88和2.35倍, 前者还诱生出较高的减虫率 (39.8%)。提示东方田鼠IgG3抗体可能是其抗血吸虫感染的主要免疫物质。     

东方田鼠肺成纤维细胞的分离培养及其对日本血吸虫的杀伤作用

目的探索和建立东方田鼠肺成纤维细胞体外分离、培养的技术方法,并观察其对日本血吸虫的杀伤作用。方法运用含15%小牛血清的Dulbecco改良Eagle培养液(DMEM)和RPMI 1640两种培养体系,采用组织块贴壁法和胰酶消化法,分别对出生后1、3和5 d的东方田鼠乳鼠肺成纤维细胞(Microtus fortis lung fibroblasts,MfLF)进行原代分离、培养,倒置显微镜下观察MfLF形态和生长特性.第2代和第3代MfLF培养上清与日本血吸虫童虫共培养96 h,观察其对童虫的杀伤效果。结果实验发现,采用胰酶消化法培养,只有少量MfLF细胞缓慢贴壁生长,而组织块贴壁法MfLF贴壁速度较快。不同日龄幼鼠的肺成纤维细胞采用组织块贴壁法培养,细胞活率和细胞纯度以1～3日龄乳鼠为最佳。在DMEM和RPMI 1640两种培养液中MfLF均可传代培养,两者无明显差异。MfLF体外只可传代4～5次。日本血吸虫童虫经第2代和第3代MfLF培养上清处理后,死亡率分别为9.5%和10.5%,与阴性对照(8.8%)比较差异无统计学意义(P<0.05)。结论提示组织块贴壁法适用于MfLF的体外培养,但MfLF培养上清对日本血吸虫童虫无明显杀伤效果。     

洞庭湖区东方田鼠血吸虫感染性调查

目的观察野外东方田鼠对血吸虫的感染性。方法选择湖南省洞庭湖区的岳阳县傍湖村和沅江市南港村，分别在垸外和垸内捕捉东方田鼠解剖检查鼠的肝脏、门静脉和肠系膜静脉系统有无血吸虫卵、成虫和童虫。结果总计捕捉和解剖东方田鼠1440只，均未发现血吸虫成虫、童虫和虫卵。结论东方田鼠不感染血吸虫。     

筛选和鉴定与东方田鼠抗性基因ILKAP表达蛋白相互结合的日本血吸虫童虫蛋白

目的筛选和鉴定与东方田鼠抗性基因整合素连接激酶相关丝氨酸/苏氨酸磷酸酶(ILKAP)表达蛋白相互结合的日本血吸虫童虫蛋白。方法提取东方田鼠骨髓细胞蛋白和日本血吸虫童虫蛋白,进行免疫共沉淀,实验组为东方田鼠骨髓蛋白+日本血吸虫童虫蛋白+ILKAP抗体+磁性珠子,阴性对照组以兔IgG抗体代替ILKAP抗体,阳性对照组为东方田鼠骨髓蛋白或日本血吸虫童虫蛋白。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对免疫沉淀复合物进行分离,切取差异性蛋白条带通过基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪(MALDITOF-MS)鉴定,获得的混合物肽片段利用Mascot软件进行分析检索。分别以东方田鼠骨髓cDNA和日本血吸虫童虫c DNA为模板, RT-PCR扩增东方田鼠ILKAP (Mf ILKAP)基因和日本血吸虫表膜抗原(Sj TA)基因。将Mf ILKAP和Sj TA基因分别克隆至真核表达载体Flag-pCMV-2b和Myc-pcDNA3.1/(-) b中,构建的重组质粒FlagILKAP-pCMV-2b和Myc-TA-pcDNA3.1/(-) b共转染至HEK293T细胞中作为实验组,设阴性对照组Myc-TApcDNA3.1/(-) b或Flag-ILKAP-pCMV-2b和空白对照组Myc-pcDNA3.1/(-) b或Flag-pCMV-2b。用抗体Myc、 Flag以及ILKAP分别与转染后的HEK293T细胞总蛋白进行免疫共沉淀和蛋白质印迹(Western blotting)分析。结果东方田鼠骨髓细胞蛋白和日本血吸虫童虫蛋白经过免疫共沉淀实验,结果显示,实验组与阴性对照组、阳性对照组相比,有差异条带。经MAIDI-TOF-MS鉴定,利用Mascot软件中的串级质谱数据搜索功能进行搜索鉴定,鉴定出与东方田鼠ILKAP抗体相互作用的日本血吸虫童虫蛋白8种。RT-PCR结果显示, ILKAP和TA在东方田鼠骨髓和日本血吸虫童虫中均有表达,东方田鼠骨髓ILKAP的扩增产物为1 100～1 200 bp,理论值为1 147 bp,日本血吸虫童虫TA基因的扩增产物大小为500～600 bp,理论值为561 bp。质粒pCMV-Tag 2b、 pcDNA3.1/myc-His (-) b经酶切后,均有单一条带,分别约为4 300、 5 500 bp;重组质粒Flag-ILKAP-pCMV-2b经酶切鉴定后,其大小分别为4 300和1 147 bp, Myc-TA-pcDNA3.1/(-) b经酶切鉴定后,其大小分别为5 500和561 bp。Western blotting分析结果显示,两种重组真核表达载体共转染实验组的PVDF膜分别与Myc、 Flag以及ILKAP抗体孵育后有条带出现,而其他对照组无条带出现。结论鉴定出与Mf ILKAP抗体相互作用的日本血吸虫童虫蛋白8种,在HEK293T细胞中共表达了与Mf ILKAP结合的Sj TA基因, Mf ILKAP与Sj TA之间存在直接相互作用。     

室内繁殖和野生东方田鼠感染日本血吸虫的比较

用室内繁殖第三代乐方田鼠和野生东方田鼠进行了日本皿吸虫人工感染比较试验。结果表明，东方田鼠通过室内繁殖三代继代后，仍对日本血吸虫感染存在抵抗力，虫体不能在其体内生长发育成熟，但日本血吸虫在室内繁殖第三代东方田鼠体内较野生既体内生长发育为好。童虫在野生东方田鼠肺脏内的停留时间较室内繁殖田鼠肺脏内长２天，而日本血吸虫在野生东方田鼠体内生长发育停滞时间要较室内繁殖者早２天，此外，室内繁殖鼠体内的虫体较野生鼠体内同龄虫体大。野生鼠肝脏表面虫体炎性结节较室内繁殖鼠早出现１天，消退亦早４天。日本血吸虫在野生鼠体内消亡亦较室内繁殖者早。     

Studies on antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity to Schistosoma japonicum schistosomula in mice

In the presence of antischistosomular serum (Ab), the adherence of macrophages (M?) eosinophils (Eos) and neutrophils(Neu) to and the killing effect on schistosomula of Schistosoma japonicum were studied with a mouse model. In vitro experiment showed that all the three kinds of effector cells could adhere to the surface of the schistosomula when opsonized with specific Ab resulting in the significant increase in the percentage of dead schistosomula. When SPA was added to the system, the percentage of schistosomula with adherent cells decreased markedly. It was revealed that the adherence of cells was at least partially through the binding of Fc fragment of IgG to Fc receptor on the cell surfaces. After having been incubated with Ab and/or cells for 18 h in vitro, the schistosomula were inoculated into the peritoneal cavity of mice. The adult recovery rate 6 weeks after inoculation in groups Eos + Ab and M? + Ab were significantly lower than that of the control group (P less than 0.01).     

白头翁总皂苷对体外培养的日本血吸虫幼虫及成虫的作用

目的 目的 探讨白头翁总皂苷 （Pulsatilla chinensis（Bunge）Regel saponins, PRS） 对不同发育阶段的日本血吸虫的体外 杀灭效果。方法 方法 日本血吸虫3 h和7、 14 d童虫及成虫分别用0、 1、 5、 10、 20、 30 μg/ml PRS及30 μg/ml吡喹酮 （PZQ） 孵育 4、 24、 48、 72 h后, 观察虫体变化及状态; 用扫描电镜观察30 μg/ml PRS及PZQ孵育4 h内的日本血吸虫成虫的体表变化。 结果 结果 PRS对日本血吸虫3 h和7、 14 d童虫及成虫的体外杀灭效果呈时间和剂量依赖性。经30 μg/ml PRS作用4 h后, 日 本血吸虫童虫及成虫全部死亡; 死亡虫体颜色发暗, 形态发生改变且虫体不透明。扫描电镜观察发现, PRS作用后的日本 血吸虫成虫体表有不同程度损伤。结论 结论 传统中草药PRS可能对日本血吸虫感染有一定的治疗和预防作用, 有希望成为 新的抗血吸虫药物     

东方田鼠肝内巨噬细胞的分离和鉴定

目的 目的 对东方田鼠 （Microtus fortis,Mf） 肝内巨噬细胞进行分离纯化和功能鉴定。方法 方法 采用在体灌注、 胶原 酶消化及梯度密度离心相结合的方法分离Mf肝内巨噬细胞, 并采用流式和墨汁吞噬功能实验进行巨噬细胞的功能鉴 定。结果 结果 通过此方法获得Mf肝脏来源的巨噬细胞, 分离的细胞呈透亮圆形, 贴壁生长, 活细胞比例为95%。Mf来源的 巨噬细胞与抗鼠CD14流式单抗 （Clone：Sa2?8） 阳性结合率是小鼠来源巨噬细胞与该抗体结合率的50%左右。Mf肝脏来 源的巨噬细胞墨汁吞噬实验阳性。结论 结论 该方法能有效地分离纯化Mf肝内巨噬细胞, 可为进一步研究东方田鼠肝脏巨 噬细胞抗血吸虫机制奠定基础。     

小鼠感染后不同时间血清对日本血吸虫童虫细胞介导的细胞毒作用

用抗体依赖、细胞介导的细胞毒试验(ADCC)观察了小鼠感染后不同时间血清在体外杀伤系统中对日本血吸虫童虫的作用规律。未加补体时,嗜酸粒细胞或巨噬细胞介导的童虫杀伤作用于感染后4wk出现明显作用,分别于5—7wk和6—8wk达高峰,然后下降,至11wk时降至4wk时的水平;而未加补体时无明显的中性粒细胞介导的杀伤作用。在补体参与下,这三种细胞均能介导对童虫的杀伤作用,且作用增强。证实ADCC是日本血吸虫获得性抵抗力的一个重要组分,嗜酸粒细胞、巨噬细胞介导的对童虫的细胞毒作用是不依赖补体的,而中性粒细胞介导的作用是依赖补体的。结果对选择免疫预防适宜时间和评价候选疫苗效果有参考意义。     

小鼠感染后不同时间血清对日本血吸虫童虫细胞介导？..

The tests of antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) were performed to observe the kinetics of in vitro killing of Schistosoma japonicum schistosomula mediated by eosinophils, macrophages or neutrophils with infected mouse sera of different duration. The results showed that when complement was not involved, the killing rates of schistosomula mediated by eosinophils or macrophages began to increase significantly at 4 wk post-infection, reached a plateau in 5-7 wk and 6-8 wk respectively, and then declined to the levels of that at 4 wk till 11 wk. In case of neutrophils, there was no significant cytotoxicity detected. When complement was involved, all the three effector cells could mediate cytotoxicity to schistosomula, with the killing rates higher than those without complement at the correspondent time intervals. These indicate that ADCC appears to be an important ingredient in the acquired resistance to S. japonicum, and demonstrate that eosinophil- and macrophage-mediated cytotoxicity to schistosomula is complement-independent, whereas neutrophil-mediated cytotoxicity to schistosomula is complement-dependent. This method may be of some value for choosing optimal time for vaccination and estimating the effectiveness of a candidate vaccine.     

Depression of hydrogen peroxide dependent killing of schistosomula in vitro by peritoneal exudate cells from Schistosoma mansoni infected mice

Peritoneal exudate cells from mice infected with Schistosoma mansoni (S-PEC) can kill a small proportion of schistosomula in vitro in the presence of immune serum. S-PEC produce a low level of respiratory burst. However, schistosomula mortality in their presence is not reduced when exogenous antioxidants are added, suggesting that with S-PEC, oxidative killing may not be important. Hydrogen peroxide (H2O2) and superoxide production by S-PEC, and cells from Bacillus Calmette-Guerin (BCG) and thioglycollate (THGL) injected mice, nonspecifically stimulated with opsonized zymosan, were measured. Levels of H2O2 produced by S-PEC were significantly lower than BCG or THGL PEC, and were below the threshold for schistosomula killing. This correlated with lower levels of cell-mediated killing of schistosomula in vitro by S-PEC than by BCG-PEC. Superoxide levels, however, were similar between the 3 cell populations. It therefore appears that the efficiency of PEC to kill schistosomules in vitro correlates with H2O2 rather than superoxide levels. It was found that there was a sharp concentration threshold in H2O2 mediated killing of schistosomula. A depression in the levels of H2O2 produced may be a mechanism by which the parasite can partially evade the host immune system.