土鳖虫多肽的分离纯化及溶栓活性研究

目的 对土鳖虫多肽进行分离纯化,并对其溶栓活性进行研究.方法 采用仿生酶解工艺制备土鳖虫复合多肽,以溶栓活性为指标,采用Sephadex G-25、SP Sephadex C-25凝胶柱和RP-HPLC C18半制备色谱柱对复合多肽进行分离纯化,并测定目标多肽组分(Peak b)的溶栓活性、肽含量和分子量.结果 目标多肽组分的溶栓活性为814 430 U·mg-1,肽含量为95.7％,分子量分布在3 211 ～3 547.结论 利用仿生酶解制备的土鳖虫多肽,经分离纯化后,得到一具有较强溶栓活性的多肽组分.     

土鳖虫不同工艺提取物抗凝作用的比较研究

目的研究土鳖虫的酶解法提取工艺。方法以提取液的得膏量、总肽含量、抗凝血酶活性及大鼠在体抗凝血作用为指标,检测各工艺提取液的成分含量及活性。结果仿生酶解法提取得膏量最大,总肽含量最高,抗凝血酶活性最强,大鼠血瘀模型凝血时间最长。结论与传统技术相比,仿生酶解技术提取土鳖虫提取更充分,效率更高,活性更强。     

土鳖虫胰酶酶解物抗凝活性部位分离纯化及组成分析

目的:采用溶剂萃取和凝胶柱色谱法对土鳖虫胰酶酶解物进行分离纯化,初步确定其抗凝活性部位及化学成分组成。方法:应用胰酶酶解法制备土鳖虫胰酶酶解物,以APTT(活化部分凝血酶时间)为指标,采用溶剂萃取法,获得抗凝活性部位IV,经凝胶柱色谱法对其进行分离纯化获得胰酶酶解纯化物;采用考马斯亮蓝法对纯化物进行定量分析,通过MALDI-TOF-MS检测分离部分的分子量分布范围。结果:土鳖虫胰酶酶解物部位IV有较强的抗凝活性,其抗凝活性强度与酶解物质量浓度相关;部位IV经Sephadex G-25纯化后,通过考马斯亮蓝法测得其蛋白质量分数5.5%;进一步经Sephadex G-10脱盐的纯化物,采用MALDI-TOF-MS检测,确定为相对分子质量在850～910 Da的3组多肽混合物。结论:采用凝胶柱色谱法分离纯化土鳖虫胰酶酶解物是可行的,抗凝活性组分是<1 000 Da的小分子肽类。     

雄性土鳖虫中不同分子量多肽活性研究

目的:对雄性土鳖虫不同分子量物质进行活性测定,得到最强活性片段。方法:采用不同截留孔径的超滤、纳滤;DA201-c树脂、葡聚糖G25对样品进行分子量分离,得到不同分子量组分,并采用体外抗凝实验、溶栓实验、平板实验等测定其活性。结果:采用超滤、纳滤得到小于1000 Da、1000～3000 Da、大于3000 Da组分,并通过实验测定得到1000～3000 Da的物质活性最强,再通过DA201-C树脂对活性组分进行极性分离,得到三个洗脱组分:25%乙醇洗脱组分、50%乙醇洗脱组分、75%乙醇洗脱组分。并通过抗凝、溶栓试验得到50%乙醇洗脱组分活性最强。再将50%乙醇洗脱组分经过G25进行分离,得到三个峰位,分别记为FIV1、FIV2、FIV3。经抗凝、溶栓实验测得FIV2活性强。在经过高效液相得出FIV2组分的分子量集中于1000～1500 Da。结论:通过超滤、树脂、尺寸排阻色谱分离得到的活性组分,可以进一步进行分离,为以后的肽段测序奠定基础。     

土鳖虫多肽对家兔血瘀模型的影响

目的：观察土鳖虫多肽的活血化瘀作用。方法：高分子右旋糖酐静注造成家兔血瘀模型，观察土鳖虫多肽对血瘀模型家兔血黏度、血小板聚集、血栓形成的影响。结果：土鳖虫多肽明显降低血瘀家兔血黏度、抑制血小板聚集和体外血栓形成。结论：土鳖虫多肽具有明显活血化瘀作用。     

土鳖虫多肽溶液抗肿瘤作用研究

目的：研究土鳖虫多肽溶液抗肿瘤作用。方法：以H22肿瘤小鼠为动物模型,给药10天后处死,取肿瘤、脾脏、胸腺并称重,计算抑瘤率、脾脏系数和胸腺系数;取肝脏检测MDA水平和SOD活性。结果：土鳖虫多肽溶液对H22肿瘤小鼠的抑瘤率为46．79％,脾脏系数和胸腺系数均较模型对照组升高（P〈0．05）;土鳖虫多肽能使肿瘤小鼠肝脏MDA水平降低和SOD活性升高,与模型组比较有差异（p〈0．05）。结论：土鳖虫多肽溶液对H22肿瘤小鼠有抗肿瘤作用。     

土鳖虫仿生酶解法提取工艺研究

目的研究土鳖虫的仿生酶解法提取工艺。方法采用正交实验优选仿生酶解的最佳工艺条件。结果土鳖虫仿生酶解最佳工艺条件为:药材粉碎过80目筛,加10倍量水煮沸15 min,待冷至40℃,以稀盐酸溶液调节p H1.5~2.0,加入1%土鳖虫量的胃蛋白酶,40℃保温酶解1 h,以20%氢氧化钠溶液调节p H7.5~8.0,加入1%土鳖虫量的胰蛋白酶,40℃保温酶解3 h,加热煮沸15 min,即得。结论优选出的提取工艺条件合理、可行、提取效率高。     

海蜇酶解多肽分离纯化及其抗氧化活性研究

目的 研究海蜇酶解多肽的抗氧化活性.方法 采用碱性蛋白酶酶解提取海蜇多肽,用超滤方法获得不同分子量的酶解液,从还原体系、羟自由基清除体系和DPPH自由基清除体系3方面,研究海蜇酶解液抗氧化肽的活性.结果 不同分子量的海蜇酶解物具有较强还原性,对羟自由基、DPPH自由基清除作用均较强,且抗氧化活性随着浓度的增加而明显增加.从分子量来看,小于3KDa组分抗氧化活性最强,当浓度为15 mg/ml时,其对羟自由基和DPPH自由基的清除率分别为62.27％和78.25％.结论 海蜇酶解物具有抗氧化活性,且小分子肽的抗氧化活性最强.     

海洋生物酶解多肽活性功能研究进展

本文对近几年来采用酶解方法从海洋生物蛋白中获取生物活性肽的相关研究进行了综述,介绍了该类生物活性肽抗氧化、抗高血压、抗肿瘤、抗血栓形成等活性功能的研究现状,描述了各研究的蛋白来源、酶的选择及生物活性肽的分离纯化手段等,并对该研究领域提出展望,旨在为以后的相关研究提供参考。     

土鳖虫多肽对正常和免疫抑制小鼠免疫功能的影响

目的 研究土鳖虫多肽对小鼠免疫功能的影响.方法 土鳖虫多肽灌胃给予小鼠10 d,于最后3d腹腔注射环磷酰胺( 50 mg/kg)制备免疫抑制小鼠.观察胸腺、脾脏指数,碳粒廓清指数和血清白介素-2(IL-2)水平.结果 土鳖虫多肽具有促进胸腺和脾脏发育及保护胸腺和脾脏的作用;土鳖虫多肽可显著提高免疫抑制小鼠单核/巨噬细胞的吞噬功能;提高正常和免疫抑制小鼠血清IL-2含量.结论 土鳖虫多肽可提高正常和免疫抑制小鼠的免疫能力.     

新疆4种山楂果实中总黄酮的纯化与抗氧化活性考察

目的:优选大孔树脂纯化4种新疆山楂果实总黄酮的工艺条件,评价其抗氧化活性。方法:以总黄酮纯度为评价指标,比较13种大孔树脂对4种山楂果实总黄酮的吸附分离效果,考察上样流速、洗脱剂浓度对4种山楂总黄酮大孔树脂纯化工艺的影响。以清除2,2'-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)和二苯代苦味酰基(DPPH)自由基的方法测定样品的抗氧化活性,利用HPLC测定样品芦丁和金丝桃苷的含量,流动相乙睛-0.4%甲酸溶液(16:84),检测波长360 nm。结果:选择HPD722型大孔树脂纯化总黄酮,最佳纯化工艺条件为上样流速0.84 mL·min^-1,总黄酮经树脂充分吸附后,加40%乙醇动态洗脱。经HPD722型大孔吸附树脂纯化后,4种山楂的总黄酮、芦丁、金丝桃苷质量分数和抗氧化活性分别提高了1.9~3.3,2.4~5.1,2.6~3.7,2.0~4.6倍。结论:HPD722型大孔树脂可有效地对4种新疆山楂果实总黄酮进行富集纯化,为这4种药材资源的充分利用提供参考。     

土鳖虫及其混淆品HPLC指纹图谱分析

目的通过OPA-FMOC在线自动衍生化,建立土鳖虫的HPLC指纹图谱分析方法。方法色谱柱为Durashell-AA柱(150 mm×4.6 mm,3μm);流动相组成为A:0.01 mol/L磷酸氢二钠及四硼酸钠水溶液(盐酸调节p H值至8.2);流动相B:甲醇-乙腈-水(45∶45∶10);体积流量1.6 m L/min;检测波长:0~24 min,338 nm;24~27 min,228 nm;柱温45℃;梯度洗脱。结果共得到28个共有峰,指认了其中15个化学成分,建立了土鳖虫及其混淆品HPLC指纹图谱并计算相似度,根据SPSS聚类分析结果,将其分为2类,第I类药材为地鳖或冀地鳖,第II类为金边地鳖。结论所建立的土鳖虫HPLC指纹图谱快速、准确、重复性好,为土鳖虫的质量控制提供科学依据。     

土鳖虫DNA的RAMP-PCR反应体系的建立及优化

目的 建立并优化土鳖虫基因组DNA的RAMP-PCR反应体系及扩增程序,为土鳖虫遗传多样性的研究提供依据。方法 以雌性土鳖虫为材料,常规酚/氯仿提取基因组DNA。使用RAMP引物（ISSR807＋RAPD A₅）,采用正交优化方法对影响PCR反应的Mg²⁺、dNTPs、引物、DNA聚合酶、模板进行体系优化,同时选择最佳的引物退火温度。结果 最适引物（ISSR807＋RAPD A₅）组合进行土鳖虫的RAMP-PCR分析的反应体系为总体积25 μL,包括10×缓冲液2.5 μL、Mg²⁺ 1.00 mmol/L、dNTPs 2.00 mmol/L、引物0.50 μmol/L、TaqDNA聚合酶1.00 U、DNA模板1.50 ng/μL,最佳退火温度为46.8 ℃。结论 本实验建立的最佳RAMP-PCR反应体系稳定、重复性好,可用于土鳖虫种质资源鉴定和遗传多样性研究。     

叠鞘石斛联苄类化合物的大孔树脂纯化工艺优选及抗氧化活性考察

目的：优选叠鞘石斛联苄类化合物的大孔树脂纯化工艺条件并考察其体外抗氧化活性。方法：以静态饱和吸附量和洗脱率为指标,通过静态吸附-洗脱试验筛选大孔树脂型号。采用单因素试验考察上样液质量浓度、上样量、乙醇体积分数、洗脱剂用量、上样流速及洗脱流速对纯化工艺的影响,通过体外抗氧化试验考察联苄类化合物的体外抗氧化能力。结果：HPD-300型树脂纯化联苄类化合物的效果最好,其最佳纯化工艺条件为上样液质量浓度9.04 g·L^-1,上样量1.25 BV,上样流速0.5 mL·min^-1,加水和70%乙醇各5 BV以1.0 mL·min^-1的流速洗脱。纯化后联苄类化合物纯度达67.07%,较纯化前提高了4.25倍。联苄类化合物的纯化物和粗提物对超氧阴离子自由基的抗氧化活性以半数抑制浓度（IC₅₀）表示分别为0.408,0.985 g·L^-1,对羟自由基的IC₅₀依次为7.856,7.827 g·L^-1。结论：HPD-300型大孔吸附树脂对叠鞘石斛联苄类化合物的纯化效果较好,纯化物的体外抗氧化能力有所提高。     

通俗环毛蚓抗血栓活性蛋白成分的快速富集及活性考察

目的 以地龙品种中的通俗环毛蚓为研究对象,对其蛋白总提物进行纯化富集以获得抗血栓活性蛋白成分（PvQ）,对PvQ进行抗血栓活性研究,以期为地龙的抗血栓物质基础研究提供参考。方法 采用AKTA-Pure型蛋白纯化系统,以体外活性为导向,富集通俗环毛蚓PvQ;采用纤维蛋白平板法、纤维蛋白原-凝血酶时间法（Fibg-TT法）对PvQ的纤溶及抗凝活性进行测定;利用体外血栓溶解试验评价PvQ对体外血栓的溶解能力,同时,考察了不同温度及pH对PvQ活性的影响。结果 成功富集得到通俗环毛蚓PvQ,活性测定表明其具有显著的纤溶及抗凝活性。体外血栓试验结果显示,37 ℃孵育5 h后PvQ可水解超过80%的血栓块。此外,温度和pH对于PvQ活性影响显著,在≥60 ℃或酸性条件（pH<7）下PvQ活性显著降低或失活,而在≤50 ℃和碱性条件下PvQ活性则不受影响或受较少影响。结论 建立了可行的通俗环毛蚓PvQ制备方法,PvQ可同时作用于纤维蛋白和纤维蛋白原,从而发挥双重纤溶作用,表现出良好的纤溶及抗凝活性,为其用于治疗血栓性疾病提供了科学阐释,并可为地龙抗血栓蛋白类产品的开发提供参考。     

神香草与大苞荆芥体外抗氧化活性研究

目的：研究神香草与大苞荆芥乙醇提取物不同极性部位的体外抗氧化活性。方法：两种药材乙醇提取物依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取。采用DPPH·自由基法、邻苯三酚自氧化法、铁离子还原法、羟基自由基法等方法,以维生素C（Vc）为参照,分别研究两种药材不同萃取物的抗氧化活性。并计算各组分的IC₅₀。结果：神香草和大苞荆芥乙醇提取物的不同萃取部分具有不同程度的清除自由基能力和还原能力,其中用DPPH法测得神香草各萃取部分半数抑制率（IC₅₀）分别为：HCA（0.201 7）,HCP（0.930 6）,HCC（0.918 5）,HCE（0.028 2）,HCB（0.097 4）,HCW（0.255 0）g·L^-1;大苞荆芥各萃取部分IC₅₀分别为：HbA（0.147 6）,NbP（0.124 9）,Nb（0.331 1）,NbE（0.047 2）,NbB（0.089 4）,NbW（0.190 8）g·L^-1。结论：神香草与大苞荆芥均具有一定抗氧化活性,为进一步分离抗氧化的成分提供了实验依据。     

胀果甘草多糖GiP-3的结构分析及免疫活性测定

目的:分离纯化胀果甘草多糖,并研究其结构及免疫活性。方法:采用水提醇沉法提取胀果甘草粗多糖,经离子交换柱色谱和凝胶柱色谱分离纯化,高效凝胶渗透色谱(HPGPC)法、红外光谱(IR)法、气相-质谱(GC-MS)法和核磁共振氢谱(~1H-NMR)法分析其结构,噻唑蓝(MTT)法测定其对小鼠淋巴细胞和巨噬细胞增殖的影响。结果:胀果甘草根及根茎经水提醇沉,离子交换柱色谱和凝胶柱色谱分离纯化,得到平均相对分子质量为2.1×10~4Da的均一多糖组分GiP-3。对该多糖的结构和免疫活性的研究结果表明,GiP-3是由阿拉伯糖(Ara),鼠李糖(Rha),半乳糖(Gal)以1∶0.12∶18组成的中性阿拉伯半乳聚糖,其结构的主链由→3)α-Galp(1→残基组成,→5)α-Araf(1→支链和少量→2,4)α-Rhap(1→支链位于α-Galp残基的O-6位上。GiP-3在体外对未经诱导和经刀豆蛋白(ConA)或脂多糖(LPS)诱导的小鼠脾细胞增殖均有促进作用,对RAW 264.7巨噬细胞的增殖也有一定的促进作用,与空白对照组均有显著性差异(P0.05)。结论:GiP-3为均一多糖,具有免疫增强活性。     

白木香叶的化学成分研究(二)

为综合利用白木香叶的丰富资源,阐明其物质基础,课题组再次对其化学成分进行了研究,采用多种色谱技术对其化学成分进行分离纯化,从白木香叶95%,70%乙醇提取物的氯仿和正丁醇萃取部位共分离得到12个化合物.经多种波谱方法鉴定其结构,分别为鸢尾酚酮2-(O-α-L)-吡喃鼠李糖苷(3),4'-羟基-5-甲氧基黄酮-7-O-葡萄糖(6-1)木糖苷(2),7,3',5'-三甲氧基黄酮苷(3),5-甲氧基芹菜素7-(O-β-D)-葡萄糖苷(4),2-苯乙基1-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(5),红景天苷(6),苯甲醇1-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(7),2,6-二甲氧基-4-羟基苯酚-1-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(8),vanilloloside(9),(+)-丁香脂素(10),β-维生素E(11),豆甾-5-烯-3β,7α-二醇(12),化合物 2,3,5~9,11和12 为首次从该属植物中分离得到.另外,对氯仿萃取部位的9个流分进行了4种人体肿瘤细胞毒活性筛选,均未显示明显活性.     

银环蛇蛇毒中具有镇痛活性的多肽成分的生化分离和活性鉴定

目的 研究银环蛇（Bungarus multicinctus）毒的镇痛活性，并对其中的活性单体进行分离、纯化与鉴定。方法 采用热痛、醋酸扭体动物模型检测银环蛇（Bungarus multicinctus）蛇毒毒的镇痛作用，通过分子筛、高效液相（HPLC）等纯化手段从银环蛇毒中分离出镇痛单体，然后通过肽谱鉴定，氨基酸测序及序列比对鉴定其结构特征。结果 本研究发现银环蛇粗毒具有显著的镇热痛活性，与生理盐水组相比，热痛阈提高近2℃。与吗啡相比，其镇痛作用持续时间更长，在给药7 h后仍有显著镇痛效果。通过分子筛及高效液相分离，我们发现其镇痛活性成分主要为小分子多肽，其中活性最强的成分是α-bungarotoxin。α-bungarotoxin有与银环蛇粗毒类似的热镇痛活性，并且能够显著抑制醋酸导致的急性炎性痛。序列鉴定及结构分析表明α-bungarotoxin是一种含有74个氨基酸，5对二硫键的三指肽，能够与乙酰胆碱受体结合。 结论 银环蛇（Bungarus multicinctus）蛇毒具有显著的镇痛作用。其中作用于乙酰胆碱受体的三指肽α-bungarotoxin是其最主要的镇痛活性成分。