RNAi技术的功能及应用

RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是近年来研究生物体基因表达、调控与功能的一项崭新技术,它利用了由小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA)引起的生物细胞内同源基因的特异性沉默(silen-cing)现象,其本质是siRNA与对应的mR-NA特异结合、降解,从而阻止mRNA的翻译。我们讨论了RNAi的发展过程及分子机制和相关的基因,详细地介绍了RNAi的功能及应用,为人们更多地了解并使用RNAi技术起引导作用.     

RNA干扰（RNAi）技术及其在功能基因组学研究中的应用

近年来的研究表明 ,一些小的双链RNA可以高效、特异的阻断体内某些基因致使mRNA降解 ,诱使细胞表现出特定基因缺失的表型 ,称为RNA干扰 (RNAinterference ,RNAi)。由于可以作为代替基因敲除的遗传工具 ,RNAi技术正在改变着功能基因组学 (functionalgenomics)领域的研究步伐。《科学》杂志和美国科学促进会将RNAi技术评选为2 0 0 2年十大重大科学成就之首。1　RNAi及其作用机制1.1　RNAi回顾首次发现双链RNA (doublestrandRNA ,dsR NA)能够导致基因沉默的现象来源于对线虫Caenorhabditiselegans的研究。1995年 ,康乃尔大学的…     

HIF-1α基因miR RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的 构建人HIF-1α的miR RNAi慢病毒载体.方法 利用已经构建成功的针对人HIF-1α基因的miRNA干扰质粒pcDNATM6.2-GW/EmGFP-HIF-1α miR,通过BP/LR反应,将EmGFP-HIF-1α-miR表达框整合重组到产毒质粒pLenti6/V5-DEST中测序鉴定,用PLP1、PLP2和PLP/VSVG质粒共转染包装293FT细胞产毒,并利用GFP蛋白表达水平进行滴度测定.结果 经测序鉴定证实成功构建针对人HIF-1α基因的miRNA慢病毒干扰载体pLenti6/V5-GW/EmGFP-HIF-1α miR.结论 成功构建针对人HIF-1α基因的miRNA慢病毒RNA干扰载体.     

RNA干扰技术的演进及其在基因功能和基因治疗研究中的应用

RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指双链RNA（double strands RNA, dsRNA）引起的mRNA水平互补序列基因表达的关闭,即序列特异性转录后基因沉寂,是生物体进化过程中抵御外来基因和病毒感染的进化保守机制。RNA干扰技术不仅被广泛地运用于基因功能研究,而且在基因治疗中显示出极大潜力。体外RAN干扰技术包括双链RNA的合成、基因导入及干扰作用评价等。本文阐述了近年来这一新兴生物学技术的发展与演进以及在基因功能及基因治疗研究中的应用和前景。     

慢病毒载体介导RNAi的研究进展

一、慢病毒及慢病毒载体 目前RNAi技术作为一种主要的分子生物学研究手段,被广泛应用于特异性抑制基因的表达研究.RNAi的作用机制表明:双链RNA分子首先被细胞内RNA酶Dicer降解成21～23个碱基大小的小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),siRNA结合一个核酶复合物形成RNA诱导沉默复合物(RNA-in-duced silencing complex,RISC),RISC通过碱基配对定位到有同源序列的mRNA上,并在特定位置切割该mRNA,从而抑制该同源基因的表达[1].siRNA被认为是RNAi的主要效应物.     

RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)与非编码RNA(ncRNA)调控的研究进展

 RNA依赖的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase,RdRP)是一类以单链RNA为模板合成互补RNA链的聚合酶。根据其来源可分为病毒RdRP和细胞RdRP,病毒RdRP对病毒基因组复制及病毒引起的宿主免疫反应有重要作用,宿主细胞RdRP主要参与RNA干扰(RNA interference,RNAi)现象。越来越多研究证明RdRP的功能与非编码RNA (non-coding RNA,ncRNA)密不可分,本文对病毒RdRP、细胞RdRP与ncRNA调控之间的关系作了较详细的阐述,同时对丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)诱发的肝癌机制提出新的观点。     

靶向RNAi抑制survivin基因增强胰腺癌对厄洛替尼化疗敏感性的实验研究

目的:胰腺癌的化疗药物耐药是一个亟待解决的问题.存活素(survivin)基因是肿瘤化疗耐药的重要原因.运用RNAi载体抑制survivin的表达对增强胰腺癌对厄洛替尼敏感性的影响.为增强胰腺癌化疗敏感性奠定一定的实验基础.方法:培养胰腺癌细胞PANC-1,构建以U6为启动子的RNAi载体并转染PANC-1,运用FCM检测加入厄洛替尼前后胰腺癌细胞凋亡指数和Hoechest 33258检测凋亡形态,MTT检测转染前后IC50.结果:转染survivin的RNAi载体后48h,流式细胞仪检测的凋亡指数为15.24％±1.35％,与对照组比较差异有显著性(P＜0.05);Hoechst33258染色显示,PANC-1细胞出现核皱缩、浓染和碎裂等典型的凋亡形态,MTT检测转染前及转染后48h厄洛替尼的IC50分别为(1.35±0.05) μg/mL,(0.46±0.08) μg/mL,与对照组比较差异有显著性(P＜0.05).结论:Survivin的RNAi载体,能有效地增强胰腺癌对厄洛替尼的化疗敏感性.     

RNA干扰-dsRNA介导的基因沉默

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是近年来首先在线虫体内发现的一种生物现象,即双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)能抑制序列特异性基因的表达[1].目前,RNAi现象在包括植物、真菌、果蝇以及某些哺乳动物等多种生物体内也已得到证实[2～4],被认为是进化过程中普遍存在的一种保守机制,是生物体防御病毒感染和转座子,保护自身基因组的重要手段[5、6],并因此引起生命科学界极大的关注.     

RNA干扰——一种有力的基因沉默工具

RNA干扰(RNAi)自从1998年被阐明以来,一直是科学研究的一大热点。短短几年,基于此机制建立的技术,在功能基因组学、微生物学、基因表达调控机制研究等领域得到了广泛应用,已经成为一种有力的基因沉默方法。尤其对非编码RNA中的短干扰RNA与微小RNA的研究日益受到重视。本文从RNAi技术的发展、作用机制及应用等方面进行综述。     

基因沉默的维持——长效RNA干扰

自揭示了哺乳动物细胞中的RNA干扰（RNAi）现象以来，对其进行了大量的研究与资金投入，期望将其发展成一种切实可行的治疗手段。毫无疑问，RNAi是最具发展潜力的基因治疗策略。由于许多采用RNAi治疗的疾病需要长期用药，因此，有关RNAi类药物长期应用的安全性问题成为关注重点。     

成纤维生长因子(FGF) 23基因沉默对甲状旁腺激素(PTH)促成骨细胞分化作用的影响

 目的  研究内源性成纤维生长因子23(fibroblast growth factor 23,FGF23)对甲状旁腺激素(parathyroid hormone,PTH)促成骨细胞分化作用的影响。方法  采用酶消化法分离培养新生SD大鼠头盖骨成骨细胞,应用小发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰技术(RNAi)沉默成骨细胞FGF23表达,应用MTT法和PNPP法检测细胞增殖和碱性磷酸酶(alkaline phosphates,ALP)活性,应用real-time RT-PCR法检测其FGF23、ALP和骨钙素(osteocalcin,OCN)等基因mRNA水平,研究PTH对培养成骨细胞和FGF23基因沉默细胞的作用。结果  rhPTH1-34对培养成骨细胞增殖促进作用明显,分化促进作用弱。1×10-10~1×10-8 mol/L rhPTH1-34 作用3天,细胞增殖率增加31.6%~50.5% (P<0.05),而细胞比活性未见明显改变。同时其ALP和OCN转录水平轻度上调,分别较对照组增加35%(P<0.05)和16%(P>0.05)。rhPTH1-34上调成骨细胞FGF23 mRNA水平(4倍),该作用可被针对FGF23特异的shRNA转染所抑制。FGF23基因沉默后PTH促分化作用明显增强,其ALP和OCN mRNA水平分别较对照组增加1.8倍(P<0.05)和5.8倍(P<0.05),显示内源性FGF23对PTH促分化的干扰作用。结论  内源性FGF23可能参与PTH促分化作用的调节,FGF23上调可干扰PTH的促成骨细胞分化作用。     

DPC4RNAi慢病毒载体的构建及其基因沉默效应

目的 :构建DPC4基因RNA干扰慢病毒载体及其基因沉默效应。方法 :针对DPC4基因序列,利用网站设计程序按照RNA干扰序列设计原则,设计多个RNA干扰靶点序列,根据设计经验和设计软件进行评估测定,选择最佳的动力学参数靶点进入后续实验流程;生工生物合成含干扰序列的双链DNA oligo,其两端含酶切位点粘端,直接连入酶切后的RNA干扰载体上。将连接好的产物转入制备好的细菌感受态细胞,对长出的克隆进行酶切鉴定,挑选出阳性克隆测序,进行测序比对后,鉴定阳性克隆即为构建成功的目的基因RNA干扰慢病毒载体。结果:经过Western blot方法检测和测序证实,成功构建了DPC4 shRNA慢病毒载体LVshSmad4,并成功制备了DPC4shRNA慢病毒,3株病毒感染细胞后均具有有效的基因沉默,其中SH1序列最为显著。结论 :DPC4基因RNA干扰靶点的成功设计和RNA干扰靶点慢病毒载体制备,而且具有显著的基因沉默效果。     

RNAi沉默c-erb、B-2、c-raf-1表达对人舌鳞癌Tca8113细胞的干预作用

目的:探讨应用RNA干扰技术沉默c-erbB-2、c-raf-1基因表达,研究其对人舌鳞癌Tca8113细胞增殖的抑制作用及其分子机制.方法:实验分成3组:空白对照组、正常对照组、c-erbB-2、c-raf-1dsRNA联合干扰组.脂质体转染后不同时间分别进行MTT试验、电镜检测、RT-PCR,以观察不同条件处理后各组细胞的增殖、凋亡、细胞周期、mRNA及蛋白质表达有无差别.结果:c-erbB-2、c-raf-1dsRNA联合干扰组,转染72h的OD值为0.073(P＜0.005),增殖抑制率达到了94.5%,凋亡率为76.5%(P＜0.01),明显地下调c-erbB-2与c-raf-1基因mRNA及其蛋白质的表达水平.结论:在舌癌Tca8113细胞株增殖的抑制作用研究中,c-erbB-2、c-raf-1dsRNA联合干扰具有显著沉默c-erbB-2、c-raf-1基因表达.     

DPC4 RNAi慢病毒载体的构建及其基因沉默效应

目的：构建DPC4基因tLNA干扰慢病毒载体及其基因沉默效应。方法：针对DPC4基因序列,利用网站设计程序按照RNA干扰序列设计原则,设计多个RNA干扰靶点序列,根据设计经验和设计软件进行评估测定,选择最佳的动力学参数靶点进入后续实验流程;生工生物合成含干扰序列的双链DNA oligo,其两端含酶切位点粘端．直接连入酶切后的IKNA干扰载体上。将连接好的产物转入制备好的细菌感受态细胞,对长出的克隆进行酶切鉴定,挑选出阳性克隆测序,进行测序比对后,鉴定阳性克隆即为构建成功的目的基因1KNA干扰慢病毒载体。结果：经过Western blot方法检测和测序证实,成功构建了DPC4shRNA慢病毒栽体LVshSmad4,并成功制备了DPC4 shRNA慢病毒,3株病毒感染细胞后均具有有效的基因沉默,其中SHI序列最为显著。结论：DPC4基因RNA干扰靶点的成功设计和RNA干扰靶点慢病毒载体制备,而且具有显著的基因沉默效果。     

RNAi 介导 ObR基因沉默对人乳头状甲状腺癌 K1细胞增殖与侵袭能力的影响

目的：探讨用RNAi介导瘦素受体基因（ObR）沉默人乳头状甲状腺癌K1细胞（K1细胞）增殖与侵袭能力的影响。方法使用 siRNA 干扰技术瞬时转染构建 siRNA‐ObR。瞬时转染后,Real‐time PCR和Western blotting在mRNA水平和蛋白水平检测siRNA‐ObR是否有效抑制K1细胞内靶基因的表达;MTT 实验研究ObR沉默后K1细胞的增殖能力;Transwell实验检测ObR沉默后K1细胞的侵袭能力。结果 Real‐time PCR实验结果显示,ObR基因沉默后K1细胞ObR mRNA表达显著降低;Western blotting实验结果显示, ObR基因沉默后K1细胞ObR蛋白表达显著降低;M T T实验结果显示ObR对K1细胞的增殖没有意义;T ran‐swell实验结果显示ObR沉默后K1细胞侵袭能力显著下降。结论 ObR基因沉默能有效抑制K1细胞ObR基因的表达,降低K1细胞的侵袭能力。     

RNAi沉默Polo-like kinase-1基因表达对大肠癌细胞端粒酶活性的影响

 目的 探讨polo-like kinase-1（PLK1）基因对大肠癌细胞增殖和端粒酶活性的影响。 方法根据PLK1基因序列特点,设计并用化学方法合成小干扰核糖核酸分子（small interfering RNA,siRNA）,转染人大肠癌SW480细胞后,分别采用实时定量PCR和Western blot检测PLK1基因mRNA和蛋白表达水平。分别采用MTT法和TRAP-ELISA方法检测PLK1基因转染对大肠癌细胞增殖和端粒酶活性的影响。 结果 所设计的5个siRNA均能明显抑制大肠癌SW480细胞PLK1 mRNA水平,以P4效果最好。以P4转染处理大肠癌细胞后,PLK1 mRNA水平和蛋白水平明显下调,且呈浓度和时间依赖性。MTT和TRAP-ELISA方法检测发现,P4siRNA转染组细胞增殖和端粒酶活性明显受到抑制,且呈浓度和时间依赖性（P＜0.05,P＜0.05）。 结论 PLK1基因对大肠癌细胞增殖具有重要的调控作用,以PLK1 siRNA转染处理大肠癌细胞,可明显抑制大肠癌细胞的恶性增殖,其机制可能与抑制端粒酶活性有关。     

RNAi沉默PRL-1基因对肺癌细胞侵袭能力的影响

目的:探讨RNA干扰(RNAinterference,RNAi)沉默促肝细胞再生磷酸酶1(phosphatase of regenerating liv-er cell-1,PRL-1)基因对肺癌细胞侵袭力的影响。方法:应用PRL-1基因小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)转染处理肺癌A549细胞后,分别采用实时定量RT-PCR和蛋白质印迹检测PRL-1基因mRNA和蛋白水平,分别采用软琼脂集落培养试验和Boyden小室模型试验检测癌细胞的锚着不依赖性增殖和侵袭能力。结果:与对照组比较,siR-NA转染组PRL-1 mRNA和蛋白水平明显下调,且呈浓度和时间依赖性(P<0.05,P<0.05)。体外试验发现,PRL-1siRNA可有效抑制肺癌细胞集落生长和侵袭能力,且与浓度相关(P<0.05,P<0.05)。结论:PRL-1基因在肺癌侵袭中起着重要的作用,采用PRL-1 siRNA转染可抑制肺癌细胞侵袭。     

RNA干扰-转录后水平的基因沉默

随着人类基因组计划的初步完成,生命科学也随之进入后基因组计划的时代.在各种研究基因功能的方法中,RNA水平使目的基因沉默无疑是目前研究的新点和热点,特别是双链RNA(dsRNA)介导的转录后水平的基因沉默(PTGS),更是快速关闭基因的途径,目前在植物、线虫、果蝇和小鼠早期胚胎中均有发现和证实.这一现象的发现和应用将有助于基因功能及其在信号传导、病毒抵御机制等方面的研究,并有可能开创基因治疗的新模式.