RNA干扰抑制树突状细胞CD80和CD86基因表达研究

目的探讨体外合成的小干扰RNA（siRNA）对人树突状细胞（DC）共刺激分子CD80和CD86基因表达的影响。方法设计并合成了3条siRNA（siRNA1、siRNA2和siRNAc）,在脂质体的介导下转染树突状细胞,于转染后24、48、72h收集细胞,用半定量RT-PCR检测CD80和CD86 mRNA的变化,用蛋白印迹检测CD80、CD86蛋白的表达。结果转染24、48、72h后,DC CD80 mRNA均有明显减少（P〈0.01）,抑制率分别为（50.0±3.63）%、（66.8±4.12）%和（76.6±4.87）%;CD86 mRNA均有显著降低（P〈0.01）,抑制率分别为（53.0±3.70）%（、60.5±3.92）%和（73.4±4.46）%,而单纯脂质转染和siRNAc转染对CD80、CD86 mRNA表达均无影响（P〉0.05）。Western Blot结果显示转染48、72h后,siRNA1对CD80蛋白表达的抑制率为（67.3±4.80）%和（80.9±5.23）%;siRNA2后对CD86蛋白表达的抑制率为（60.7±4.15）%和（74.7±4.63）%。结论 siRNA可特异抑制树突细胞B7基因的转录和表达,为进一步研究siRNA诱导移植免疫耐受提供了理论和实验基础,为诱导器官移植免疫耐受提供了新思路和途径。     

MyD88 RNA干扰抑制小鼠骨髓树突状细胞成熟的实验研究

针对小鼠骨髓树突状细胞（DC）髓性分化因子88（MyD88），采用RNA干扰技术抑制其合成，观察脂多糖（LPS）刺激后DC生物学活性的变化，探讨获得耐受性DC的方法，为DC的临床应用提供新思路和理论依据。培养小鼠骨髓源性DC，分为对照组、LPS组及RNA干扰组，对照组不予任何处理，LPS组加入终浓度为1μg／ml的LPS，RNA干扰组于加入MyD88 siRNA 12h后给予1μg／ml LPS刺激，继续培养3d。     

B7特异性siRNA对树突状细胞功能的影响

目的探讨体外合成的B7特异性小干扰RNA（siRNA）对树突状细胞（DC）功能的影响。方法设计并合成B7特异性siRNA,在脂质体的介导下转染树突状细胞,转染后72h收集细胞,用蛋白印迹法检测B7-1、B7-2蛋白的表达,用ELISPOT检测DC与淋巴细胞共培养后T细胞分泌IFN-γ,用MTT法检测混合淋巴细胞增殖反应和CTL特异性杀伤率。结果Western Blot结果显示转染72h后,siRNA1对B7-1蛋白表达的抑制率为（80．9±5．23）％;siRNA2对B7-2蛋白表达的抑制率为（74．7±4．63）％。经转染B7-1、B7-2分子特异性siRNA的DC激活后,T淋巴细胞分泌IFN-γ分别为（84．6±23．1）10^3／L和（76．7±19．7）10．3U／L明显低于对照组（204．5±46．2）10^3U／L;各组DC刺激淋巴细胞增殖指数（PI）分别为1．73±0．32和1．53士0．25,也低于对照组4．23±0．74。CTL杀伤实验结果表明：对照组的特异性杀伤率为（76．4±7．6）％,siRNA1和siRNA2组的特异性杀伤率分别为（14．4±3。6）％和（18．6士4．7）％,低于对照组。结论B7特异性siRNA可明显抑制树突细胞B7基因的表达,并可降低DC激活T淋巴细胞增殖和CTL的细胞毒性,为进一步研究siRNA诱导免疫耐受和治疗自身免疫性疾病提供了新思路和方法。     

隐孢子虫对小鼠树突状细胞功能的影响

目的探索隐孢子虫对小鼠树突状细胞功能的影响。方法采用磁珠分离小鼠的树突状细胞，将树突状细胞与活体隐孢子虫一起培养，用流式细胞仪观察树突状细胞表面标记的变化，并进一步观察树突状细胞产生各种细胞因子的情况。结果活体隐孢子虫能直接感染小鼠树突状细胞，并使其细胞表面高表达CD40、CD80、CD86，同时产生大量的IL-6、IL-12及TNF-α等细胞因子。结论树突状细胞参与了隐孢子虫宿主免疫过程，并在宿主对虫体的免疫反应中起重要作用。     

氨茶碱对哮喘小鼠气道树突状细胞作用的研究

目的 研究氨茶碱对哮喘小鼠气道树突状细胞(DC)的密度和分布的影响。方法50只BALB/c小鼠随机分为正常对照组、哮喘对照组、低浓度氨茶碱组、中浓度氨茶碱组和高浓度氨茶碱组,每组10只。以卵蛋白腹腔注射与雾化吸入诱发BALB/c小鼠哮喘发作,末次激发24h后,采用免疫组织化学染色技术(DC标记物为NLDC-145)及计算机图像分析方法,观察哮喘小鼠在腹腔注射不同剂量氨茶碱1周后气道树突状细胞的分布和密度的改变。结果 正常小鼠NLDC-145~+树突状细胞主要分布于气管、支气管、肺泡、脏层胸膜及气管周围相关淋巴组织、血管周围,形成防御性DC网络。哮喘对照组小鼠气道NLDC-145~+DC密度为(1720±130)个/mm~2,显著高于正常对照组(600±200)个/mm~2(P<0.02);经氨茶碱治疗后,低浓度组气道DC密度为(824±35)个/mm~2,较哮喘对照组明显下降(P<0.01);中浓度组为(1582±150)个/mm~2,高浓度组为(1684±167)个/mm~2,与哮喘对照组比较无显著差异(P>0.05);哮喘对照组及低浓度氨茶碱组气道DC的分布与正常对照组相比无明显变化。结论 树突状细胞在哮喘小鼠气道中明显增多,低浓度氨茶碱可减少气道DC密度,但不影响其分布。     

小分子干扰RNA抑制大鼠肾细胞Ppif基因的表达

目的 研究siRNA 对大鼠肾细胞(NRK)Ppif 基因的抑制作用.方法 根据大鼠Ppif 基因序列设计并化学合成3对siRNA 及1对阴性对照siRNA,并在5′端标记FAM 羧基荧光素,以Lipofectamine~(TM)2000 转染入大鼠肾细胞,用RT-PCR 和Western blot 分别检测Ppif 基因和蛋白表达量的改变,验证所设计的siRNA 的抑制效应.结果以Lipofectamine~(TM)2000转染所设计的siRNA 进入NRK 细胞,转染效率＞90%.起始于405、556位点的siRNA 在基因水平对Ppif 无明显抑制效应(P＞0.05),起始于198位点的siRNA 在基因和蛋白水平均有明显的抑制效应,基因水平下降75.25%(P＜0.05);蛋白水平下降72.13 %(P＜0.05).结论 起始于198位点的siRNA 对大鼠肾细胞的Ppif 基因有明显的抑制效应.     

RNA 干扰 DC-SIGN 表达对树突状细胞成熟及功能的影响

目的 研究慢病毒介导RNA干扰树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3结合非整合素因子(DC-specific ICAM-3 grabbing nonintegrin,DC-SIGN)分子表达及干扰后对树突状细胞(dendritic cells,DCs)成熟度及功能的影响. 方法 分离健康人外周血单核细胞,用GM-CSF和IL-4刺激诱导DCs.培养第4天分3组:RNA干扰组、阴性对照组和空白对照组,按实验设计加入病毒共孵育12 h后换液,继续培养60 h后用荧光显微镜观察转染效率及荧光强度,培养第6天加LPS刺激成熟.第7天收集细胞用RT-PCR检测DC-SIGN mRNA水平,Western blot检测DCs总DC-SIGN蛋白表达水平,流式细胞仪检测DCs表面DC-SIGN水平,ELISA检测DCs培养上清液中IL-12、IL-10水平,混合淋巴细胞反应检测DCs对CD4+ T淋巴细胞刺激增殖能力的影响. 结果①荧光显微镜显示感染复数(MOI)为20时,DCs感染病毒的效率达85%.②RT-PCR证实RNA干扰后DC-SIGN mRNA表达水平(0.252 5±0.139 6)显著低于另2组(0.572 2±0.190 9、0.548 7±0.119 3),差异有统计学意义(F=8.142,P<0.05).③Western blot检测干扰组DCs内总DC-SIGN 水平(0.323 7±0.057 0)显著低于另2组(0.590±0.014、0.578 ±0.023),差异有统计学意义(F=51.376,P<0.05).④流式细胞仪检测干扰组DCs表面表达DC-SIGN水平[(43.10±10.12)%]显著低于另2组[(73.05±8.11)%、(74.49±5.56)%],差异有统计学意义(F=14.19,P<0.05).⑤各组间成熟标志物HLA-DR及CD86差异无统计学意义(P>0.05).⑥ELISA结果显示各组DCs培养上清液中IL-10、IL-12水平差异无统计学意义(P>0.05).⑦混合淋巴细胞反应结果显示各组DCs诱导CD4+T淋巴细胞增殖能力差异无统计学意义(P>0.05). 结论 慢病毒介导的RNA干扰能有效抑制DCs表面DC-SIGN分子表达,抑制DC-SIGN表达对DCs成熟度及DCs功能无影响.     

耐受性树突状细胞对哮喘小鼠气道变应性炎症反应的抑制作用

目的: 用卵白蛋白(OVA)刺激的未成熟树突状细胞(immature dendritic cell, imDC)免疫小鼠,观察其对小鼠OVA激发的气道过敏性炎症反应的抑制作用,探讨耐受性树突状细胞疫苗诱导免疫耐受的可能机制,为临床防治哮喘提供新的思路.方法: 制备BALB/c小鼠髓性imDC.其余BALB/c小鼠分4组,10只/组:其中两组于第-7天分别注射无菌PBS(PBS组)、OVA刺激的imDC(imDC组),第三组于第13～20天注射地塞米松(地塞米松组),第四组不作任何处理(健康对照组);除健康对照组外,其余各组诱导哮喘反应:第0天和第9天分别注射OVA致敏,14～20天每日予OVA气雾攻击.第21天每组处理5只小鼠,检测肺部炎症细胞浸润及嗜酸性粒细胞比例、气道黏液分泌、脾细胞Th1/Th2型细胞因子表达及脾细胞中CD4 CD25 细胞比例;第49天,处理剩余动物,观察哮喘预后.结果: mDC注射组肺部炎症浸润较轻,脾细胞表达白细胞介素(IL)-13、4降低而γ-干扰素(IFN-γ)无显著影响,脾细胞中CD4 CD25 细胞比例较高,气道黏液分泌则少于PBS组,且预后良好. 结论: 过敏原特异性imDC疫苗注射可在一定程度上缓解哮喘小鼠气道的变应性炎症反应.     

体外RNA干扰抑制ACP1对骨肉瘤细胞侵袭的影响

目的探讨ACP1蛋白对人骨肉瘤细胞侵袭能力的影响。方法以骨肉瘤细胞MG-63为研究对象,针对ACP1基因设计小干扰RNA（si RNA）,构建其短发夹状RNA（short hairpin RNA,shRNA）真核表达载体并转染入细胞,在mRNA和蛋白水平检测ACP1表达,通过黏附实验、细胞划痕、transwell检测MG-63体外侵袭能力。结果成功构建si RNA表达载体Pgenesil-1/ACP1-shRNA。shRNA可使ACP1在基因和蛋白表达水平显著降低,骨肉瘤细胞的迁移能力明显下降,黏附能力由（96.4±8.8）%到（43.4±6.0）%,P〈0.01;穿过人工基底膜的细胞数量明显减少,由56.5±4.8减少到36.3±6.1,P〈0.05。结论ACP1在骨肉瘤的侵袭过程中发挥着重要作用,为肿瘤的生物学治疗提供了新思路。     

不同浓度三氧化二砷对哮喘小鼠气道树突状细胞的作用

目的 :研究 3种不同浓度三氧化二砷 (arsenictrioxide,As2 O3)对哮喘小鼠气道树突状细胞 (dendriticcells ,DCs)分布和募集的作用。方法 :BALB c小鼠 5 0只随机分为5组 ,即对照组、哮喘组、低剂量 (1mg kg)As2 O3组、中剂量 (5mg kg)As2 O3组和高剂量 (10mg kg)As2 O3组。采用免疫组织化学染色、计算机图像分析和扫描电镜技术分别检测气道DCs。结果 :对照组小鼠整个肺组织构成了一个NLDC 14 5 +DCs网络 ,NLDC 14 5 + DCs密度从大气道到小气道分别为(5 0 0± 5 0 )个 mm2 到 (6 0± 10 )个 mm2 上皮面积 (P <0 0 5 ) ;哮喘组小鼠肺内NLDC 14 5 + DCs密度较对照组显著增加 (P <0 .0 1) ,但不影响其肺内分布 ;哮喘小鼠经As2 O3处理后 ,肺内NLDC 14 5 + DCs密度显著下降 (P <0 0 1) ,但不影响其肺内分布 ,且三种不同浓度砷剂处理组间无显著性差异 (P >0 0 5 )。结论 :下调肺内DCs密度而不影响其肺内分布 ,可能是As2 O3治疗哮喘的一个重要机制 ;低剂量As2 O3治疗哮喘具有潜在的应用前景。     

氯胺酮对树突细胞体外分化和成熟的影响

【目的】 观察氯胺酮对树突细胞体外分化和成熟的影响?【方法】 取6 ~ 8周C57BL/6 野生型老鼠(雌雄不限)的骨髓细胞, 在FMS样酪氨酸激酶3(Flt3)配基的作用下诱导分化为树突细胞各种亚型?在培养体系中加入50?100?200 μmol/L的氯胺酮,观察氯胺酮对树突细胞亚型分化比例的影响?同时为了观察氯胺酮对树突细胞成熟的影响, 利用脂多糖刺激树突细胞成熟并检测氯胺酮对树突细胞表面成熟标记分子表达的影响?【结果】 200 μmol/L氯胺酮不明显影响pDc和cDc 的分化比例,在100和200 μmol/L 可以使eCD8+cDc亚群分别降低(20 ± 2.9)%和(25 ± 4.1)%(P < 0.05),而eCD8-cDc亚群则分别升高(25 ± 4.3)%及(39 ± 5.7)%(P < 0.05)?200 μmol/L氯胺酮不影响脂多糖介导的树突细胞成熟分子的表达?【结论】 高浓度的氯胺酮可能通过影响树突细胞亚群分化而影响机体的免疫,但不影响树突细胞体外成熟标志的表达?     

脾酪氨酸激酶在实体肿瘤中的研究进展

脾酪氨酸激酶(SYK)一度被认为是造血细胞特有的信号分子,在淋巴细胞成熟和免疫细胞激活中发挥重要作用,并在很多恶性血液病中被标识为致癌驱动因子。目前认为SYK在多种实体肿瘤中也发挥重要作用,尤其在肿瘤的增生及浸润转移方面有重要影响,越来越多关于SYK在实体肿瘤中的研究陆续展开。SYK在不同肿瘤中发挥着不同甚至相反的作用,在一些肿瘤中是候选抑癌基因,在另外一些肿瘤中发挥癌基因的作用。对SYK基因深入研究,有望为发现肿瘤防治的新靶点提供线索。     

射干麻黄汤加味对哮喘小鼠气道炎症及树突细胞的影响

目的：探讨射干麻黄汤加味对慢性哮喘小鼠气道炎症及树突状细胞的影响。方法：健康清洁级雌性BALB／c小鼠50只,每组10只,随机分为A组：正常对照组;B组：哮喘模型组;C组：地塞米松组;D组：射干麻黄汤组;E组：射干麻黄汤加味组。建立慢性哮喘小鼠模型后,分别予以相应药物干预,取材后采用HE染色、免疫组化检测小鼠气道炎症情况及树突状细胞数量。结果：与正常对照组相比哮喘小鼠的BALF中白细胞总数、EOS、淋巴细胞、肺组织DC数量均明显增加（P〈0．05）;经给予地塞米松、中药处理后上述指标均明显减少,哮喘发作程度减轻（P〈0．05）,射干麻黄汤加味优于射干麻黄汤。结论：射干麻黄汤加味可抑制BALB／c哮喘小鼠哮喘的发生,其机制有可能是通过降低气道炎症及DC的数量而实现的。     

粉尘螨和细菌脂多糖诱导哮喘儿童树突状细胞成熟分化的特点

目的 探讨户尘螨过敏性哮喘儿童,其单核细胞来源的树突状细胞（dendritic cells,DC）经粉尘螨（dermatophagoides farinae,Df）和细菌脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）刺激后的成熟分化特点.方法 户尘螨过敏性哮喘和正常儿童的外周血单个核细胞用白细胞介素4（rhIL-4）和粒-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）诱导分化成未成熟DC,然后用Df和LPS刺激DC成熟;用流式细胞仪检测DC的表面分子CD1a、CD83、HLA-DR,以判断Df和LPS对哮喘和正常儿童DC成熟分化的影响.结果 哮喘儿童单核细胞经IL-4和GM-CSF诱导后,未成熟DC（HLADR＋-CD1a＋）和自发成熟DC（HLADR＋-CD83＋）的比例均明显高于正常儿童（P=0.022和P=0.037）.但经Df刺激后,哮喘儿童成熟DC的比例显著低于LPS刺激后（P=0.009）,未成熟DC的比例则高于LPS刺激后（P=0.03）,也高于正常儿童Df刺激后的未成熟DC比例（P＜0.001）.结论 哮喘患儿DC在Df刺激下,其成熟和分化过程中存在异常,成熟过程延迟,但其在哮喘细胞免疫调节异常中的作用需要进一步研究.     

RSV诱导哮喘小鼠树突细胞自噬机制及五虎汤的干预作用

目的 研究PI3K/Akt/mTOR信号通路对呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)诱导哮喘小鼠树突细胞(den-dritic cells,DC)自噬的调控机制及五虎汤的干预作用.方法 用RSV滴鼻联合雾化鸡卵清蛋白(ovalbumin,OVA)激发的方法制备哮喘小鼠模型,造模...     

沙培林诱导脐血树突状细胞的成熟

目的 改进体外诱导脐血树突状细胞（DC）成熟的方案，为后期制备临床使用的抗肿瘤DC疫苗提供新的技术路线。方法 分离脐血单个核细胞（CBMC）并在含10％同源脐血浆、重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM—CSF）和重组人白细胞介素-4（rhIL-4）的培养体系中诱导培养，部分加入肿瘤冻融抗原和／或沙培林（OK-432）冲击，光镜和电镜下观察细胞形态，流式细胞仪检测培养前后各组细胞表面抗原CD1a和CD83的表达情况。结果培养过程中，细胞形态发生明显变化，呈现典型的DC形态。收集第9天各组DC，细胞表面均高度表达CD1a和CD83，与贴壁分离的CBMC比较有统计学意义，肿瘤冻融抗原冲击后，DC表面CD1a和CD83的表达上调，沙培林进一步刺激后，CD1a和CD83表达率显著升高。结论 诱导脐带血来源的前体细胞分化为未成熟DC的途径相对简便；沙培林能促进肿瘤冻融抗原冲击后的脐血DC进一步成熟。     

HSV-1特异转移因子对小鼠脾细胞~3H-Leu参入的影响

用HSV-1特异的小鼠脾TF(TFHSV-1)进行小鼠脾细胞[~3H] Leu参入试验,观察到TFHSV-1明显增加HSV-1特异抗原介导的小鼠脾细胞[~3H] Leu参入。如加热处理TFHSV-1,其影响[~3H]-Leu参入的抗原特异活性丧失。经紫外光吸收值测定和游离氨基酸分析,发现热处理TFHSV-1的紫外光吸收值增高,TFHSV-1中的游离氨基酸含量增加。这种变化与其特异活性的丧失可能有密切关系。结果表明,TFHSV-1具有增加体外小鼠脾细胞蛋白质合成的抗原特异活性的特征。其特异性成分可能是某种肽类。     

日本血吸虫感染小鼠脾细胞体外IL-2转录水平的实验观察

应用RT PCR方法对日本血吸虫感染小鼠脾细胞体外在SEA与ConA诱导下产生的IL 2从mRNA转录水平进行研究 ,以探讨该细胞因子mRNA转录水平的动态变化及其在肉芽肿形成与调节过程中的作用。结果显示 ,未感染和感染 3周小鼠脾细胞均无IL 2表达 ,感染后第 5周的小鼠脾细胞出现IL 2特异性条带 ,感染后第 8周IL 2表达明显增强 ,感染后第 1 0、1 2周无论SEA或ConA都不能诱导IL 2mRNA的转录。表明IL 2表达的动态变化与肉芽肿的形成、发展及调节相平行 ,提示IL 2可能在肉芽肿形成和调节过程中起重要作用。