RT—PCR检测呼吸道合胞病毒的研究

呼吸道合胞病毒是婴幼儿支气管炎和肺炎最常见的病原之一。应用逆转录－聚合酶链式反应对检测ＲＳＶ的方法进行了研究。采用的引物特异性扩增ＲＳＶ Ｆ糖蛋白Ｆ１亚基的一个片段，计算机检索与其它常见呼吸道病毒无同源性。敏感性测定显示该方法ＲＳＶ最低量为１０ＴＣＩＤ５０Ｓ。这些结果表明ＲＴ－ＰＣＲ可作为快速诊断ＲＳ的有效方法，在临床上推广应用。     

逆转录套式聚合酶链反应检测呼吸道合胞病毒

建立一种敏感、特异和快速诊断人呼吸道合胞病毒感染的方法。选择ＲＳＶ基因组中高度保守的Ｆ基因作为扩增靶序列，独立设计合成了两引物，建立了一个完整的逆转录套式聚合酶链反应检测ＲＳＶＲＮＡ的方法。对引物进行特异性实验，证明其具有高度特异性。     

常见腹泻病毒多重荧光逆转录聚合酶链反应检测方法的建立及临床应用

目的建立能同时检测星状病毒、轮状病毒、肠道腺病毒和诺如病毒的多重荧光逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法。方法根据上述4种病毒基因组保守序列设计引物和探针,建立并分析多重荧光RT-PCR的特异性、敏感性、灵敏度;以所建立方法对256例病毒性腹泻患者粪便标本进行检测,同时以基因测序进行验证。结果所建立的腹泻病毒多重荧光RT-PCR检测方法对具有星状病毒、轮状病毒、肠道腺病毒、诺如病毒特异性,灵敏度可达500 copy/mL。256例粪便标本中,星状病毒、轮状病毒、肠道腺病毒和诺如病毒的检出率分别为3.13%、42.97%、9.38%和10.16%,与基因测序比对结果相符。结论成功构建可用于常见腹泻病毒检测的多重荧光RT-PCR检测方法,该法具有快速、灵敏、特异等优点,可用于临床病原诊断。     

呼吸道病毒定植与哮喘病严重度的关系

目的 比较致死样哮喘（NFA）缓解期患者与健康人中常见的呼吸道病毒的分布差异。方法 研究对象包括NFA缓解期患者12例．轻症哮喘患者2I例及无哮喘病史的健康人52名。诱导痰用于RNA及DNA的提取．PCR及RT-PCR方法用于7种常见的呼吸道病毒，微小病毒（HRV），流感病毒A、B，副流感病毒1、3，呼吸道合胞病毒及腺病毒的检测。结果 NFA缓解期患者的病毒检出率为42％（5／12）．而轻症患者为24％（5／2I），健康人为10％（5／52）。NFA患者的病毒检出率显著高于健康人。微小病毒、流感病毒A、B可存在于NFA缓解期患者的下呼吸道内。而健康人呼吸道内以微小病毒为主。哮喘患者气道内存在2种以上病毒定植的情况。结论 呼吸道病毒可定植于哮喘患者及健康人的气道内而不诱发呼吸道症状，呼吸道病毒定植可能与哮喘的严重度有关。     

实时逆转录聚合酶链反应快速鉴别呼吸道合胞病毒亚型

呼吸道合胞病毒（RSV）是婴幼儿时期急性下呼吸道感染最主要的病原体。近年发展起来的实时聚合酶链反应技术具有灵敏度高、特异性好、方法简便等特点，广泛应用于病原体的检测。为此，我们设计并建立了用SYBR Green I实时逆转录PCR结合融解曲线分析快速鉴别呼吸道合胞病毒A、B亚型的方法。     

呼吸道合胞病毒A与B亚型多重荧光PCR检测方法的建立及应用

目的建立一种新的呼吸道合胞病毒(RSV)分型检测方法,用于快速检测和监测。方法针对RSV G基因设计引物、探针,并引入人β-actin基因(ACTB)作为内参质控,建立RSV-A、RSV-B多重荧光PCR检测方法。使用多种常用呼吸道病原体及体外转录RNA产物考核其特异性和灵敏度。并对2015年1月至12月广州两家医院的儿童急性呼吸道感染患者进行检测。结果所建立的多重检测方法未见非特异性反应。RSV-A、RSV-B和ACTB分别可检测低至4、8和12 copies/μL的RNA模板,且分别在10~1×10~(10)copies/μL、100~1×10~(10)copies/μL和100~1×10~(10)copies/μL时具备良好的线性关系,线性相关系数r2均大于0.99。儿童急性呼吸道感染患者监测中,RSV-A为期间优势亚型。结论本研究所建立的RSV-A、RSV-B多重荧光PCR检测方法,具有较好的特异性、灵敏度、可操作性,可用于相关研究。     

福州地区急性呼吸道感染患儿呼吸道合胞病毒检测及亚型分析

目的:分析福州地区2006-2007年冬春季我院收治急性呼吸道感染患儿呼吸道合胞病毒(RSV)及其亚型流行情况。方法:采用RT-PCR方法检测176例急性呼吸道感染患儿的鼻咽拭子中RSV并进行亚型鉴定分析。结果:(1)在176例标本中,RSV阳性28例(15.9%)。其中急性下呼吸道感染阳性率为38%,显著高于急性上呼吸道感染的4%(!2=33.15,P<0.05)。(2)28例RSV阳性标本中,A亚型23例(82%),B亚型4例(14%),不明分型者1例(4%);上、下呼吸道感染组患儿间RSV亚型分布差异无显著性(P>0.05),都以A型为主。(3)RSV阳性患儿的年龄主要以3岁以下为主。结论:RSV是婴幼儿急性下呼吸道感染的重要病原体;福州地区2006-2007年冬春季RSV两种亚型同时流行,以A亚型为主。     

多重逆转录聚合酶链反应同步检测A组轮状病毒G基因型的研究

目的　为了检测A组轮状病毒VP7的基因型 ,建立一步多重逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)同步检测A组轮状病毒G基因型技术。方法　在参照文献并分析A组轮状病毒VP7基因的基础上 ,选取了一个共用的下游引物RVG9和 6个A组轮状病毒G基因型G1、G2、G3、G4、G8和G9的特异性上游引物 ,利用多重RT PCR技术对标准株和样品进行检测。结果　进行一轮RT PCR ,即可至少同时检出 5种不同标准株混合物中的各个基因型。对纯化的A组轮状病毒标准株RNAO2 6 5进行系列稀释后 ,其检测灵敏度可达 1PFU。经对A组轮状病毒阳性的 6 0份样本进行检测 ,其中G3有 5 1例、G2有 4例 ,G1与G3混合感染 3例 ,另外尚有 2例不能分型。　结论　本研究建立的一步多重RT PCR技术对A组轮状病毒基因型研究将为临床诊断和实验研究提供一种快速、灵敏和特异的检测手段。     

HCV RNA基因分型多色荧光PCR筛查和确认方法的建立

目的建立多色荧光丙型肝炎基因分型检测方法。方法针对HCV5＇NCR区特异性基因设计一对通用引物和Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ型特异性探针,Ⅰ型和Ⅲ型探针标记FAM荧光染料,Ⅱ/Ⅳ型标记VIC荧光染料,分别建立Ⅰ/Ⅱ型和Ⅲ/Ⅳ型两管双色荧光PCR扩增系统。分别采用测序和本研究方法对97份丙型肝炎阳性血清进行分型,比较两种方法分型结果的一致性,并对双色荧光法检测的2889例HCV分型结果进行分析。结果在97份丙型肝炎阳性血清中,双色荧光法分出Ⅰ型65例（67.0%）,Ⅱ型25例（25.8%）,Ⅲ型2例（2.1%）,Ⅰ/Ⅱ混合型3例（3.1%）,有2例HCVRNA定量为（1～3）×103IU/ml弱阳性标本未分出型;测序法分出Ⅰ型61例（62.9%）,Ⅱ型24例（24.7%）,Ⅲ型2例（2.1%）,Ⅰ/Ⅱ混合型2例（2.1%）,有8例HCVRNA定量结果为（1～5）×103IU/ml的阳性标本测序法未分出型,有1例Ⅰ/Ⅱ混合型标本测序无法判断,而荧光法分型明确。我院采用本研究建立的方法检测2889例临床丙型肝炎标本,2268份分出基因型,其中Ⅰ型1545例（68.1%）,Ⅱ型702例（31.0%）,Ⅰ/Ⅱ混合型18例（0.8%）,Ⅲ型3例（0.1%）,高HCV载量血清全部涵盖在Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ型中,未发现Ⅳ型和其他型的病例。结论本研究建立的双色荧光HCV基因分型的方法具有良好的敏感性、特异性、可重复性且省时省力,由于近99%的HCV阳性血清为Ⅰ/Ⅱ型,所以临床可选择Ⅰ/Ⅱ型试剂进行常规检测,对高病毒载量而非Ⅰ/Ⅱ型的标本可采用Ⅲ/Ⅳ型试剂进一步分型明确。     

TaqMan实时定量RT—PCR与常规RT—PCR检测登革病毒的比较

目的:比较TaqMan实时定量逆转录-聚合酶链反应(real-timeRT-PCR)法与常规逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测登革病毒的敏感性、特异性和时效性。方法:建立TaqMan实时定量RT-PCR方法和常规RT-PCR方法,分别对登革病毒、乙型脑炎病毒及西尼罗病毒进行检测,并比较两法的特异性、敏感性和时效性。结果:两种方法都能检测出登革病毒,而对乙型脑炎病毒和西尼罗病毒的检测呈阴性;常规RT-PCR的敏感性为0.1TCID50/mL,TaqMan实时定量RT-PCR的敏感性提高了100倍,达到了0.001TCID50/mL,且至少节约了2h。结论:与常规RT-PCR比较,TaqMan实时定量RT-PCR更适用于登革病毒的实验室快速诊断。     

人偏肺病毒基因型双重逆转录PCR检测方法的建立

目的 建立一种鉴别不同基因型hMPV的RT-PCR方法.方法 根据不同基因型的hMPV G蛋白基因序列设计合成A、B基因型的特异性引物,在一次双重PCR反应中根据扩增产物大小鉴别不同基因型.用该方法鉴别37份hMPV阳性的临床标本的基因型.结果 用hMPV G蛋白编码基因的分型引物进行PCR反应,对已知的hMPV阳性标本直接进行分型得到的扩增产物大小易于区分;对常见的呼吸道病毒无非特异扩增,显示引物特异性良好.对37份临床标本进行基因分型结果显示,20份A基因型分型结果与M基因测序分型结果一致,17份经M基因测序分型为B基因型的阳性标本中有14份与M基因测序分型结果一致,3份未得到扩增产物从而不能分型,总符合率为91.9%[(20+14)/37].结论 成功建立了一种可以鉴别不同基因型的hMPV的RT-PCR方法.     

2000～2002年丙型肝炎病毒核酸逆转录聚合酶链反应测定室间质量评价

目的 评价2000年至2002年临床基因扩增检验实验室在丙型肝炎病毒(HCV)RNA逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测中的质量。方法 从2002年至2003年每年进行质评两次，每次发放HCVRNA样本5份，其中阳性样本3—4份，含量在10^4-10^7拷贝数／ml范围内。阴性样本1～2份，均为冻干品。要求各个实验室按规定时间检测并回报结果，然后统计分析。结果 对质评样本测定全部正确的比率从2000年的001批的53．3％(24／45)、002批的4．8％(2／42)和2001年011批的73．8％(31／42)、012批的79．2％(42／53)，上升到2002年021批的89．7％(105／117)和022批的91．6％(109／119)。假阳性率也从2000年和2001年的高至26．7％和14．3％降至2002年的8．0％以下。对在10^5和10^4拷贝数／ml数量级的质评样本，测定假阴性率从2000年的15．6％(0011)、19．0％(0025)和81．0％(0023)下降到2001年的11．9％(0112)、11．3％(0125)和9．5％(0115)，到2002年更是下降到了4．6％(0221)、3．7％(0223)和3．8％(0212)。从试剂盒的临床使用评价来看，从2000年到2002年各厂家试剂的临床检测特异性、灵敏度和符合率均有明显改善。结论 从2000-2002年全国临床HCV RNA RT-PCR测定假阳性和假阴性明显降低。说明所建立的HCV RNA临床RT-PCR测定室间质量评价项目能很好的监测实验室存在质量问题，从而促使其加以改进。     

婴幼儿呼吸道合胞病毒和人鼻病毒急性下呼吸道感染临床特征及随访研究

目的：比较婴幼儿呼吸道合胞病毒（RSV）和人鼻病毒（HRV）急性下呼吸道感染的临床特征,探讨婴幼儿期RSV急性下呼吸道感染患儿后期哮喘和反复喘息的发生与HRV感染患儿是否存在差异。方法采用 RT-PCR 或 PCR 方法检测住院患儿咽拭子或鼻咽吸取物中常见的呼吸道感染病毒,选取单一RSV和HRV感染病例,回顾性比较两组患者的临床特征并进行随访。结果 RSV感染组纳入病例80例, HRV感染组纳入32例。两组患儿的临床特征相似,但RSV感染组患儿年龄偏小（P＝0.004）,有喘息表现者明显多于 HRV 感染组（P＝0.000）。在与哮喘和反复喘息发生的关系上,两组间的差异无统计学意义（P值均为1.000）。结论婴幼儿RSV和HRV急性下呼吸道感染的临床特征相似,但在平均年龄、临床喘息的发生率等方面存在统计学差异。未发现婴幼儿期 RSV 感染患儿后期哮喘和反复喘息的发生与HRV感染患儿间存在差异。     

利用SYBR Green Ⅰ实时定量RT-PCR方法检测白血病患者RbAp46基因的表达

目的探讨白血病患者骨髓细胞RbAp46基因的表达水平.方法建立实时定量RT-PCR方法,利用SYBR Green Ⅰ染料检测140例急性白血病(AL)、13例慢性粒细胞白血病(CML)慢性期和7例CML急变期患者以及32例非白血病患者骨髓细胞RbAp46基因的表达水平.结果初诊与复发AL患者骨髓中RbAp46基因表达水平的M估计值分别为178.23和213.65,明显高于完全缓解组和对照组(分别为85.89和88.08);CML慢性期组M估计值为58.27,与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05),而CML急变期组M估计值为173.24,明显高于CML慢性期组和对照组.98例初诊AL中除M2、M4亚型M估计值(62.63,130.67)与对照组相比差异无统计学意义外,余均明显高于对照组.初诊AL中RbAp46基因表达水平与bcr/abl、PML-RARα、mdrl基因的表达无相关性,但与WT1基因的表达水平呈正相关,与AML1/ETO融合基因表达呈负相关.结论RbAp46在AL初诊、复发及CML急变期患者骨髓细胞中高表达,可能参与白血病的发生.     

不同麻醉方法对人外周血淋巴细胞促炎性细胞因子基因表达的影响

目的：研究复合麻醉中人外周血淋巴细胞IL－8,IL－1β基因表达,探讨异氟醚吸入和硬膜外阻滞对外周血炎性反应的影响。方法：24例肝脏部分切除手术病人随机分为异氟醚组（n=12)和硬膜外组（n=12),在麻醉诱导后即刻和4h分别取静脉血20ml用外周血淋巴细胞分离液（Ficoll)进行梯度离心,从收获的淋巴细胞中提取RNA,逆转录合成cDNA,PCR后电泳扫描求积,检测淋巴细胞IL－8,IL－1β和mRNA表达结果：异氟醚组麻醉维持4h后比麻醉诱导后即刻IL－8,IL－1β的表达增加,（P＜0．05）,硬膜外组麻醉维持4h与麻醉诱导后即刻ILIL－8,IL－1β的表达无明显变化（P＞0．05）,结论：复合麻醉中吸入异氟醚能增强肝脏部分切除病人外周血淋巴细胞促炎性细胞因子mRNA表达,即在转录水平上,异氟醚能增强外周血炎性反应,而硬膜外阻滞无此效应。     

比较实时荧光定量PCR法和直接荧光免疫法检测人偏肺病毒的价值

目的 比较Q-RT-PCR法与直接荧光免疫法对诊断hMPV的价值.方法 收集嘉兴市妇幼保健院2008年11月至2009年5月因急性呼吸道感染入院治疗的患儿共1 283例,分离hMPV阳性病毒株,进行测序并与荷兰分离株NLD00-1进行序列比对.根据本地区流行的hMPV病毒株序列设计hMPV特异的引物和荧光标记探针,建立应用TaqMan探针的Q-RT-PCR方法.用负压吸引的方法采集鼻咽分泌物标本,标本分别用Q-RT-PCR和FITC标记的病毒特异性单克隆抗体直接荧光免疫法进行检测,并对两种方法的检测结果进行McNemar test一致性检验.结果 1283份标本同时进行Q-RT-PCR和直接荧光免疫法两种方法检测,Q-RT-PCR法检出59例阳性,直接荧光免疫法检出55例阳性,两者同时为阳性者52例,Q-RT-PCR法阳性而直接荧光免疫法阴性7例,Q-RT-PCR阴性而直接荧光免疫法阳性3例.如果以Q-RT-PCR法结果为金标准,直接荧光免疫法检测敏感度为88.1%,特异度为99.8%,阳性预测值为94.5%,阴性预测值为99.4%,准确性为99.2%.McNemar test一致性检验,两种方法检测阳性率差异无统计学意义(χ2=0.9,P＞0.05).结论直接荧光免疫法对hMPV临床诊断价值接近于Q-RT-PCR.

Abstract：

Objectives To evaluate the diagnostic value of real-time quantitative fluorescence polymerase chain reaction( Q-RT-PCR ) assay and immunofluorescence assay for diagnosis of hMPV. Methods Totally 1 283 children with acute respiratory infection admitted in Jiaxing Maternity and Child Health Care Hospital for treatment from November 2008 to May 2009 were recruited in this study. The hMPV positive stains were separated and sequenced in this area. The sequences between the local hMPV stains and Holland stains NLD00-1 were compared. The specific primers and fluorescent probe were designed according to the sequence of epidemic hMPV strain. The Taqman methodology was applied in Q-RT-PCR. Negative pressure suction was used to acquire nasopharyngeal secretions specimens. Both Q-RT-PCR and immunofluorescence with FITC labeled monoclonal antibody were used to analyze them, respectively. The McNemar, test was applied to analyze the correlation between the two methods. Results Totally 1 283 specimens were analyzed with Q-RT-PCR and immunofiuorescence simultaneously. Q-RT-PCR analysis showed there were 59 cases positive. Immunofluorescence analysis showed there were 55 cases positive. Fifty-two cases were positive in both assays. There were 7 cases positive in Q-RT-PCR assay but negative in immunofluorescence assay and 3 cases negative in Q-RT-PCR assay but positive in immunofluorescence assay. If Q-RT-PCR method was set as the golden standard, the sensitivity and specificity for immunofluorescence detection method were 88. 1%and 99. 8%, respectively. Positive predictive value and negative predictive value were 94. 5% and 99. 4%,respectively. There was no significant difference ( χ2= 0. 9, P ＞ 0. 05 ) by McNemar' test between the two methods. Conclusion The diagnostic value of immunofluorescence assay is close to Q-RT-PCR assay.