HIV-1 Tat真核表达载体的构建及在内皮细胞的表达

目的:构建HIV-1 Tat真核表达质粒,为研究Tat在HIV-1致病机制中的作用奠定实验基础。方法:以pCV1(tat and rev)质粒为模板,用PCR方法扩增HIV-1 Tat基因,克隆至p cDNA3.1( )表达载体,酶切及测序鉴定重组体。重组质粒转染ECV304细胞,用RT-PCR、转染HIV-1 LTR荧光报告基因的方法检测tat基因的表达及活性。结果:经酶切及测序鉴定,成功构建pcDNA3.1( )-Tat重组质粒。重组体转染ECV304细胞,建立稳定表达细胞株,应用RT-PCR可检测到Tat基因mRNA的表达;荧光仪检测Tat蛋白可明显促进荧光素酶在ECV304细胞内的表达。结论:成功构建HIV-1Tat真核表达载体,并建立了HIV-1 Tat内皮细胞稳定表达细胞株。     

携带人bcl-2基因的慢病毒表达载体的构建及其在人原代卵巢颗粒细胞中的表达

目的 构建及鉴定bcl-2基因慢病毒表达载体,并观察在体外人卵巢原代颗粒细胞中的表达.方法 采用PCR技术从含有人bcl-2基因的质粒克隆模板pCMV-SPORT6钓取bcl-2基因,并将基因克隆到慢病毒载体表达质粒pGC-FU(含EGFP基因)中,构建慢病毒载体表达质粒pGC-FU-bcl-2,通过酶切、测序验证bcl-2基因后,将pGC-FU-bcl-2质粒和包装质粒pHelper1.0、pHelp-er2.0共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞.获得携带bcl-2基因和EGFP基因的重组慢病毒GC-FU-bcl-2,并转染靶细胞人卵巢原代颗粒细胞.通过检测标志蛋白增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和目的 蛋白bcl-2进一步验证pGC-FU-bcl-2在靶细胞中的表达.结果 (1)pGC-FU-bcl-2中携有正确的bcl-2基因,并能在人类细胞中表达;pGC-FU-bcl-2共转染包装细胞293T能产生重组病毒GC-FU-bcl-2;(2)目的 基因bcl-2能被重组慢病毒高效地转导入靶细胞人卵巢原代颗粒细胞,并达到稳定的表达,荧光显微镜下能直接观察到GFP,Western blotting能检测到bcl-2蛋白在靶细胞中的表达.结论 成功构建了携带bcl-2基因的重组慢病毒载体,转染人卵巢原代颗粒细胞后能够稳定表达bcl-2基因,为进一步研究bcl-2的功能和细胞凋亡相关疾病的治疗奠定基础.     

HIV-1 Ta填核表达载体的构建及在Huh-7细胞中表达

目的构建1型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)反式激活因子(Tat)基因真核表达质粒,并研究该质粒在真核细胞中的有效表达。方法以含有HIV-1全长基因的质粒pNL4-3为模板,通过PCR扩增HIV-1tat第一外显子,应用基因工程技术将扩增的基因片段插入真核表达质粒pCDNA3.1( ),构建重组真核表达质粒pCDNA3.1-tat,经限制性内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,应用脂质体转染技术转染入人体肝癌细胞系Huh-7细胞。RT-PCR检测其基因转录情况,Westernblot鉴定其是否能够表达相应的目的蛋白质。结果成功扩增了Tat基因,酶切和测序证明正确构建了重组真核表达质粒pCDNA3.1-tat,RT-PCR和Westernblot方法证实该质粒能在Huh-7真核细胞中有效表达HIV-1Tat目的蛋白质。结论成功构建了HIV-1Tat基因的真核表达质粒载体,并在Huh-7细胞中表达,为在Huh-7细胞模型中研究Tat的功能奠定了基础。     

稳定表达HIV-1 GagPol基因真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建能稳定表达HIV-1 GagPol基因的真核表达载体.方法:用PCB方法扩增HIV-1 GagPol基因,克隆入pMD18-T,然后亚克隆人真核表达质粒pcDNA3.2(一)中,将构建的重组质粒pcDNA3.1(-)/GagPol分别瞬时和稳定转染HEK293细胞,经G418筛选,建立稳定转染GagPol基因的细胞系,并应用Western Blot方法鉴定表达产物.结果:酶切鉴定和Western Blot检测证实重组质粒pcDNA3.1(-)/GagPol构建正确,并能稳定表达HIV-1GagPol蛋白.结论:成功构建携带HIV-1 GagPol基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)/GagPol,并在HEK293细胞中获得稳定表达.     

胰腺癌新基因S100P与绿色荧光蛋白融合基因慢病毒载体的构建

目的:构建胰腺癌新基因SLOOP与绿色荧光蛋白(GFP)融合基因慢病毒载体.方法:实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增获得SlOOP的全外显子片段.使之克隆到带GFP荧光报告基因慢病毒表达载体质粒中,慢病毒包装质粒和穿棱质粒共转染293T细胞,包装成功后收集上清,浓缩,鉴定.取浓缩纯化后的病毒上清感染293T细胞和宿主胰腺癌细胞.荧光显微镜观察293T细胞的荧光表达,RT-PCR鉴定胰腺癌细胞中SLOOP的表达水平.结果:电泳鉴定结果与目的基因表达条带完全吻合,克隆测序结果与NCBI收录的S LOOP基因序列完全一致.重组慢病毒质粒可高效转染293T细胞.荧光显微镜下可观察到大量绿色荧光.共转染后293T细胞上清可高效感染293T细胞,感染后宿主细胞中S LOOP高表达.结论:成功构建了S LOOP与GFP融合基因慢病毒表达载体,为进一步研究SLOOP基因的相关功能提供了适合的稳定转染载体.     

WWOX基因慢病毒载体的构建及其在卵巢癌细胞中的表达

目的：构建及鉴定WWOX基因慢病毒载体,观察WWOX基因在人卵巢癌PEO1细胞株中的表达,为进一步研究WWOX基因的作用机制及其功能奠定基础。方法：采用PCR技术从克隆质粒模板中获得全长WWOX基因,将WWOX基因亚克隆到慢病毒载体PCDH—CMV—MCS-EF1-copGFP中,构建慢病毒载体表达质粒PCDH—WWOX,通过双酶切验证后,慢病毒表达质粒与慢病毒包装质粒pPACKH1-GAG,pPACKH1-REV,Pvsv-G共转染293T细胞,获得携带WWOX基因及EGFP基因的重组慢病毒Lenti WWOX,并转染靶细胞人卵巢癌PEO1细胞株。通过RT—PCR和Western Blot验证Lenti WWOX在PEO1细胞株中的表达。结果：测序结果显示成功构建重组慢病毒载体表达质粒PCDH—WWOX;表达质粒与辅助包装质粒共转染包装细胞293T后能产生慢病毒颗粒并能有效感染靶细胞PEO1,转导效率约为60％,有WWOX基因mRNA和蛋白水平的高表达。结论：本实验成功构建了携带WWOX基因慢病毒表达载体,包装成病毒后能有效感染卵巢癌PEO1细胞。     

HBX基因逆转录病毒载体的构建及在LO2细胞内的稳定表达

目的 构建乙型肝炎病毒X基因(HBX)逆转录病毒载体,并使其在人正常肝细胞LO2内的进行稳定表达.方法 PCR扩增HBX基因,克隆到逆转录病毒载体质粒pSEB-Flag中,构建表达HBX的重组逆转录病毒载体质粒pSEB-Flag-HBX,通过通过PCR、酶切、测序验证HBX基因后;体外将重组质粒pSEB-Flag-HBX与包装质粒pAmpho共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞,包装获得携带HBX基因的重组逆转录病毒,并感染靶细胞人正常肝细胞LO2,稻瘟菌素(Blasticidin)筛选,获得成功转入HBX的LO2细胞.通过RT-PCR和Western blot进一步验证HBX基因及HBx蛋白在LO2细胞内的表达.结果 (1)成功获得携带HBX基因的阳性重组质粒pSEB-Flag-HBX;(2)HBX基因被逆转录病毒成功地导入靶细胞LO2细胞,并实现稳定表达,RT-PCR检测到HBX mRNA在靶细胞中的表达,Western blot检测到HBx蛋白在靶细胞LO2-HBx细胞中的表达.结论 成功构建了携带HBX基因的重组逆转录病毒载体,感染人正常肝细胞LO2后能够稳定表达HBx蛋白,为进一步探讨HBx在肝癌发生发展中的作用提供了较为理想的实验模型.     

LMP1基因重组慢病毒载体的构建及体外表达

目的 构建EB病毒潜伏膜蛋白Ⅰ(LMP1)基因重组慢病毒载体,并检测其在体外的表达.方法 采用DNA重组技术,将LMP1基因克隆到带绿色荧光蛋白的慢病毒表达载体质粒pCDF中,筛选阳性克隆,经限制性酶切、PCR扩增和DNA测序鉴定重组载体.以脂质体介导法将慢病毒包装系统的包装质粒pFIV-34N、包膜质粒pVSV-G和带目的 基因的质粒pCDF-LMP1共同转染到包装细胞293FT细胞内包装病毒,荧光显微镜观察包装细胞报告基因的表达情况,收集病毒上清,浓缩鉴定,测定重组病毒的滴度.将重组慢病毒转染小鼠B淋巴瘤细胞系A20,RT-PCR和Westernblotting检测LMP1的表达.结果 重组慢病毒表达载体质粒经限制性酶切和DNA测序分析证实LMP1基因准确克隆入pCDF的多克隆位点,LMP1序列与GenBank中的数据完全一致.荧光显微镜下观察可见293FT细胞的细胞浆与细胞膜有大量的绿色荧光,重组慢病毒浓缩后滴度为107Tu/ml,慢病毒转染A20细胞的效率>90%.RT-PCR和Westernblotting检测A20细胞内有LMP1的表达.结论 成功构建了LMP1基因重组慢病毒表达载体,慢病毒可高效转染A20细胞,为后期研究EBV致瘤基因LMP1在淋巴瘤发病机制中的作用奠定基础.     

HIV-1型病毒蛋白R基因表达载体的构建及其在前列腺癌细胞系PC-3中的表达

目的：利用AdEasy腺病毒载体系统构建含HIV-1病毒蛋白R（viral protein R,Vpr）基因的重组腺病毒,使之有效感染靶细胞前列腺癌细胞系PC-3,并在其中表达Vpr。方法：自表达载体pCI—neo—Vpr中扩增出Vpr基因,插入到pAdTrack—CMV中构建成腺病毒穿梭质粒pAdTrack—Vpr,经限制性内切酶Pme I酶切线性化后,利用磷酸钙介导法将其与腺病毒骨架质粒pAdEasy共同转化到BJ5183大肠埃希菌。挑选同源重组质粒,经Pac I酶切后回收大片段,并将其转染包装细胞AD293。利用荧光显微镜观察AD293细胞中绿色荧光蛋白（GFP）表达。收集第一代重组病毒上清,使之感染AD293细胞得到第二代病毒,如此反复感染AD293细胞3—4轮,使病毒大量扩增。梯度稀释法测定病毒滴度后,分别以感染复数（MOI）为1、5、10的病毒量感染靶细胞PC-3,荧光显微镜观察细胞中GFP表达,并利用RT＋PCR和蛋白质印迹技术分别从mRNA和蛋白水平检测目的基因的转录与表达情况。结果：经限制性内切酶检测、GFP表达和病毒上清液PCR证实成功构建了携带Vpr基因的重组腺病毒,滴度为3．0×10^8efu／ml。以MOI为5的重组腺病毒感染24h后,80％以上的靶细胞能够表达GFP,RT—PCR和蛋白质印迹能够同时检测到目的基因Vpr的转录与表达。结论：成功构建含Vpr基因重组腺病毒,并且病毒能够有效感染PC-3细胞,使得目的基因在其中获得大量表达,为进一步研究Vpr蛋白对PC-3肿瘤细胞的影响及其可能涉及的信号通路奠定了基础。     

Construction and identification of recombinant lentiviral vector containing HIV-1 Tat gene and its expression in 293T cells

Objective： To construct a lentiviral vector expressing HIV-1 Tat and identify its expression in 293T cells. Methods： The gene fragment of HIV-1 Tatlol was subcloned to lentiviral transfer vector pHAGE-CMV-MCS- IZsGreen, which was named pHAGE-Tat. Then the constructed pHAGE-Tat was used to co-transfect the packing 293T cells, together with the packaging plasmids pMD2.G and psPAX2. The packaged viral particles designated LV-Tat were used to infect the 293T cells and the viral titer was calculated. The expression of HIV-1 Tat in 293T cells was confirmed using RT-PCR and western blot. Results： The recombinant lentiviral vector was successfully constructed and could express HIV-1 Tat in 293T cells. The virus titer was 5.73×10^6 ifu/ml. Conclusion： The successfully constructed recombinant lentiviral vector makes a strong foundation for further exploring the possible role of HIV-1 Tat in the development of prostate cancer.     

脑脊液来源人类免疫缺陷病毒tat真核表达载体的构建及鉴定

目的：探讨脑脊液来源人类免疫缺陷病毒（HIV）tat真核表达载体的构建,并研究TAT蛋白在真核细胞的表达。方法从脑脊液中扩增出HIV tat基因,构建pcDNA-tat真核表达载体,所构建载体经酶切和测序鉴定。将构建的表达载体转染293T细胞系,通过免疫荧光检测TAT蛋白的表达。结果成功扩增tat基因,酶切和测序结果证实正确构建了表达载体pcDNA-tat,免疫荧光证实所构建载体能在293T细胞中有效表达HIV TAT目的蛋白。结论成功构建真核表达载体pcDNA-tat,为了解HIV在中枢神经系统的潜伏机制奠定实验基础。     

Effect of HIV-1 Tat on Secretion of TNF-α and IL-1β by U87 Cells in AIDS Patients with or without AIDS Dementia Complex

Objective To explore the role of HIV-1 tat gene variations in AIDS dementia complex(ADC) pathogenesis.Methods HIV-1 tat genes derived from peripheral spleen and central basal ganglia of an AIDS patient with ADC and an AIDS patient without ADC were cloned for sequence analysis. HIV-1 tat gene sequence alignment was performed by using CLUSTAL W and the phylogentic analysis was conducted by using Neighbor-joining with MEGA4 software. All tat genes were used to construct recombinant retroviral expressing vector MSCV-IRES-GFP/tat. The MSCV-IRES-GFP/tat was cotransfected into 293T cells with pCMV-VSV-G and pUMVC vectors to assemble the recombinant retrovirus. After infection of gliomas U87 cells with equal amount of the recombinant retrovirus, TNF-α, and IL-1β concentrations in the supernatant of U87 cells were determined with ELISA. Results HIV-1 tat genes derived from peripheral spleen and central basal ganglia of the AIDS patient with ADC and the other one without ADC exhibited genetic variations. Tat variations and amino acid mutation sites existed mainly at Tat protein core functional area(38-47aa). All Tat proteins could induce U87 cells to produce TNF-α and IL-1β, but the level of IL-1β production was different among Tat proteins derived from the ADC patient's spleen, basal ganglia, and the non-ADC patient's spleen. The level of Tat proteins derived from the ADC patient's spleen, basal ganglia, and the non-ADC patient's spleen were obviously higher than that from the non-ADC patient's basal ganglia. Conclusion Tat protein core functional area(38-47aa) may serve as the key area of enhancing the secretion of IL-1β. This may be related with the neurotoxicity of HIV-1 Tat.     

逆转录病毒Pmscv/Hyg介导的RNA干扰表达载体的构建与鉴定

目的构建逆转录病毒Pmscv/Hyg介导的RNA干扰表达载体,并在HEK293细胞株中观察其基因沉默效果。方法PCR方法扩增人U6启动子,下游引入核酸内切酶位点BamHI、SalI,反向插入质粒Pmscv/Hyg的3′端LTR上游。扩增EGFP基因,插入载体Pmscv/Hyg的多克隆位点。合成干扰P53基因表达的寡核苷酸序列,退火复性后插入U6启动子下游BamHI、SalI酶切位点间。重组质粒经酶切、测序鉴定正确后转染病毒包装细胞PT67,产生具有一次感染能力的病毒颗粒。病毒上清感染靶细胞HEK293,经潮霉素筛选,RT-PCR和western blot检测靶基因P53表达情况。结果质粒酶切及DNA测序表明成功构建重组病毒载体,并在PT67细胞中包装成具有一次感染能力的逆转录病毒。经Hygromycin筛选,HEK293细胞中P53蛋白和mRNA表达显著下调。结论成功构建以Pmscv/Hyg为基础的RNA干扰表达载体,重组载体包装出的逆转录病毒可有效介导基因沉默。     

HIV-1 Tat基因在pEGx-KG中的融合构建及原核表达

目的:在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达融合的Tat蛋白。方法:用PCR方法从HIV cDNA文库中扩增出Tat基因,并将其插入到表达载体pEGx-KG中,转化到E.coli中进行融合表达,表达产物用蛋白电泳和Western-blot进行鉴定。结果:成功地构建了重组质粒pEGx-KG-Tat,重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中得到高效表达。蛋白电泳和Western-blot分析表明,在相对分子质量(Mr)为38.9kDa处有1条特异性的带。结论:GST基因与HIV-1 Tat基因的融合构建,使Tat蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,为艾滋病的防治研究奠定了基础。     

人基质金属蛋白酶组织抑制剂1腺相关病毒表达质粒的构建及检测

目的构建含人基质金属蛋白酶组织抑制剂1（tissue inhibitor of metalloproteinases1,TIMPl）的腺相关病毒（adenoassociatedvirus,AAV）表达质粒并观察其在人胚肾293（HEK293）细胞中的表达,为进一步逆转椎间盘退变提供依据。方法以含有人TIMP1基因序列的质粒pBLAST49-hTIMP1为模板,通过PCR的方法扩增出TIMP1基因,再采用分子克隆的方法,把TIMP1克隆到AAV表达质粒pSNAV2．0构建重组质粒pSNAV2-TIMP1。把重组质粒转染HEK293细胞,用免疫荧光和Westernblot的方法对重组质粒的表达进行研究,ELISA法检测细胞培养上清液中TIMP1蛋白的含量。结果PCR、酶切、DNA测序等方法均证实成功构建了含有完全正确的TIMP1基因序列的AAV表达质粒pSNAVz-TIMP1。体外成功转染入HEK293细胞,免疫荧光、Westernblot及ELISA的结果表明重组质粒能够高表达TIMP1蛋白。结论成功构建了表达TIMP1的重组质粒pSNAV2-TIMP1,并证实在蛋白质水平获得了表达,为进一步逆转椎间盘退变研究奠定了基础。     

miR-148a克隆及逆转录病毒载体构建

目的 克隆微小RNA hsa-miR-148a并构建逆转录病毒表达载体.方法 将PCR扩增得到的miR-148a前体序列和pMSCV载体经双酶切连接产生pMSCV-miR-148a逆转录病毒表达载体,双酶切后测序鉴定,筛选阳性克隆.用pMSCV-miR-148a和PIK packaging质粒以磷酸钙共沉淀法转染包装细胞293FT,包装产生逆转录病毒.将病毒感染NIH3T3细胞进行滴度测定.结果 经双酶切鉴定和测序证实,成功构建了miR-148a的逆转录病毒表达载体pMSCV-miR-148a.并测得病毒滴度为5×108CFU/ml.结论 以miR-148a前体序列构建的逆转录病毒表达载体pMSCV-miR-148a能够产生高滴度的逆转录病毒,为深入研究miR-148a的生物学功能奠定了基础.     

Construction of Eukaryotic Expression Plasmid of Human PRX3 and Its Expression in HEK-293FT Cells

To construct the eukaryotic expression plasmid of human PRX3 and measure its expression in the HEK-293FT cells, the full-length coding region of human PRX3 was cloned by PCR and inserted into the eukaryotic expression vector pcDNA4-Xpress (A). HEK-293FT cells were transiently transfected with the recombinant plasmid. Western blot and immuofluorescence were used to detect the expression of the fusion protein. In the experiment, restriction analysis identified the construction of the recombinant plasmid and the inserted sequence was identical with that published on GenBank. Western blot and immunofluorescence confirmed the expression of the recombinant protein in transfected HEK-293FT cells. It was concluded that the eukaryotic expression plasmid of human PRX3 was constructed successfully and the recombinant could he expressed efficiently in HEK-293FT cells, which provides a sound basis for the further study on human PRX3.