缺氧缺血新生大鼠神经元自噬基因表达节律及调控机制

目的通过新生大鼠缺氧缺血脑损伤后神经元自噬基因和节律基因的表达,探讨缺氧缺血引起神经损伤的新机制。方法将12只Sprague-Dawley大鼠随机分为缺氧缺血组和假手术组,每组6只。采用结扎并切断大鼠右侧颈总动脉并给予低氧处理的方法建立体内缺氧缺血脑损伤模型。Western blot检测两组大鼠大脑皮层和海马组织节律蛋白Clock表达情况。体外培养大鼠神经元细胞,随机分为氧糖剥夺(OGD)组和对照组,OGD组加入无糖无血清DMEM培养基模拟细胞缺血状态,并给予低氧处理建立体外缺氧缺血脑损伤模型。采用Western blot检测两组不同时间点自噬相关蛋白Beclin1和LC3,以及节律基因Clock蛋白表达情况。应用si RNA技术抑制神经元Clock蛋白表达后,检测Beclin1和LC3的表达变化。结果体外培养神经元Beclin1和LC3Ⅱ的表达呈现节律性波动;OGD处理后,体外培养神经元Beclin1和LC3Ⅱ的表达随着时间的延长逐渐升高,不再呈现节律性波动;与假手术组相比,缺氧缺血引起大鼠皮层和海马组织Clock表达降低(P0.05);体外培养神经元经OGD处理后,Clock表达也较对照组显著降低(P0.05);与阴性对照组相比,抑制神经元节律基因Clock表达后,自噬相关蛋白Beclin1和LC3Ⅱ的表达均显著下降(P0.05)。结论缺氧缺血引起神经元Beclin1和LC3Ⅱ表达节律紊乱,其机制可能与Clock参与调控Beclin1和LC3Ⅱ的表达有关。     

自噬在脂多糖诱导的A549细胞炎症反应中的作用及机制研究

目的 探讨自噬在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的人肺泡上皮A549细胞炎症反应中的作用及机制。方法 用LPS刺激A549细胞建立炎症反应模型,按浓度(0、1、5、10μg/mL)和时间(0、4、8、12、24h)分组(各组n=3)。用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)处理细胞,分为对照组、LPS组、3-MA组、3-MA+LPS组(各组n=3);用自噬激动剂雷帕霉素(rapamycin,RAPA)处理细胞,分为对照组、LPS组、RAPA组、RAPA+LPS组(各组n=3)。通过Toll样受体4 (Toll-like receptor 4,TLR4)过表达质粒和siRNA转染A549细胞,实验分为两部分,每部分各分4组(各组n=3):TLR4过表达对照组、TLR4过表达组、TLR4过表达对照+LPS组、TLR4过表达+LPS组;TLR4沉默对照组、TLR4沉默组、TLR4沉默对照+LPS组、TLR4沉默+LPS组。采用CCK-8法检测细胞存活率,免疫印迹法检测炎症指标(NLRP3、Caspase-1、ASC)、自噬指标(LC3B...     

线粒体自噬对新生大鼠缺氧缺血脑损伤的影响

目的了解缺氧缺血脑损伤的动物模型中线粒体自噬情况,探讨其在缺氧缺血脑损伤中的作用。方法将120只新生7日龄Sprague-Dawley大鼠分为假手术组、缺氧缺血脑损伤(HIBD)组、自噬抑制剂干预组(3MA组)。HIBD组行右侧颈总动脉结扎后置于低氧仓(8%氧气和92%氮气)2.5 h,3MA组腹腔注射2μL 3MA 30 min后再进行结扎和低氧处理,假手术组不予结扎和低氧处理。在造模后提取各组单细胞悬液,用Mitotracker标记线粒体、Lysotracker标记自噬小体、LC3标记自噬进行免疫荧光共定位观察线粒体自噬情况;荧光探针JC-1染色后,采用流式细胞仪检测线粒体膜电位。TTC染色法检测脑梗死灶大小。提取皮质神经元中的细胞浆蛋白,Western blot法检测线粒体自噬相关蛋白的表达情况。结果与假手术组相比,HIBD组线粒体膜电位明显降低(P0.05),线粒体自噬增加(P0.05),线粒体分裂相关蛋白Drp1、Fis1的表达升高,线粒体外膜蛋白受体Tom20与内膜蛋白受体Tim23的表达降低(P0.05);3MA组膜电位比HIBD组降低更为明显(P0.05),但线粒体自噬程度明显减少(P0.05)。3MA组大鼠脑组织梗死程度较HIBD组明显增加(P0.05)。结论 HIBD能够增加线粒体自噬的发生,抑制线粒体自噬会加重新生大鼠HIBD的损伤程度。     

PINK1基因对缺氧缺血性脑损伤新生小鼠细胞凋亡及自噬的影响

目的 研究PINK1 基因对缺氧缺血性脑损伤新生小鼠细胞凋亡及细胞自噬的影响。方法 将野生型和PINK1 基因敲除型新生小鼠各72 只分为野生型假手术组(SWT)、野生型模型组(MWT)、基因敲除假手术组(SKO)及基因敲除模型组(MKO)。模型组小鼠行右侧颈总动脉结扎后置于低氧舱中(含8%氧气和92% 氮气)2.5 h,假手术组不予结扎和低氧处理。缺氧缺血处理后24 h,采用TTC 染色法检测各组新生小鼠脑梗死程度;采用免疫组化法检测各组脑组织中活化型半胱天冬酶-3(CC3)的表达;采用TUNEL 法检测细胞凋亡;采用免疫荧光法及Western blot 法检测细胞自噬相关蛋白LC3 的表达。结果 MKO 组小鼠脑组织梗死程度较MWT 组小鼠明显减轻(P<0.05);脑组织凋亡阳性细胞数明显减少,凋亡指数降低(P<0.05);凋亡蛋白CC3 表达显著减少(P<0.05)。MKO 组小鼠自噬相关蛋白LC3 表达较MWT 组减少,进一步检测证实自噬指标LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比值较MWT 组降低(P<0.05)。结论 敲除PINK1 基因对新生鼠缺血缺氧脑损伤具有神经保护作用。     

戊二酸致原代培养纹状体神经元神经毒性的体外研究

目的 探讨戊二酸(GA)干预体外培养纹状体神经元致神经元损伤的浓度和时间及其损伤机制.方法 体外培养新生大鼠纹状体神经元,于体外培养7 d行神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫细胞化学染色鉴定神经元纯度.纯度达90%以上,用不同浓度GA(1～50 mmol·L-1)孵育体外培养10 d的纹状体神经元24～96 h.倒置显微镜及赫斯特荧光染料33342(-/+)荧光活细胞染色后荧光显微镜观察神经元形态变化;四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色(MTT)法检测细胞线粒体功能变化;膜联蛋白-V/碘化丙啶双染流式细胞仪检测判断GA诱导纹状体神经元凋亡率及死亡率;实时定量反转录(RT)-PCR及Western blot法检测半胱氨酸天冬氨酸酶(Caspase)-3、Caspase-9表达.结果 GA处理组细胞线粒体功能受损程度呈浓度及时间依赖性改变:随着GA浓度升高,干预时间延长,神经元损伤加重.与正常对照组比较,10 mmol·L-1、25 mmol·L-1、50 mmol·L-1组GA干预24～72 h纹状体神经元活力均比正常对照组显著增高(P<0.05);1 mmol·L-1组干预72 h、96 h与正常对照组比较均明显升高(Pa<0.01).50 mmol·L-1组孵育72 h较孵育48 h细胞凋亡显著增加[(87.63±9.17)% vs (40.90±4.10)%,P<0.01];25 mmol·L-1组孵育72 h凋亡率为(24.73±2.95)%.10 mmol·L-1、25 mmol·L-1、50 mmol·L-1 GA作用神经元1 h、6 h,Caspase-9和Caspase-3 mRNA表达明显增加,25 mmol·L-1、50 mmol·L-1 GA处理24 h后神经元Caspase-9、Caspase-3蛋白活化片段增加.结论 GA致纹状体神经元损伤呈浓度-时间依赖性,通过Caspase-9/Caspase-3途径诱导纹状体神经元凋亡,该机制可能与GA血症Ⅰ型大鼠纹状体退行性变有关.     

肠道病毒71型诱导人恶性胶质瘤细胞U251自噬的研究

目的 初步研究肠道病毒71型(EV71)诱导人恶性胶质瘤细胞U251的自噬现象及其对微管相关蛋白1轻链3(LC3)表达的影响.方法 RPMI 1640培养U251细胞24h后随机分为实验组和对照组,实验组按感染复数(MOI)值为1加入EV71,EV71感染12h后采用单丹磺酰戊二胺(MDC)染色标志细胞自噬泡,荧光显微镜观察自噬泡的形成.EV71感染24 h后细胞免疫荧光检测LC3,荧光显微镜观察LC3在U251细胞内的分布.EV71感染2、4、8、12、24、48 h采用Western blot检测LC3-I和LC3-Ⅱ蛋白的表达,并对LC3-Ⅱ蛋白进行半定量分析.结果 自噬泡经过MDC染色后,荧光显微镜观察发现自噬泡呈点状结构.与对照组比较,实验组在EV71感染12 h,U251细胞内自噬泡明显增多;EV71感染24 h,U251细胞皱缩、变小、形态不规则,LC3蛋白表达明显增多,主要分布在细胞质和细胞核周围;EV71感染4h后,LC3-Ⅱ蛋白表达开始增加,明显高于对照组(P＜0.01).结论 EV71能有效诱导U251细胞自噬,发挥其溶瘤作用.     

己烯雌酚和胰岛素样因子3对睾丸引带细胞中富含亮氨酸的G蛋白耦联受体8mRNA和蛋白表达水平的影响

目的 探讨不同水平的己烯雌酚(DES)和胰岛素样因子3(INSL3)对体外培养的睾丸引带细胞中富含亮氨酸的G蛋白耦联受体8(LGR8) mRNA和蛋白表达的影响.方法 将3日龄的雄性昆明小鼠的睾丸引带组织解剖取出,并进行细胞培养.传代后,随机分为正常对照组及实验组(不同浓度DES组:A～E组,不同浓度INSL3组:Ⅰ～Ⅳ组)共11组.其中,实验组加入的DES浓度分别是3.7×10-2 mmol·L-1、3.7×10-3 mmol·L-1、3.7×10-4 mmol·L-1、3.7×10-5 mmol·L-1和二甲基亚砜溶剂对照组;INSL3的浓度分别为3.3×10-3 μmol·L-1、3.3×10-4 μmol·L-1、3.3×10-5 μmol·L-1及3.3×10-6 μmol·L-1.加药持续作用48 h后,应用反转录PCR和流式细胞术分析睾丸引带细胞中LGR8 mRNA及其蛋白的表达情况.结果 A组和Ⅳ组LGR8的mRNA及蛋白水平显著高于正常对照组(P<0.01);与正常对照组相比,B、C、D组LGR8 mRNA及其蛋白表达均显著下降(Pa<0.05),而E组及Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组LGR8 mRNA和其蛋白的表达差异均无统计学意义(Pa>0.05).结论 高剂量的DES和极低剂量的INSL3均能上调睾丸引带细胞中LGR8 mRNA及其蛋白表达水平,推测DES和INSL3可能通过LGR8作用途径来影响睾丸引带的发育.     

PC12细胞氧糖剥夺/再灌注损伤中自噬与凋亡现象

目的观察氧糖剥夺/再灌注(OGD/OGD-R)诱导大鼠嗜铬细胞瘤细胞PC12细胞自噬和凋亡的发生及进展。方法PC12细胞经氧糖剥夺及再灌注处理建立OGD/OGD-R模型,在处理不同时间点,应用流式细胞仪检测OGD组及OGD-R组细胞活性和凋亡率;Western blot法检测自噬相关蛋白LC3、Beclin 1表达;免疫荧光法观察自噬小体;分别使用自噬上下游抑制剂(3-甲基腺嘌呤、E64 d+pepstatin A)进行调控,观察自噬的波动。结果随着氧糖剥夺时间的延长,OGD组细胞形态损伤逐步加重,凋亡率显著增高,呈时间依赖性;OGD-R组早期细胞活性略有恢复,随着再灌注时程的延长,细胞凋亡率逐渐增高。自噬相关蛋白LC3Ⅱ在OGD短暂处理后其表达即有上升,3 h左右达到峰值,6～8 h恢复到基础水平;Beclin 1蛋白呈先上升后平稳下降趋势。OGD 3 h时间点诱导自噬合并3-甲基腺嘌呤处理后自噬体减少明显;而E64 d+pepstatin A可导致LC3Ⅱ的积聚。OGD-R阶段LC3Ⅱ进一步升高至再灌注12 h后开始下降,Beclin 1蛋白表达呈升高趋势并持续至再灌注24 h。结论 OGD/OGD-R均能激活PC12细胞自噬与凋亡,可为探索自噬与凋亡间潜在的串流奠定基础。     

川芎嗪通过PINK1/Parkin通路调控自噬对新生大鼠缺氧缺血性脑病的影响

目的 研究川芎嗪注射液对缺氧缺血性脑病新生大鼠自噬的影响及其分子机制。 方法 将7日龄Sprague-Dawley新生大鼠随机分为假手术组（n=8）、模型组（n=12）、川芎嗪组（n=12）。模型组和川芎嗪组行左侧颈总动脉结扎后再缺氧处理,制备新生大鼠缺氧缺血性脑病模型。假手术组只暴露血管不做其他处理。川芎嗪组在缺氧缺血后每日腹腔注射川芎嗪注射液20 mg/kg,假手术组与模型组每日腹腔注射等体积的0.9%氯化钠溶液。在治疗7 d后取材,采用苏木精-伊红染色及尼氏染色观察脑组织神经元病理变化情况。采用免疫组织化学染色观察各组新生大鼠大脑海马及皮质区域PTEN诱导假定激酶1（PTEN-induced putative kinase 1,PINK1）、Parkin表达。采用TUNEL染色检测神经元凋亡情况。通过免疫印迹法检测PINK1、Parkin、自噬特异性基因Beclin1、微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3）和泛素结合蛋白（Protein 62,P62）的表达。 结果 与假手术组相比,模型组新生大鼠神经元数量减少,细胞间隙增大,排列疏松,胞质空泡化,尼氏小体减少;PINK1、Parkin阳性表达增加,神经元凋亡率升高（均P<0.05）;PINK1、Parkin、Beclin1、LC3蛋白表达增加,P62蛋白表达减少（均P<0.05）。与模型组相比,川芎嗪组新生大鼠神经元数量增多,细胞排列整齐,尼氏小体增加;PINK1、Parkin阳性表达减少,神经元凋亡率降低（均P<0.05）;PINK1、Parkin、Beclin1、LC3蛋白表达减少,P62蛋白表达增加（均P<0.05）。 结论 川芎嗪在一定程度上缓解了新生大鼠缺氧缺血性脑损伤,抑制神经元凋亡,其机制可能与抑制PINK1/Parkin介导的自噬相关。     

自噬基因Beclin-1和微管相关蛋白LC3在大鼠阿霉素心肌病中的表达及其意义

目的探讨自噬基因Beclin-1及微管相关蛋白LC3在大鼠阿霉素心肌病中的表达及其意义,初步证实自体吞噬(autophagy)参与了大鼠阿霉素心肌病的发病,并探讨其机制。方法雄性SD大鼠45只,随机分为3组,阿霉素(ADR)组、阿霉素(ADR)+3-甲基腺嘌呤(3-MA)组和对照组。建立大鼠阿霉素心肌病模型,电镜观察自噬体形态及数量,检测心肌组织中Beclin-1含量及LC3含量。结果ADR组大鼠心肌组织自噬体的数量较对照组及ADR+3-MA组增多;ADR组心肌组织中Beclin-1水平及LC3含量均较对照组及ADR+3-MA组增高。结论自噬性程序性细胞死亡参与了阿霉素心肌病的发病。     

降钙素基因相关肽调控细胞外信号调节激酶减轻高体积分数氧对胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的损伤作用

目的 探讨降钙素基因相关肽(CGRP)对高体积分数氧(高氧)暴露下胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞( AECⅡ)氧化损伤的影响,及其作用是否由细胞外信号调节激酶(ERK)所介导.方法 原代分离培养孕21 d胎鼠AECⅡ,培养12 h待细胞贴壁后分为6组:空气组、空气CGRP组、空气CGRP拮抗剂组、高氧组、高氧CGRP组、高氧CGRP拮抗剂组.空气组和高氧组分别在氧体积分数为210 mL·L-1的空气或850 mL·L-1的氧气中培养18 h.CGRP组和CGRP拮抗剂组分别在空气或高氧暴露前加入CGRP或同时加入CGRP和其受体拮抗剂CGRPS-37,终浓度分别为10-8 mol·L-1和10-7 mol·L-1.用免疫比浊法测定培养液LDH、AKP和丙二醛(MDA)水平,流式细胞术测定细胞内活性氧(RoS)水平,荧光显微镜检测胞质表面活性蛋白C(SP-C)的表达情况,Western blot检测磷酸化ERK1,2(p-ERK1/2)的表达水平.结果 高氧组MDA、LDH、AKP、ROS及p-ERK1/2水平均明显高于空气组[(2.29±0.10) μmol ·L-1 vs (1.06 ±0.14)μmol·L-1,( 58.79±5.01)U·L-1 vs(25.92±3.68)U·L-1,(24.63±2.92)U·L-1 vs (10.34±1.78)U·L-1,47.74±3.35 vs 25.96±5.04,1.21±0.06 vs 0.45±0.05,Pa＜0.01],而细胞内SP-C表达则明显低于空气组(22.75±3.31 vs 43.50±4.42);与高氧组及高氧CGRP拮抗剂组比较,高氧CGRP组MDA、LDH、ROS及AKP水平显著降低,而p-ERK1/2及SP-C的表达水平则明显增高(Pa＜0.01).空气组、空气CGRP组、空气CGRP拮抗剂组组间MDA、LDH、ROS、AKP及SP-C表达水平比较差异均无统计学意义;空气CGRP组p-ERK1/2表达水平明显高于空气组及空气CGRP拮抗剂组(Pa＜0.01).结论 CGRP可减轻高氧对AECⅡ的氧化损伤,其作用机制可能是通过ERK的活化来介导.     

牛初乳短链胰岛素样生长因子对脂蛋白(a)诱导的肾小球系膜细胞增生与转化生长因子-β1表达的影响

目的探讨牛初乳短链胰岛素样生长因子(Bct-IGF)对脂蛋白(a)[Lp(a)]诱导的肾小球系膜细胞(GMCs)增生与转化生长因子-β1(TGF-β1)表达的影响。方法将GMCs分为6组培养:对照组,Lp(a)组和不同浓度的Bct-IGF组,后5组培养时均加入5.0 mg.L-1Lp(a),后4组培养时分别加入100μg.L-1、200μg.L-1、400μg.L-1、800μg.L-1Bct-IGF。利用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞增殖率,末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)测定GMCs凋亡率;ELISA法测定培养上清TGF-β1水平,反转录-PCR法检测TGF-β1 mRNA表达。结果与400μg.L-1Bct-IGF组比较,Lp(a)组、100μg.L-1Bct-IGF组、200μg.L-1Bct-IGF组GMCs细胞增殖率均明显增高,差异有统计学意义(Pa<0.05);800μg.L-1Bct-IGF组较之降低,但差异无统计学意义(P>0.05)。与400μg.L-1Bct-IGF组比较,LP(a)组、100μg.L-1Bct-IGF组、200μg.L-1Bct-IGF组GMCs细胞凋亡率均明显降低,差异有统计学意义(Pa<0.05);800μg.L-1Bct-IGF组较之增高,但差异无统计学意义(P>0.05)。Lp(a)组培养上清中TGF-β1水平显著高于400μg.L-1Bct-IGF组(P<0.01);Lp(a)组培养细胞TGF-β1 mRNA表达显著高于400μg.L-1Bct-IGF组(P<0.01)。结论 Lp(a)可以促进GMCs增生及TGF-β1的过表达,Bct-IGF可以抑制Lp(a)诱导的GMCs的异常增生,促进Lp(a)诱导的GMCs的凋亡。     

B7同源体3经Toll样受体2依赖性机制增强肺炎链球菌脑膜炎小鼠的炎性反应和病理损伤

目的 探讨B7同源体3(B7 - H3)对肺炎链球菌(SP)脑膜炎大鼠的炎性反应和血脑屏障完整性的影响及其机制.方法 经小鼠侧脑室穿刺注入SP悬液,制备脑膜炎模型.野生型鼠分5组,分别为PBS组、SP组、SP+B7 -H3组、SP+同型单抗组、SP+B7 - H3阻断性单抗组.Toll样受体2基因剔除(TLR2-KO)鼠分3组:PBS组、SP组、SP+ B7 - H3蛋白组.术后6h、18h、30 h,麻醉其下眼眶采血法收集血清,取脑组织,制备脑组织匀浆.ELISA检测其血清TNF-α、IL-6、IL-1β和单核细胞趋化因子蛋白-1(MCP-1)水平以及脑组织匀浆中血清蛋白( Albumin)和IgG水平.结果 1.ELISA检测野生型鼠血清SP组、SP+ B7 - H3组注射18 h后TNF-α、IL-6和MCP-1的表达及30 h后TNF-α、IL-6、IL-1β和MCP-1的表达均较PBS组显著升高(Pa＜0.05);SP+同型单抗组与SP组比较,各时间点各炎性因子的表达差异均无统计学意义(Pa＞0.05);SP +B7- H3组注射18h后MCP-1的表达及30 h后TNF-α和IL-6表达均显著高于SP组[(42.010±3.883) ng·L-1vs(29.620±3.830) ng· L-1;(37.550±3.232)ng· L-1vs (24.570±2.377) ng·L-1;(66.160±5.766) ng·L-1vs (48.630±4.418) ng·L-1,Pa＜0.05];SP+ B7 - H3阻断性单抗组注射30h后,TNF-α和IL-6的表达均显著低于SP组[(18.680±1.798) ng·L-1vs(24.570±2.377) ng·L-1;( 37.180±3.150) ng·L- 1vs (48.630±4.418) ng· L-1,Pa＜0.05].2.ELISA检测脑组织匀浆:SP组、SP+ B7 - H3组注射18h、30h后Albumin、IgG的表达较PBS组均显著升高(Pa＜0.05);SP+同型单抗组与SP组比较,各时间点Albumin、IgG的表达差异均无统计学意义(Pa＞0.05);SP+ B7 - H3组注射18 h、30 h后脑组织匀浆Albumin的表达及30 h后脑组织匀浆IgG的表达均显著高于SP组[(59.090±4.184) μg· g-1vs ( 35.450±4.256) μg·g-1;( 59.890±4.701)μg·g-1 vs (43.790±3.508) μg·g-1;(36.220±2.775)μg·g-1 vs(25.440±2.620)μg·g-1,Pa＜0.05].3.SP+ B7 - H3阻断性单抗组注射后18 h、30 h Albumin的表达及30 h IgG的表达显著低于SP组[(20.590±1.720) μg·g-1vs(35.450±4.256) μg·g-1;(28.650±3.063) μg· g-1vs(43.790±3.508)μg·g-1;(17.380±1.595) μg·g-1vs(25.440±2.620) μg·g-1,Pa＜0.05].3.TLR2-KO鼠血清和脑组织匀浆的ELISA检测显示:SP +B7-H3组较SP组各监测指标的表达在任何时间点的差异均无统计学意义(Pa＞0.05).结论 B7 - H3通过TLR2依赖性机制促进SP诱导的脑膜炎小鼠的炎性反应和血脑屏障的破坏.     

硫化氢抑制氧化型低密度脂蛋白诱导的人巨噬细胞单核细胞趋化蛋白-1分泌的作用

目的研究气体信号分子硫化氢(H2S)对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的人单核细胞白血病细胞(THP-1)来源的人巨噬细胞单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)分泌的影响。方法将THP-1来源的人巨噬细胞分为4组:正常对照组、ox-LDL组、ox-LDL+H2S 100组及ox-LDL+H2S 500组。正常对照组:细胞于基础培养基中培养48 h;ox-LDL组:在基础培养基中加入50 mg.L-1ox-LDL,培养48 h;ox-LDL+H2S 100组在基础培养基中先加入100μmol.L-1NaHS,孵育30 min后再加入50 mg.L-1ox-LDL,培养48 h;ox-LDL+H2S 500组在基础培养基中先加入500μmol.L-1NaHS,孵育30 min后再加入50 mg.L-1ox-LDL,培养48 h。用ELISA法检测细胞上清液中MCP-1水平。结果与正常对照组[(34.58±6.77)μmol.L-1]比较,ox-LDL组[(66.27±7.29)μmol.L-1]、ox-LDL+H2S 100组[(49.45±3.08)μmol.L-1]及ox-LDL+H2S 500组[(46.64±5.47)μmol.L-1]细胞上清液中MCP-1水平均明显升高(Pa<0.05);与ox-LDL组比较,ox-LDL+H2S 100组及ox-LDL+H2S 500组细胞上清液中MCP-1水平均明显降低(Pa<0.05)。ox-LDL+H2S 100组细胞上清液中MCP-1水平与ox-LDL+H2S 500组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论ox-LDL可诱导人巨噬细胞MCP-1分泌增加;给予外源性H2S的供体NaHS可明显抑制ox-LDL诱导的MCP-1分泌增加。     

脂多糖干预小胶质细胞后细胞内促血小板生成素与炎症因子的表达

目的 探讨脂多糖(LPS)干预小胶质细胞后细胞内促血小板生成素(TPO)及炎症因子的表达.方法将BV2细胞分为6组.1.空白12 h组:BV2细胞正常培养12 h,不添加任何干预因素;2.LPS 0.5 mg·L-1 12 h组:在培养好的BV2细胞内添加预先配好的LPS溶液共同培养12 h,并使其终质量浓度为0.5 mg·L-1;3.LPS 1.0 mg·L-112 h组:在培养好的BV2细胞内添加预先配好的LPS溶液共同培养12 h,并使其终质量浓度为1.0 mg·L-1;4.空白 24 h组:BV2细胞正常培养24 h,不添加任何干预因素;5.LPS 0.5 mg·L-1 24 h组:在培养好的BV2细胞内添加预先配好的LPS溶液共同培养24 h,并使其终质量浓度为0.5 mg·L-1;6.LPS 1.0 mg·L-1 24 h组:在培养好的BV2细胞内添加预先配好的LPS溶液共同培养24 h,并使其终质量浓度为1.0 mg·L-1.采用ELISA法检测BV2细胞内炎症因子(IL-1、IL-6、NF-κB)和TPO的表达;实时荧光定量PCR法检测细胞内IL-1 mRNA、IL-6 mRNA、NF-κB mRNA及TPO mRNA表达水平.结果 LPS 0.5 mg·L-1和1.0 mg·L-1干预BV2细胞后12 h和24 h,IL-1、IL-6、NF-κB和TPO表达水平及其mRNA水平均较空白组升高,且12 h组高于24 h组,但其差异均无统计学意义(Pa>0.05).TPO表达水平与IL-1、IL-6、NF-κB及其mRNA水平的表达均呈显著正相关(Pa<0.01).结论 LPS干预小胶质细胞后IL-1、IL-6、NF-κB和TPO表达升高,参与炎症、凋亡和神经元保护等多种调控机制.     

辛伐他汀治疗难治性肾病综合征患儿高脂血症的疗效

目的 观察辛伐他汀治疗难治性肾病综合征(RNS)患儿高脂血症的疗效及其对预后的影响.方法 对在本科住院的27例RNS患儿应用辛伐他汀(年龄<10岁,0.3 mg·kg<'-1>·d<'-1>;≥10岁,10 mg·d<'-1>)降脂治疗2周,检测其治疗前后血清总胆同醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、极低密度脂蛋白(VLDL)、PLT、ALT、SCr变化,并观察其临床不良反应情况.结果 辛伐他汀干预前,TC为(10.68±4.23)mmol·L<'-1>、PLT为(155.21±34.43)×10<'9>L<'-1>、HDL为(1.46±0.61)mmol·L<'-1>、VLDL为(2.47±1.31)mmol·L<'-1>、LDL为(6.74±3.96)mmol·L<'-1>、TG为(4.56±1.83)mmol·L<'-1>、ALT为(24.11±6.15)IU·L<'-1>、SCr为(91.32±6.15)μmol·L<'-1>.辛伐他汀干预1周后代为(9.36±3.46)mmol·L<'-1>,与干预前比较,差异有统计学意义(P<0.05),PLT为(123.34±31.32)×10<'9>L<'-1>、TG为(3.03±0.74)mmol·L<'-1>、VLDL为(1.36±0.33)mmol·L<'-1>、LDL为(6.21±3.21)mmol·L<'-1>、HDL为(1.82±0.90)mmol·L<'-1>、ALT为(25.32±4.14)IU·L<'-1>、SCr为(94.54±6.43)μmol·L<'-1>,与干预前比较,差异均无统计学意义(P<,a>>0.05).辛伐他汀干预2周后TC为(7.28±2.01)mmol·L<'-1>、PLT为(86.65±34.23)×10<'9>L<'-1>、TG为(2.36±1.16)mmol·L<'-1>、VLDL为(1.25±0.99)mmol·L<'-1>、LDL为(4.21±2.01)mmol·L<'-1>、HDL为(2.23±0.93)mmol·L<'-1>,与干预前比较,差异均有统计学意义(P<,a><0.05),ALT为(25.31±5.14)IU·L<'-1>、SCr为(94.53±6.23)μmol·L<'-1>,与干预前比较差异均无统计学意义(P<,a>>0.05).2例患儿服药后出现胃肠不适、1例患儿出现一过性ALT升高.该3例患儿停用辛伐他汀1周后均恢复正常,无其他不良反应.结论 辛伐他汀干预能使RNS高脂血症缓解,其高凝状态亦明显改善,并能够使病情缓解,改善预后,同时无明显不良反应.     

尿酸上调肾小管上皮细胞还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酶蛋白水平对肾小管上皮细胞凋亡的影响

目的 观察不同水平尿酸对体外培养的肾小管上皮细胞还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)及活性氧簇(ROS)的影响,探讨尿酸损害肾小管上皮细胞的可能机制.方法 分离肾小管上皮细胞,将其分为对照组与尿酸干预组(尿酸干预组又分0.1、0.2、0.4、0.8 mmol·L<'1>4个亚组),每组重复6孔;紫外分光光度法测定肾小管上皮细胞内NADPH蛋白水平;光泽精化学发光法测定肾小管上皮细胞内超氧阴离子(O<,2>)生成量;脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)与琼脂糖凝胶电泳法检测肾小管上皮细胞凋亡.结果 24 h后,0.1 mmol·L<'1>尿酸干预组NADPH酶蛋白水平与O<,2>生成量较对照组仅轻微增高,0.2、0.4、0.8 mmol·L<'1>尿酸干预组NADPH酶蛋白水平与O<,2>生成量均较对照组显著增高(P<,a><0.01).对照组细胞均未形成明显的DNA凋亡梯带,0.1、0.2、0.4、0.8 mmol·L<'-1>尿酸干预组均可见明显的DNA凋亡梯带,0.4、0.8 mmol·L<'-1>尿酸干预组DNA凋亡梯带较0.1、0.2 mmol·L<'-1>尿酸干预组更为明显.TUNEL结果显示:对照组,0.1、0.2、0.4、0.8 mmol·L<'-1>尿酸干预组的凋亡率分别为(17.5±1.0)‰、(72.4±12.4)‰、(136.8±13.4)‰、(328.7±32.6)‰、(427.2±51.5)‰,0.1、0.2、0.4、0.8 mmoi·L<'-1>尿酸干预组细胞凋亡率均明显高于对照组(P<,a><0.01),各尿酸干预组之间细胞凋亡率随着尿酸干预浓度的增高而增高;相关分析发现肾小管上皮细胞凋亡率与肾小管上皮细胞内NADPH酶蛋白水平及O<,2>生成量呈显著正相关(r=0.765、0.792,P<,a><0.01).结论 肾小管上皮细胞在持续高尿酸的作用下,可激活细胞内NADPH酶蛋白表达,释放O<,2>,启动氧化应激级联反应,使肾小管上皮细胞持续受损而导致肾小管上皮细胞凋亡增加.     

高胆红素血症早产儿血清胰岛素样生长因子-1水平的变化及其临床意义

目的 探讨高胆红素血症(高胆)早产儿血清胰岛素样生长因子-1(IGF-1)水平的变化及其临床意义.方法 应用电化学发光免疫法检测64例高胆早产儿(实验组)和20例非高胆早产儿(对照组)血清IGF-1、神经元烯醇化酶(NSE)水平,同步测定其血清总胆红素(TSB)水平,并比较组间IGF-1、NSE、TSB水平的差异及其相关性.高胆组按TSB170～256μmol·L-1,257～342μmol·L-1,＞342μmol ·L-1分为轻、中、重3组.结果 轻、中、重高胆早产儿血清IGF-1水平分别为(25.38±5.42)μg·L-1、(21.77±8.65)μg·L-1、(18.34±4.05)μg·L-1,较对照组[(27.14±3.72)μg·L-1]明显降低,轻、中、重高胆组间IGF-1水平存在统计学差异(Pa＜0.01),其值随着胆红素水平变化而变化;高胆组NSE水平分别为(25.01±2.26)μg·L-1、(30.45±2.74)μg·L-1、(33.76±5.02)μg·L-1,明显高于对照组[(11.14±4.68)μg·L-1](P＜0.01),各组间差异均有统计学意义(Pa＜0.01);血清IGF-1水平与TSB、NSE均呈负相关(r=-0.562、-0.503,Pa＜0.01).结论 IGF-1与高胆早产儿的预后密切相关,可作为判断高胆早产儿是否存在脑损伤的生化指标之一.