TNNT3(R69H)突变转基因小鼠模型的建立

目的 建立TNNT3(R69H)突变转基因小鼠模型.方法 构建pEGFP-TNNT3(R69H)转基因构件,通过原核显微注射方法将线性化、纯化后的外源质粒pEGFP-TNNT3(R69H)注射入BDF1小鼠受精卵中,胚胎移植至同期发情的假孕受体母鼠输卵管内,获得子代小鼠.用PCR和Southern blot方法检测子代鼠尾基因组DNA,通过RT-PCR及Western blot的方法检测TNNT3基因表达.结果 8只假孕小鼠共移植注射后的胚胎82枚,出生40只子代鼠,经PCR和Southern方法检测得到5只转基因阳性小鼠.对其子代小鼠进行RT-PCR、Western blot检测结果显示,TNNT3在转基因小鼠心脏和骨骼肌中表达量明显增多.结论 通过显微注射法使外源基因pEGFP-TNNT3(R69H)在小鼠基因组中整合,成功建立了TNNT3(R69H)突变转基因小鼠模型.     

BIGH3R555w突变转基因小鼠模型的建立

目的建立BIGH3R555w突变转基因角膜营养不良小鼠模型。方法构建以磷酸甘油酸激酶（phosphoglyceratekinase,PGK）为启动子的BIGH3（M）-IRES-EGFP重组质粒载体,通过原核显微注射方法将线性化、纯化后的外源质粒注射入C57小鼠受精卵中,胚胎移植入假孕受体母鼠输卵管内,获得子代小鼠。用PCR方法检测子代鼠尾基因组DNA,通过RT—PCR及Western印迹法检测BIGH3基因表达。结果8只假孕小鼠共移植注射后的胚胎84枚,出生35只子代鼠,经PCR检测得到4只转基因阳性小鼠。RT—PCR和Westem印迹法检测结果显示,BIGH3R555w在转基因小鼠角膜表达量明显增多。结论通过显微注射法使外源基因B1GH3555w突变体在小鼠基因组中整合,成功建立了BIGH3突变转基因小鼠模型,该模型可为今后进一步研究角膜营养不良疾病的发病机制提供依据。     

TNNI2突变转基因小鼠模型的建立

目的建立TNNI2突变转基因小鼠模型。方法构建pEGFP-tnni2转基因构件,TNNI2基因的第175个氨基酸缺失,通过原核显微注射法。把线性化、纯化后的外源基因pEGFP-tnni2注射入BDF1小鼠受精卵中。胚胎移植给同期发情的假孕受体母鼠,获得子代小鼠。用PCR和Southern方法检测子代鼠尾DNA鉴定基因型。通过RT-PCR方法检测tnni2基因表达。结果移植注射胚胎115枚给4只假孕小鼠共出生了23只后代鼠。经PCR和Southern方法检测得到4只阳性小鼠。对其子代进行RT-PCR检测,tnni2基因在肌肉、心脏内表达。结论通过显微注射法使外源基因pEGFP-tnni2（TNNI2基因的第175个氨基酸缺失）在小鼠基因组中得到整合,建立了转pEGFP-tnni2的转基因小鼠模型。     

钙蛋白酶抑制蛋白转基因小鼠的构建和鉴定

目的 将人的钙蛋白酶抑制蛋白（calpastatin,CAST）外源基因整合到C57BL/6J小鼠中,构建高表达CAST的转基因小鼠模型。方法 利用Gateway技术构建pRP.EX3d-EF1A-CAST-IRES-eGFP载体,回收片段后通过显微注射法将目的基因片段注入到C57BL/6J小鼠受精卵中,将其胚胎移植至同期发情的假孕受体母鼠输卵管内获得子代小鼠。采用PCR方法鉴定出阳性的转基因小鼠,确定首建鼠,通过与C57BL/6J小鼠回交后互交数代建系。利用RT-PCR和Western blotting方法检测CAST基因和蛋白在各组织中的表达情况。结果 将90枚注射受精卵移植到3只假孕鼠中,3只均怀孕,移植成功率100%,产下23只子鼠,经PCR鉴定得到2只转基因阳性首建鼠,阳性率为9%。子代小鼠进行RT-PCR检查显示,CAST基因在转基因小鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑和骨骼肌中均有表达;Western blotting检查显示,CAST蛋白表达在转基因小鼠中显著高于同窝阴性小鼠。结论 通过显微注射法成功构建CAST高表达的转基因小鼠,为进一步研究CAST奠定了良好的模型基础。     

人bcl-xL基因在转基因小鼠中的整合和表达

目的研究人bcl—xL基因在显微注射所产生的子代小鼠中的整合、转录和表达情况。方法采用PCR和Southern blot方法检测人bcl—xL基因在小鼠体内的整合；RT—PCR方法检测它们的bcl—xL mRNA水平；用Western blot及免疫组化法检测目的蛋白的表达情况。结果在显微注射所产生的转基因小鼠中，有4只为Southern blot检测阳性，并且在这4只小鼠及其子代中均检测到人bcl—xL的mRNA和过表达的目的蛋白。结论由于在这些小鼠中既有外源基因的整合，又有其mRNA和蛋白质的表达，所以，它们是真正的转基因动物。     

脑内过表达胰岛素样生长因子结合蛋白-4转基因小鼠的建立

目的构建脑内过表达胰岛素样生长因子结合蛋白-4(insulin-like growth factor binding protein-4,IGFBP-4)的转基因小鼠,以研究IGFBP-4对脑发育的作用。方法构建神经元特异性启动子血小板源性生长因子β链(platelet derived growth factorβchain,PDGF-β)驱动的IGFBP-4表达载体,通过显微注射构建转基因小鼠。用PCR法检测小鼠子代基因组IGFBP-4 c DNA的整合情况,Western blotting法和免疫组织化学法观察IGFBP-4在脑内的表达丰度和分布,比较野生型和转基因小鼠的体质量和脑质量的改变。结果外源IGFBP-4 c DNA稳定整合于转基因小鼠基因组,IGFBP-4蛋白在成年小鼠脑内表达水平升高了267%,脑区IGFBP-4蛋白分布符合PDGF-β启动子驱动的蛋白表达特征,与野生型小鼠IGFBP-4部位相似。转基因小鼠体质量未见明显改变,整脑质量增加了8.4%(P<0.05),其中脑干增加了16.5%(P<0.05),其余脑区改变不明显。结论外源IGFBP-4转基因在小鼠基因组中得到整合并能稳定遗传和表达,并影响了部分脑区的发育,为脑发育研究提供了有价值的动物模型。     

高表达人源Her2乳腺癌小鼠模型的建立及鉴定

目的 构建并鉴定高表达人源Her2乳腺癌转基因小鼠模型.方法 构建pMD18T-MMTV-huHER2-EGFP转基因构件,通过原核显微注射方法将线性化、纯化后的外源质粒pMD18T-MMTV-huHER2-EGFP注射入C57BL/6J小鼠受精卵中,胚胎移植至同期发情的假孕受体母鼠输卵管内,获得子代小鼠.采用PCR鉴定子代小鼠尾部组织基因组DNA,用蛋白质免疫印迹法检测乳腺组织Her2蛋白的表达,通过组织病理学切片观察转基因小鼠乳腺组织的病理学变化.结果 经PCR方法检测得到转基因阳性小鼠.蛋白质免疫印迹结果显示,与野生型小鼠相比,F2代阳性小鼠的乳腺组织中Her2蛋白高表达.病理组织切片表明25周龄阳性小鼠的乳腺组织已经出现明显的癌变倾向.结论 高表达人源Her2乳腺癌小鼠模型成功建立并能稳定遗传,可自发形成乳腺癌,其生物学特性和病理学改变与人乳腺癌相近,可作为研究乳腺癌发生发展的动物模型.     

Nestin转基因小鼠模型的建立及nestin基因在器官中的表达

目的构建人nestin基因表达载体,制备nestin过表达转基因小鼠。方法以人神经胶质瘤细胞株U251的cDNA为模板,分
3段扩增出nestin基因cDNA全序列,并将其克隆入含有强启动子ROSA26的pBROAD3载体,酶切鉴定、测序,除去原核序列,
纯化。显微原核注射建立转基因小鼠。PCR验证nestin基因整合,确定建立首建者。将阳性鼠传代。Western blot方法检测F3
代转基因小鼠与野生型小鼠主要器官（心、肺、脑、肾）的nestin 表达。结果测序结果证明成功构建了受ROSA26启动子调控的
nestin转基因载体。出生34只小鼠,PCR检测证实存在首建者2只。Western blot方法证实,与野生型小鼠相比,F3代转基因小
鼠脑、肺组织存在较高水平nestin 表达。结论首次成功建立nestin过表达转基因小鼠,外源基因可遗传到子代并在脑和肺组织
中稳定表达,为深入研究nestin在肿瘤转移、细胞“干性”的维持和细胞的分化等功能提供了良好的实验动物模型。
     

绿色荧光蛋白转基因小鼠模型的建立及胚胎冷冻保种

目的建立绿色荧光蛋白转基因小鼠模型，并采取胚胎冷冻的方法进行保种。方法通过原核显微注射法，把线性化、纯化后的外源基因pEGFP注射入BDF1小鼠受精卵中，胚胎移植给同期发情的假孕受体母鼠，获得子代小鼠。经鉴定对有表达的转基因鼠进行胚胎冷冻保种。结果移植注射胚胎385枚给30只假孕小鼠共出生了306只后代鼠，经PCR和southern blot检测得到5只阳性小鼠。F2代转基因鼠胚胎冷冻240枚胚胎。结论通过显微注射法使外源基因pEGFP在小鼠基因组中得到整合，建立了转pEGFP的转基因小鼠模型。     

CLCN3/MMTV-PyMT转基因小鼠杂交群体的建立及鉴定

目的 建立并鉴定CLCN3/MMTV-PyMT双转基因小鼠杂交群体,构建氯通道ClC-3过表达的自发乳腺肿瘤转基因小鼠模型.方法 将CLCN3转基因小鼠和MMTV-PyMT转基因小鼠分别进行繁殖,选取阳性子代鼠进行配对,培育杂交后代,然后通过PCR鉴定基因型、通过组织免疫荧光方法、Western blot检测转基因小鼠蛋白表达情况.结果 成功繁育CLCN3转基因小鼠和MMTV-PyMT转基因小鼠,经PCR鉴定成功构建CLCN3/MMTV-PyMT双转基因鼠杂交群体,并成功保种和扩群,经组织免疫荧光和Western-blot分析双转基因小鼠的ClC-3蛋白的表达高于MMTV-PyMT转基因小鼠.结论 成功构建ClC-3过表达的自发乳腺肿瘤转基因小鼠模型,为进一步研究ClC-3在肿瘤生长和转移中的功能提供了良好的动物模型.     

肝脏特异性可调控丙型肝炎病毒核心蛋白表达的转基因小鼠模型的建立

 【目的】制备TRE-HCV-C转基因小鼠，为四环素调控系统的体内研究提供了反应部分的转基因小鼠。以便与本实验室同时建立的调控部分的小鼠共同作用，为进一步建立双转基因小鼠模型奠定基础，更为丙型肝炎病毒核心蛋白（HCV-C）的发病机制的研究提供一个实用方便的模型。【方法】重组构建含有目的基因HCV-C、TRE序列和SV40polyA的转基因载体pTRE-HCV-C．以显微注射的方法将l_153kb的转基因片段注人BALB／C母鼠的受精卵．出生动物及其后代经PCR初步筛选出阳性．再经Southern杂交对阳性鼠基因组DNA标本行进一步鉴定。用转基因阳性小鼠和整合有肝脏特异性启动子ApoE和胛A基因的另一品系转基因小鼠杂交，得到子代F1小鼠，通过免疫组织化学来初步检测HCV-C在肝脏中特异性的可调控性的表达。【结果】产生了5只整合有TRE-HCV-C基因的首建鼠，以及它的子代也带有此基因。与基因组上整合有肝脏特异性启动子ApoE和rtTA基因的转基因小鼠杂交后，得到子代F1小鼠。特定时问与DOX作用后，小鼠肝脏的免疫组织化学结果表明，TRE-HCV-C小鼠为丙型肝炎病毒核心蛋白的发病机制研究提供了一个良好的动物模型工具。【结论】成功制备了HCV-C转基因小鼠，可利用四环素调控系统来研究HCV中的C基因对小鼠的作用，为进一步建立四环素调控系统调控下表达HCV-C基因双转基因小鼠模型奠定基础．也是HCV-C基因功能研究及与肝细胞癌的关系的机制研究的一个有用工具。     

Bcl-2高表达小鼠模型的建立

目的 建立Bcl-2高表达的转基因小鼠品系,为在活体动物上研究bcl-2蛋白的功能提供动物模型.方法 构建含人Bcl-2基因的质粒;通过显微注射将该质粒转入C57BL/6J×CBA的杂交小鼠的受精卵,并植入假孕母鼠的子宫,PCR检测后携带人Bcl-2基因的小鼠即为“Founder”鼠;将“Founder”鼠与C57BL/6J×CBA杂交小鼠不断回交,经PCR和Western bilotting筛选后即可获得阳性小鼠.结果 共获得5只“Founder”鼠,其中#6、#14成功建系,连续回交繁殖7代后,PCR和Western筛选后获得bcl-2高表达阳性小鼠42只.结论 成功将人bcl-2基因转入小鼠基因组内,并稳定传代,建立Bcl-2高表达小鼠,为进一步研究Bcl-2蛋白提供了很好的动物模型.     

人可诱导共刺激分子胞外片段和小鼠免疫球蛋白Ig融合基因的表达及生物学活性鉴定

目的:探讨用基因工程方法表达的人可诱导共刺激分子(ICOS)与小鼠免疫球蛋白的融合蛋白竞争抑制ICOSB7RP1共剌激通路的作用.方法:以RT-PCR方法克隆编码人ICOS胞外片段,与编码小鼠免疫球蛋白IgG恒定片段(Ig)的基因融合,构建携带融合基因的高效真核表达载体pcDNA4/HisMAX A-ICOS-Ig.采用脂质体法转染CHO细胞,用Western 印迹法检测稳定表达细胞中融合基因的表达,流式细胞术检测重组蛋白的配体结合活性.以适当浓度的重组融合蛋白作为拮抗剂与BALB/c和C57BL小鼠脾单个核细胞进行混合培养,观察重组蛋白在体外抑制淋巴细胞增殖的效果.结果:构建了携带融合基因的高效真核表达载体pcDNA4/HisMAX A-ICOS-Ig;Western印迹法检测表明转染细胞有重组蛋白的表达;流式细胞术分析显示重组蛋白有配体表达细胞的结合活性;该重组融合蛋白作为拮抗剂可体外抑制混合淋巴细胞增殖.结论:构建并成功表达了ICOS-Ig融合基因高效真核表达载体;该重组蛋白具有配体结合活性,可在体外通过抑制ICOS-B7RP1共刺激通路抑制淋巴细胞增殖.     

胰岛素样生长因子结合蛋白4转基因小鼠脑内细胞分化的研究

目的 研究神经元特异性启动子血小板源性生长因子-β（platelet derived growth factor-β, PDGF-β）介导的胰岛素样生长因子结合蛋白4（insulin-like growth factor binding protein 4,IGFBP4）转基因小鼠脑内神经元和神经胶质细胞分化情况。方法 PCR扩增并测序鉴定PDGF-β启动子和IGFBP4 cDNA表达框的整合,Isotropic Fractionator细胞计数法分析海马少突胶质前体细胞比例,Western blotting法分析生后28 d小鼠海马等部位神经元和神经胶质细胞的分化、胰岛素样生长因子-1（insulin-like factor-1, IGF-1）受体通路激活以及细胞存活相关分子表达, Rotarod实验观察小鼠运动能力。结果 IGFBP4 cDNA稳定整合于小鼠基因组,转基因小鼠海马少突胶质前体细胞数目和成熟细胞髓磷脂碱性蛋白（myelin basic protein, MBP）均明显增多,神经元和星形胶质细胞标志物NeuN和胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）表达改变不明显;Erk1, 2和Akt磷酸化升高,p38的激活不明显;Caspase-3表达下调,β-catenin和Bcl-2表达无明显改变,12月龄小鼠Rotarod运动能力明显增强,其小脑和皮质NeuN表达增多。结论 神经元过表达IGFBP4促进小鼠脑少突胶质细胞和神经元的分化。     

乙型肝炎病毒核心基因转基因小鼠的建立

目的：建立乙型肝炎病毒核心基因转基因小鼠。方法：构建乙型肝炎病毒核心基因真核表达载体pcDNA3-HBc;采用显微注射法将线性化的表达载体注射至小鼠受精卵的雄性原核巾,然后将注射存活的受精卵植入假孕母鼠的输卵管;取其产10d龄子代鼠进行鉴定。结果与结论：表达载体内切酶酶切及序列分析结果与预期一致;PCR鉴定转基因阳性小鼠比例为25％(6／24)。可表达核心蛋白基因的转基因小鼠成功建立。     

突变靶基因xylE转基因小鼠

本研究以ｐＥＳｎｘ穿梭质粒为载体，选用恶臭假单孢杆菌ＴＯＬ质粒上的ｘｙｌＥ基因作为突变靶基因组构建的重组构件，经微注射导入ＩＣＲ小鼠５４９枚受精卵雄原核，将存活的３５２枚卵移入２４只假孕鼠输卵管内，７只妊娠，共产仔４１只，其中７只死胎，出生后死亡４只，３０只存活。注射卵存活率为６４％（３５２／５４９），出生率为１１．６％（４１／３５２）。存活鼠经ＰＣＲ－Ｓｏｕｔｈｅｒｎ检测，整合率为５７％（１７／３０）。在整合阳性鼠中选择了杂交信号较强的２只当代公鼠，通过回收载体和转化试验，结果表明整合基因完整，具有转化的功能，由此，建立了突变靶基因ｘｙｌＥ转基因小鼠模型。