基因芯片检测7种常见腹泻病致病菌方法研究

目的 建立运用多重PCR和基因芯片技术一次检测腹泻病粪便同一标本中7种常见致病菌的方法。方法 筛选7种常见腹泻病致病菌的特异基因作为检测目的基因,并据此设计引物及探针,制备相应的寡核苷酸芯片,检测了标准菌株, 并直接检测腹泻病粪便标本64份。结果 以多重PCR扩增出7种腹泻病致病菌特异的致病基因片段,并与基因芯片相应的探针杂交。最低检测菌数为10到100cfu/ml。64份腹泻病粪便标本检测出45份致病菌。其中33份志贺菌、12份副溶血弧菌。敏感性高于粪便培养方法。结论 该基因芯片直接检测腹泻病致病菌,具有较高的敏感性和特异性,达到了高通量即高效的检测目的,具有较好的实用性。     

应用16S rDNA克隆文库筛查腹泻病暴发病原体及特异毒力基因验证

目的以16S rDNA克隆文库筛查某地腹泻病暴发的病原体,并验证筛查结果的可靠性。方法收集12份暴发期内腹泻患者的粪便标本,抽提粪便中总细菌基因组,随机抽取3例患者,应用中国传染病预防控制国家重点实验室建立的16S rDNA克隆文库方法筛查可能的致腹泻病原菌,根据筛查结果,设计致腹泻病原菌特异性毒力基因的引物进行PCR验证,同时对其它9份粪便标本进行该致病菌的PCR检测,根据致病菌的检出比例,确定可能导致本次腹泻病暴发的病原体。结果用16S rDNA克隆文库在3例患者标本中筛查到2例可能存在志贺菌或大肠杆菌,用针对志贺菌的特异性毒力基因ipaH对该2例患者标本进行PCR检测为阳性。在其它9例腹泻患者粪便标本中6例检测到志贺菌,志贺菌在腹泻病例中的总检出率为66.7%(8/12)。16S rDNA克隆文库筛查结果与志贺菌ipaH基因的验证结果均显示,3号病例的志贺细菌基因组在粪便总细菌基因组中所占的比例比2号病例高,两种检测结果具有一致性。结论志贺菌可能是导致某地本次腹泻病暴发的主要病原体。16S rDNA基因克隆文库法能快速筛查到可能的病原菌,其筛查结果比较可靠,因此,该方法对于不明原因疾病暴发流行的病原体筛查具有指导作用。     

基因芯片检测肠道致病菌技术的建立和应用

目的 快速、准确地检测水中存在的肠道致病菌。方法 采用基因芯片技术对水中常见肠道致病菌进行检测和鉴定，包括检测靶基冈的扩增、基因芯片的制备、杂交反应和杂交结果的检测与分析四个步骤。结果 应用基因芯片对涉及9个菌属的143株致病菌在相同的条件下进行了杂交检测，得到菌属(科)特异性的杂交图谱，从而达到对细菌进行检测鉴定的目的。结论 制备的基因芯片能够同时检测沙门菌属、志贺菌属、埃希菌属、葡萄球菌属、变形杆菌属的细菌以及小肠结肠炎耶尔森菌、副溶血性弧菌等。     

婴幼儿腹泻粪便标本菌群的16S rDNA PCR-DGGE分析

目的探讨DGGE技术对常见肠道病原菌的区分能力及腹泻病人粪便标本中的菌群组成和变化情况。方法采用细菌的16S rDNAV3区通用引物,以常见肠道病原菌的染色体和腹泻病人粪便标本中的总DNA为模板,PCR扩增后进行DGGE分析及优势条带的序列分析。结果6份粪便标本的DGGE图谱均表现为高度多态性,不同标本之间优势带型存在很大的差异。序列分析显示每份粪便标本中的DGGE优势带型由不同的细菌组成,而且其中非可培养细菌占较大比例,恢复期病人的粪便标本中双歧杆菌和/或乳杆菌成为优势菌型。结论PCR-DGGE能够有效区分不同种属的常见肠道病原菌,技术可为常规的病原菌分离培养方法提供补充,用于腹泻粪便标本的菌群分析,为疾病诊断提供线索。     

新疆维吾尔族长寿老人肠道菌群多样性分析

目的分析新疆维吾尔族长寿老人肠道菌群多样性,比较肠道微生物种群的差异,以求找到肠内某些与健康有重要关系的有益菌。方法采用不依赖分离培养的16SrDNA的PCR-DGGE基因指纹技术,对新疆维吾尔族长寿老人肠道细菌进行检测。结果13份粪便标本肠道菌群总DNA均扩增出16S rDNA,大小约470bp;DGGE显示每种样品条带数目、亮度及位置不同,聚类分析显示不同个体粪便标本的细菌组成差异性非常大。结论新疆维吾尔族长寿老人肠道菌群具有多样性。基于16S rDNA的PCR-DGGE基因指纹分析可揭示肠道细菌组成的差异。     

常见致病菌23S rRNA基因片段序列分析及其应用初探

目的通过临床常见致病菌23S rRNA基因序列差异的分析，探索建立可同时检测或鉴定多种细菌的分子生物学方法。方法对常见致病菌23S rRNA基因的一个多变区序列进行聚合酶链反应（PCR）扩增和测序分析，根据序列差异设计相应引物和探针，并采用PCR-凝胶电泳分析和PCR-反向杂交技术检测或鉴定临床常见致病菌。结果1.革兰阳性菌和革兰阴性菌间的23S rRNA基因序列存在较大差异，通过PCR扩增和凝胶电泳分析能快速区分待测菌株为革兰阳性菌抑或革兰阴性菌。2.不同菌种间亦存在一定差异，可通过PCR-反向杂交技术将细菌鉴定到种。结论.临床常见致病菌的23S rRNA基因之间存在可供细菌鉴定的序列差异，据此可望建立各种具有快速，灵敏，准确特点的分子生物学方法，为细菌感染的快速病原诊断提供客观依据。     

利用PCR-DGGE技术分析抗生素对小鼠肠道菌群多样性的影响

目的利用PCR-DGGE技术比较不同抗生素对小鼠肠道菌群多样性的影响情况。方法采用细菌的16S rDNA V3区通用引物,以不同抗生素作用后的小鼠和正常对照组小鼠粪便标本中的总DNA为模板,PCR扩增后进行DGGE分析小鼠肠道菌群变化。结果三组粪便标本的DGGE图谱均表现为高度多样性,不同组标本之间DGGE条带的数目和位置表现出明显差异。结论 PCR-DGGE能够有效分析粪便标本菌群的多样性,该技术可作为常规细菌分离培养方法的补充。     

细菌感染患者早期病原学分子诊断技术

目的 建立细菌感染患者早期病原及耐药性分子诊断技术，以便尽早实施有效的抗感染治疗方案，改善患者预后。方法 扩增细菌23S rRNA基因序列，同时扩增多种耐药基因，设计探针，通过基因芯片杂交技术识别其差异序列，鉴别细菌，检测耐药基因，用于病原早期诊断和耐药谱测定；收集血培养标本223份，脑脊液、胸水、腹水标本339份，尿液标本514份，比较所建立方法与传统方法的一致性，验证所建立技术的可靠性。结果 基因诊断方法可正确检出常见病原菌，并检测其是否携带mecA、SHV、CTX-M-1组和CTX-M-2组耐药基因。检测血、尿及脑脊液等无菌体液标本时，所建立的快速检测方法与常规方法的符合率分别为96．4％、99．8％和99．7％，总体符合率为99．1％，耐药性检测与传统药物敏感结果的符合率为95．7％，其准确性与常规方法相当，检测时间比常规方法平均减少（2．09±1．15）d。结论 多重PCR-基因芯片杂交技术可用于耐药菌感染的病原早期诊断和耐药感染的同步检测，应用于临床可望改善患者的预后。     

基因芯片检测常见肠道致病菌感染的研究与评价

目的 建立一种快速准确的方法对引起腹泻的常见肠道致病菌做初步筛查,并对早期治疗和最后诊断起指导作用.方法 培养大肠埃希氏菌、蜡状芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、单核增生性李斯特菌、产气荚膜梭菌、粪肠球菌、志贺菌、伤寒沙门菌、小肠结肠炎耶尔森菌、空肠弯曲菌、副溶血弧菌、艰难梭菌、普通变形杆菌等的标准菌株.根据生物信息学技术设计以16S rBNA序列为靶基因设计各细菌的特异型探针和引物.待测细菌经Cy5标记后的引物以不对称PCR方法扩增后,与固定探针的芯片进行杂交.然后用荧光扫描仪扫描,判定细菌的种类.结果 我们建立的针对16S rRNA序列的基因芯片检测系统能够成功地将14属的细菌鉴定到属.在纯培养物的最低检测浓度为103CFU/mL.结论 我们所建立的基因芯片系统具有高通量和高准确性,可以作为临床鉴定细菌的一个重要的工具.     

16s rDNA序列分析在腹泻粪便标本菌群分析应用

目的应用16s rDNA序列分析方法,对临床实验室没有分离到已知病原菌的腹泻病人粪便标本进行菌群分析,为腹泻病人的病原学诊断提供线索。方法根据细菌16s rDNA保守区序列设计通用引物,以腹泻病人粪便标本中的总DNA为模板,PCR扩增16s rDNA片段。将获得的片段克隆入T载体进行测序,与数据库中发表序列的进行比对,判断标本中细菌的种类和比例;PCR扩增常见的五类致病性大肠杆菌的特征基因应用于排除诊断。结果在3份粪便标本中,大肠杆菌为优势菌群(所占比例分别为84%、65%和81%);其他种群细菌为拟杆菌属(Bacteroides)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)和普雷沃氏菌属(Prevotella)等;实验室常规培养方法没有分离到常见的五类致病性大肠杆菌;PCR扩增没有发现常见的五类致病性大肠杆菌的特征基因。结论引起三例病人腹泻的病原菌可能是一种新的大肠杆菌;16s rDNA序列分析方法可应用于腹泻粪便标本菌群分析,为常规的病原培养方法提供补充,对疾病的诊断提供线索。