Six1基因在肺癌组织表达水平及RNA干扰抑制其表达后对肺癌细胞生物学特性的影响

目的探讨Six1基因在肺癌组织表达及抑制其表达后对肺癌细胞增殖凋亡的影响。方法提取肺癌及癌旁组织蛋白,Western印迹检测Six1的表达; Six1-siRNA转染人肺癌A549细胞,分为空白组和阴性对照组(NC组)、Six1-siRNA组,转染48 h后通过Western印迹检测各组细胞Six1的表达; CCK8检测Six1-siRNA转染A549细胞24～72 h的细胞增殖;流式细胞术检测转染48 h的细胞凋亡率; Western印迹检测增殖相关蛋白细胞增殖核抗原(PCNA)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)家族Bcl-2相关X蛋白(Bax)及Notch1信号通路Notch1和Hes1的蛋白表达。结果 Six1在肺癌组织中的表达显著高于癌旁组织(P<0. 05); Six1-siRNA转染能明显降低A549细胞Six1的表达;与空白组比较,Six1-siRNA组细胞24～72 h的细胞增殖均显著降低,在48 h的细胞凋亡率显著升高,PCNA、Notch1和Hes1蛋白表达均显著降低,Bax蛋白表达显著升高(P<0. 05)。结论 Six1在肺癌组织中高表达,通过RNA干扰抑制其表达可通过下调Notch1信号通路降低肺癌细胞增殖及诱导细胞凋亡,对细胞增殖凋亡的影响方式是下调PCNA和上调Bax蛋白表达。     

斑蝥素诱导人胰腺癌细胞凋亡的实验研究

目的 探讨斑蝥素(Cantharidin)对人胰腺癌细胞凋亡的影响及其作用机制.方法 采用MTT法观察斑蝥素对人胰腺癌细胞株SW1990细胞增殖的抑制作用.采用Hoechst 33258染色、TUNNEL染色、流式细胞术检测细胞凋亡改变,并以RT-PCR和Western blot检测凋亡调节基因p53和Bcl-2、Bax的表达.结果 5μmol/L斑蝥素能明显抑制人胰腺癌SW1990细胞的生长,呈现凋亡特征.RT-PCR和Western blot检测可见Bax、p53基因表达显著增加,而Bc1-2基因表达减少.结论 斑蝥素能诱导人胰腺癌细胞凋亡,其作用可能与上调p53、Bax基因和下调Bcl-2基因有关.     

磷脂酰肌醇蛋白多糖-3对肝癌细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨shRNA干预磷脂酰肌醇蛋白多糖（GPC）-3基因转录对肝癌细胞增殖和凋亡的影响。方法将GPC-3-shRNA插入pGPU6／GFP／Neo质粒,转染人肝癌tlepG2细胞,以Western Blot和荧光定量PCR分别分析GPC-3蛋白和mRNA表达;以nTr法分析HepG2细胞增殖;以流式细胞术、Annexin—V—PE／7-AAD及细胞凋亡-DNA ladder等分析细胞周期及细胞凋亡率。结果shRNA1转染HepG2细胞,GPC-3mRNA沉默效率为89．3％,与GPC-3蛋白下调一致;以shRNA转染HepG2细胞,增殖抑制率为71．1％;细胞周期阻滞在G1期,细胞凋亡率达65．6％。结论资料显示shRNA干预GPC-3基因转录,可显著抑制肝癌细胞增殖,促进肝癌细胞凋亡。     

靶向Pokemon基因shRNA重组质粒的构建及其对HepG2细胞生长的影响

目的:观察携带shRNA的重组质粒对肝癌细胞HepG2增殖及凋亡的影响,并初步探讨其分子机制.方法:设计3对针对Pokcmon基因不同位点的shRNA片段的真核表达载体,脂质体介导转染肝癌细胞株HepG2细胞.RT-PCR及Western blot检测转染前后Pokemon mRNA及蛋白质的 表达,MTT和流式细胞仪分析转染后细胞增殖及凋亡的变化,RT-PCR检测其可能的下游因子β-catenin及H-ras的表达.结果:成功构建含shRNA片段的重组质粒,依次命名为pshRNA1、2、3.转染HepG2细胞后,Pokemon基因的mRNA及蛋白质表达水平明显下调,以pshRNA2最强,抑制率分别为75.2%(RNA水平)和72.6l%(蛋白质水平).MTT显示pshRNA2可明显抑制细胞增殖;流式细胞仪测定转染后细胞凋亡增加;RT-PCR显示下游因子H-ras的表达明显降低(P＜0.05),而β-catenin的表达没有变化(P＞0.05).结论:采用RNAi技术可以特异性阻断Pokemon 基因的表达;Pokemon基因有促进肝癌细胞株增殖及抑制其凋亡的作用,该效应可能与下调其下游因子H-ras的表达有关.     

RNAi技术沉默Survivin基因抑制肺癌细胞株H1299增殖并诱导其凋亡

目的:研究RNAi技术沉默Survivin基因对人肺癌细胞株H1299增殖和凋亡的影响。方法:将Survivin特异性siRNA表达载体siRNA-Sur转染H1299细胞,利用倒置荧光显微镜和流式细胞仪检测转染效率,通过Western blot和Realtime-PCR方法检测RNAi沉默Survivin基因表达的效果,MTT法检测RNAi沉默Survivin基因对基因H1299细胞增殖的影响,采用流式细胞术分析细胞周期分布和凋亡。结果:siRNA-Sur转染H1299细胞48 h后,细胞的Survivin基因表达明显减少,空白对照组Survivin mRNA的相对表达量为1.0,siRNA-空白对照组为0.98,而siRNA-Sur组为0.32(P0.01);导致H1299细胞G2期阻滞,空白对照组为23.7%,而siRNA-Sur组为50.1%(P0.01);细胞抑制率和凋亡率增加,转染48 h,空白对照组凋亡率为5.8%,无关对照组为6.2%,而siRNA-Sur组达50.6%(P0.01)。结论:RNAi沉默H1299细胞Survivin基因表达抑制细胞增殖,并诱导H1299细胞凋亡。     

重组腺病毒AdCat对血管平滑肌细胞

目的探讨腺病毒载体介导的过氧化氢酶基因转染对体外培养的人血管平滑肌细胞增殖与凋亡的影响.方法用含过氧化氢酶基因的重组腺病毒(AdCat)转染人血管平滑肌细胞,采用Western blot 方法检测血管平滑肌细胞过氧化氢酶的表达,应用细胞计数方法观察血管平滑肌细胞的增殖活性,应用流式细胞术和Hoechst 33258 染色等方法对血管平滑肌细胞的凋亡进行研究.结果Western blot显示AdCat转染后血管平滑肌细胞过氧化氢酶表达明显增多;细胞计数显示AdCat组明显抑制细胞增殖,与阴性对照组、空白对照组相比差异有统计学意义(P<0.01);流式细胞术显示AdCat组与阴性对照组、空白对照组比较凋亡率明显增加(P<0.01).经Hoechst 33258染色后,AdCat组凋亡细胞明显多于空白对照组.结论重组腺病毒AdCat转染导致血管平滑肌细胞过氧化氢酶过度表达,抑制血管平滑肌细胞的增殖,促进血管平滑肌细胞的凋亡.     

Notch1 siRNA 对小鼠恶性黑色素瘤细胞体内外增殖的抑制作用研究

目的：探讨靶向Notch1基因小干扰RNA（ Notch1 siRNA,以下简称siNotch）对小鼠恶性黑色素瘤细胞体内外增殖的抑制作用。方法将siNotch 转染小鼠恶性黑色素瘤细胞株B16F1,诱导RNA干扰,采用RT-PCR、Western blot、MTT法及细胞克隆试验体外检测细胞Notch1基因和蛋白表达及细胞增殖、克隆形成变化。随后分别将转染及对照细胞皮下接种于同基因C57BL/6小鼠（分别为转染组及对照组）,在成瘤过程中瘤内注射相应si-Notch1,记录肿瘤生长情况并绘制生长曲线,处死动物后取肿瘤比较各组肿瘤体积,并行HE及免疫组化染色观察肿瘤组织病理学变化和Notch1蛋白表达情况。结果 siNotch1转染B16F1细胞后,细胞增殖能力、克隆形成率及小鼠体内成瘤等均受到抑制（P＜0．01）,免疫组化显示转染组Notch1蛋白表达阳性细胞百分比明显低于对照组（P均＜0．01）。结论 siNotch1可降低细胞Notch1的表达,从而抑制小鼠MM细胞的增殖与生长,可作为治疗恶性黑色素瘤的新方法。     

野生型p53基因对肠癌细胞增殖及凋亡的影响

目的研究人野生型p53基因对肠癌细胞系SW480增殖及凋亡的影响。方法阳离子脂质体介导转染人野生型p53基因至SW480细胞系,利用MTT检测该基因对SW480细胞增殖的影响;利用Western blot检测CyclinD1及Bcl-2、Bax蛋白表达水平。结果与对照组比较,转染人野生型p53基因后的SW480细胞的增殖能力受到抑制;Cy-clinD1蛋白水平下调,Bcl-2、Bax表达呈负相关趋势。结论野生型p53基因在一定程度上可诱导肿瘤细胞凋亡。     

弓形虫ROP16蛋白在人白血病细胞THP-1表达及对其细胞增殖与凋亡的影响北大核心CSCD

目的探讨弓形虫Ⅱ型(Me49)ROP16蛋白在急性单核细胞白血病细胞株THP-1中的表达及其对THP-1细胞增殖与凋亡的影响。方法构建过表达ROP16(overExp-ROP16)和空载体(overExp-NC)慢病毒,通过转染THP-1细胞,72 h后观察荧光表达情况,采用PCR与Western blot验证ROP16在THP-1细胞中的表达。免疫荧光技术检测ROP16蛋白在THP-1细胞中的定位。CCK-8与流式细胞术检测细胞增殖及凋亡。采用qRT-PCR检测细胞凋亡相关因子Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA相对表达水平。Western blot检测Bax、Bcl-2、Pro-Caspase-3和Cleaved-Caspase-3蛋白的表达变化。结果构建的过表达ROP16重组慢病毒转染到THP-1细胞后,可观察强荧光信号,ROP16蛋白在THP-1细胞中成功表达。免疫荧光结果表明ROP16蛋白定位于THP-1细胞核。CCK-8与流式细胞术证实ROP16蛋白抑制THP-1细胞的增殖并促进其凋亡(均P<0.05)。与对照组相比,过表达组促凋亡因子Bax、Caspase-3 mRNA高表达(P<0.05),抗凋亡因子Bcl-2 mRNA低表达(P<0.01),Bax与Cleaved-Caspase-3蛋白水平上调(P<0.01),Bcl-2与Pro-Caspase-3蛋白水平下调(P<0.01)。结论构建的慢病毒表达质粒overExp-ROP16可在急性单核细胞白血病细胞株THP-1中表达且通过入核调节凋亡蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3而抑制THP-1细胞增殖,促进其凋亡。     

沉默热休克蛋白70-2基因经线粒体依赖通路介导肝癌细胞凋亡

目的 探讨沉默热休克蛋白(HSP)70-2对肝癌细胞生长、凋亡的影响,以及诱导肝癌细胞凋亡的详细作用机制. 方法 Westem blot、免疫细胞化学法检测HSP70-2在4种肝癌细胞和正常肝细胞中的表达.设计合成针对HSP70-2基因的特异性短发夹状RNA(shRNA),构建真核表达载体HSP70-2 shRNA1和HSP70-2 shRNA2.转染肝癌细胞后,四甲基偶氮唑盐法检测细胞增殖,膜联蛋白/碘化丙啶双染法检测细胞凋亡情况,罗丹明染色检测细胞线粒体跨膜电位变化,Western blot检测多聚ADP-核糖聚合酶、caspase-3、caspase-9蛋白切割情况,以及细胞色素C、Bax,Bcl-2蛋白的表达变化. 结果 HSP70-2在4种肝癌细胞中均高表达,在L02细胞中仅有微量表达.HSP70-2 shRNA1、shRNA2均能有效抑制肝癌细胞中HSP70-2的表达.沉默HSP70-2基因显著抑制肝癌细胞生长,诱导肝癌细胞凋亡,转染48 h后,shRNA1和shRNA2诱导HepG2细胞的凋亡指数分别为55.8%±1.8%和57.1%±1.6%,诱导Huh细胞凋亡指数分别为54.9%±1.1%和60.2%±2.6%,与对照组相比,差异均有统计学意义,P值均＜0.01.转染HSP70-2 shRNA 48 h后,肝癌细胞线粒体跨膜电位显著下降,细胞色素C从线粒体释放到胞质中,caspase-3、caspase-9激活,多聚ADP核糖聚合酶被剪切降解,抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少,促凋亡蛋白Bax表达明显增加.结论 沉默HsP70-2能通过激活线粒体凋亡通路导致肝癌细胞凋亡.     

RNAi技术沉默Survivin基因抑制肺癌细胞株H1299增殖并诱导其凋亡

目的　研究RNAi技术沉默Survivin基因对人肺癌细胞株H1299增殖和凋亡的影响。方法 将 Survivin特异性siRNA 表达载体siRNA-Sur转染H1299细胞, 利用倒置荧光显微镜和流式细胞仪检测转染效率,通过Western blot和Realtime-PCR方法检测RNAi沉默Survivin 表达的效果, MTT 法检测RNAi沉默Survivin对H1299细胞增殖的影响,采用流式细胞术分析细胞周期分布和凋亡。结果　siRNA-Sur转染H1299细胞48h后,细胞的Survivin基因表达明显减少,空白对照组Survivin mRNA的相对表达量为1.0,siRNA-空白对照组为0.98,而siRNA-Sur组为0.32(P<0.01);导致H1299细胞G2期阻滞,空白对照组为23.7% ,而siRNA-Sur组为50.1%(P<0.01);细胞抑制率和凋亡率增加, 转染48h,白对照组凋亡率为5.8%,无关对照组为6.2%,而siRNA-Sur组达50.6%(P<0.01)。 结论　RNAi沉默H1299细胞Survivin基因表达抑制细胞增殖,并诱导H1299细胞凋亡。     

眼镜蛇毒细胞毒素13诱导人脐静脉内皮细胞凋亡及对Bcl-2家族基因表达的影响

目的 研究眼镜蛇毒细胞毒素13诱导人脐静脉内皮细胞凋亡作用及其对Bcl-2家族基因表达的影响.方法 CCK-8法测定细胞毒素13对人脐静脉内皮细胞增殖的影响;Annexin V-FITC/PI双染法观察细胞凋亡形态学改变;流式细胞术分析DNA倍体及细胞凋亡率;逆转录聚合酶链反应检测Bcl-2、Bax和Bcl-x_L基因表达的变化,Western blotting检测Bcl-2和Bax蛋白表达的变化.结果 细胞毒素13对人脐静脉内皮细胞增殖具有显著的抑制作用,并可诱导其发生凋亡,其抑制作用呈剂量依赖性.细胞毒素13可上调促凋亡蛋白Bax,而对抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-x_L的表达无明显影响.结论 细胞毒素13可能通过上调Bax表达诱导细胞凋亡,抑制人脐静脉内皮细胞增殖.     

shRNA抑制EZH2基因表达对膀胱癌细胞增殖的影响

目的探讨RNA干扰（RNAi）技术下调EZH2基因表达对膀胧癌细胞增殖的影响。方法设计、合成EZH2基因小发夹RNA（shRNA）表达载体,用脂质体包裹并转染膀胱癌EJ细胞。RT-PCR和免疫组化法检测基因沉默效果,细胞克隆形成检测细胞生长情况,流式细胞仪测定细胞周期。结果EZH2的shRNA表达载体能有效下调EJ细胞的EZH2基因表达,并显著抑制EJ细胞生长,EJ细胞周期发生G1期阻滞。结论RNAi技术可显著下调EJ细胞的EZH2基因表达,阻止EJ细胞进入S期并抑制其增殖。     

转染Zbtb7a基因对人胃癌SGC7901细胞增殖、凋亡的影响及其机制

目的 观察转染Zbtb7a基因对人胃癌细胞系SGC7901增殖及凋亡的影响,并探讨其机制.方法 将pcDNA3.1-Zbtb7a和pSilencer 3.1-H1-mk用Lipofectamine2000转染SGC7901细胞,采用RT-PCR和Western Blot法检测MK mRNA及蛋白表达,CCK-8试剂盒和平板克隆法检测细胞增殖,流式细胞仪Annexin V-PI染色检测细胞凋亡.结果 转染Zbtb7a后,SGC7901细胞中MK表达水平明显升高,细胞增殖能力明显增强（P＜0.05）,并且0.5ng/mL TRAIL诱导的细胞凋亡受到抑制（P＜0.05）.Zbtb7a高表达后干扰MK的表达,细胞增殖及克隆能力则明显降低（P＜0.05）,TRAIL诱导的细胞凋亡数也明显增加（P＜0.05）.结论 Zbtb7a可以通过上调MK的表达,促进SGC-7901细胞增殖以及抑制TRAI诱导的细胞凋亡.     

shRNA干扰Rab9 GTPase表达对麻疹病毒野生株体外增殖的抑制作用

目的构建Rab9 GTPase短发夹RNA（shRNA）表达载体,观察其对Rab9 GTPase基因表达和麻疹病毒野生株体外增殖的抑制作用。方法参照GenBank中Rab9 GTPase基因序列设计合成2对Rab9 GTPase基因特异性shRNA,定向克隆人表达载体,构建重组表达载体,酶切鉴定和序列分析证实后脂质体法转染U937细胞,然后感染麻疹病毒野生株,逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和免疫印迹技术（Western blot）检测转染细胞内Rab9 GTPase mRNA和蛋白质的表达水平;标准蚀斑试验测定病毒滴度;流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化;RT-PCR检测转染细胞内双链RNA依赖蛋白激酶（PKR）和2′-5′寡腺甙酸合成酶（OAS-1）的mRNA水平。结果酶切和序列分析证实,成功构建了靶向Rab9 GTPase基因的shRNA表达载体。2个shRNAs均可特异性抑制U937细胞内Rab9 GTPase mRNA和蛋白质的表达,最高抑制率分别为（90.5±0.2）％和（92.1±0.3）％;蚀斑试验结果表明,shRNAs可以有效抑制麻疹病毒野生株体外增殖,其抑制率可达到90％以上;流式细胞仪检测转染后细胞的凋亡率无明显变化;RT-PCR检测PKR和OAs-1的mRNA水平转染前后无明显变化。结论成功构建Rab9 GTPase特异性shRNA表达载体。shRNAs通过特异性抑制Rab9 GTPase基因表达抑制麻疹病毒野生株体外增殖。     

Smoothened shRNA载体的构建及其对乳腺癌细胞增殖的影响

目的构建并筛选Smoothened（SMO）基因的RNAi表达质粒,了解Hedgehog信号通路影响乳腺癌细胞增殖的作用机制。方法以脂质体Lipofectamine^TM2000介导转染乳腺癌MCF-7细胞。转染后48 h,采用实时定量RT-PCR技术检测转染细胞中SMO基因mRNA的转录水平,筛选有效的SMO RNAi质粒,Western blot检测SMO蛋白在乳腺癌MCF-7细胞中的表达,CCK-8法比较转染前后乳腺癌细胞增殖变化,实时定量RT-PCR检测SMO短发夹状RNA（shRNA）对cyclinD1 mRNA表达的影响。结果 4个SMO shRNA表达载体SMO shRNA-1、SMO shRNA-2、SMO shRNA-3和SMO shRNA-4经测序鉴定证明插入正确。转染48 h后,与MOCK组相比,SMO shRNA-1、SMOshRNA-3、SMO shRNA-4组SMO mRNA表达量均下降（P=0.015、0.002、0.000）,其中转染SMO shRNA-4的MCF-7细胞中SMO mRNA表达水平低于SMO shRNA-1、SMO shRNA-2、SMO shRNA-3组（P=0.007、0.000、0.046）。SMOshRNA-4干扰抑制效率为87%。Western blot可检测到SMO在MCF-7中的表达,干扰片段SMO shRNA-4的抑制效果较好。转染SMO shRNA-4的MCF-7细胞增殖受到明显抑制（P〈0.01）,转染SMO shRNA后cyclinD1 mRNA表达下降（P=0.000）。结论已成功构建并筛选出SMO基因的RNAi表达质粒,SMO shRNA对乳腺癌细胞增殖有明显的抑制作用,Hedgehog信号通路可通过活化cyclinD1诱导细胞恶性增殖。     

短发卡RNA抑制人端粒酶逆转录酶表达对人脑胶质瘤细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨短发卡RNA(shRNA)对人端粒酶逆转录酶(hTERT)表达的抑制作用,以及其对人胶质瘤细胞U251增殖、凋亡的影响。方法构建针对hTERT的shRNA表达质粒,脂质体介导转染人胶质瘤细胞U251,采用RT-PCR、Western blotting技术检测目的基因的表达,PI-DNA染色、流式细胞仪检测细胞的增殖及凋亡。结果成功构建了hTERT的shRNA表达质粒,其转染U251胶质瘤细胞后,hTERT基因表达明显降低(P<0.05),细胞进入S期出现障碍,停滞在G0/G1期的细胞增多,凋亡细胞增加。结论针对hTERT的shRNA干扰效果明确,其可抑制胶质瘤细胞增殖,促进其凋亡。     

沉默SIRT1基因表达对胰腺癌细胞PANC1增殖和凋亡的影响

目的 应用RNA干扰技术沉默胰腺癌PANC1细胞的SIRT1基因表达,观察其对细胞增殖和凋亡的影响.方法 构建靶向SIRT1基因表达的短发夹RNA(shRNA)真核表达质粒pGC-shRNA,转染胰腺癌细胞PANC1.设对照shRNA(shRNA-C)转染组和未转染对照组.实时定量PCR和免疫细胞化学法检测转染后细胞SIRT1 mRNA及蛋白的表达;MTT法检测细胞的增殖率;ELASA法检测细胞caspase-3和caspase-9活性;Western bloting检测细胞Bax、Bcl-2蛋白表达.结果 与未转染组相比,shRNA组转染后48 h,PANC1细胞SIRT1 mRNA及蛋白表达的抑制率分别为(76.2%±10.4)%和(80.1±11.6)%;细胞增殖抑制率为(45.1±6.5)%;caspase-3和caspase-9酶活性显著增高;Bax蛋白表达上调,Bcl-2蛋白表达下调.结论 应用RNA干扰技术能有效沉默PANC1细胞SIRT1基因的表达,其机制可能与caspasa酶活性升高及Bax表达上调、Bcl-2表达下调有关.     

靶向cyclinE小干扰RNA对肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的影响

目的:以cyclinE基因编码区为靶位,构建表达小干扰RNA(siRNA)的质粒载体,观察转染后对HepG2细胞的影响.方法:针对cyclinE基因序列构建表达siRNA的真核表达载体pSilencer3.1-H1hygro,利用脂质体Metafectene转染CyclinE基因高表达的肝癌细胞株HepG2.流式细胞仪检测细胞周期及凋亡率,MTT法检测细胞增殖活性,RT-PCR和Western blot法观察转染后细胞cyclinE基因表达.结果:成功构建了表达siRNA的真核质粒载体,转染后cyclinE基因mRNA及蛋白表达水平分别下降了79%和65%.结论:靶向cyclinE基因的siRNA可有效沉默HepG2细胞高表达的cyclinE基因,从而抑制肝癌细胞的增殖并促进凋亡.