不同空间排列静电纺丝对RSC96细胞表达NGF及Laminin的研究

目的：研究不同空间排列静电纺丝对雪旺细胞株(RSC96)神经营养因子（NGF）及层粘连蛋白（Laminin,LN）的表达情况。方法根据培养条件不同分3组,即平行静电纺丝培养组（A）、随机静电纺丝培养组（B）及膜上培养组（C）培养3天后用Trizol法提取细胞总RNA,用Oligo(dT)逆转录酶得到cDNA。经特定引物PCR扩增,取相同量的逆转录产物进行qPCR反应,检测NGF及LN的表达差异。结果平行静电纺丝组,随机静电纺丝组,膜上培养组上NGF基因表达依次递增,各组间差异明显;LN基因的表达依次递减,各组间差异明显。结论不同空间排列的静电纺丝对RSC96细胞表达NGF和Laminin影响不同,平行的静电纺丝有促进细胞向成熟分化的可能。     

人参环氧炔醇对体外培养RSC96细胞的实验观察

目的研究人参环氧炔醇(Panaxydol,PND)对体外培养RSC96细胞神经营养因子及髓鞘蛋白表达的影响并探讨其机制。方法用含不同血清浓度的培养基培养RSC96细胞,MTT检测其增殖能力,以获取最适宜RSC96细胞体外生长的血清浓度。在适宜的血清培养基中加入PND(10μmol/L)处理RSC96细胞,以RT-PCR、western blot及ELISA检测RSC96细胞NGF和BDNF的表达。另外,预先在培养基中加入钙离子通道阻滞剂尼非地平探讨PND可能的作用途径。结果培养基血清浓度为4mmol/L时,RSC96细胞生长形态最接近于原代Schwann细胞。PND增强RSC96细胞表达和释放NGF和BDNF(P0.05)。尼非地平的使用,则削弱了PND对RSC96细胞的作用(P0.05)。结论在适宜的血清培养基中,体外培养的RSC96细胞可替代原代Schwann细胞,作为研究药物对它的影响及机制的细胞模型。PND增强RSC96细胞的生物活性的作用机制可能通过Ca2+信号途径介导。     

大鼠骨髓间充质干细胞培养上清液对RSC96 细胞生物学功能的影响

目的：探讨大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）培养上清液对大鼠RSC96细胞生物学功能的影响。方法：体外培养、纯化SD大鼠BMSC并进行鉴定;收集第3代BMSC培养上清液（BMSC-CM）;采用MTT法检测BMSC-CM对RSC96细胞增殖的影响;平板克隆实验分析BMSC-CM对RSC96单个细胞增殖的影响;划痕实验和TranswellTM小室实验分析BMSC-CM对RSC96细胞迁移的作用,Western blot法检测BMSC-CM对RSC96细胞Bax和Bcl-2蛋白表达的改变。结果：SD大鼠第3代BMSC形态呈长梭形,旋涡样生长;成骨染色为阳性结果;成脂诱导后有脂滴出现;BMSC-CM作用后抑制RSC96细胞的增殖和迁移能力,且作用后的RSC96细胞Bax蛋白水平升高,Bcl-2蛋白表达降低。结论：BMSC-CM促进RSC96细胞凋亡,抑制其增殖和迁移。     

槲皮素通过Akt-mTOR途径上调高糖培养RSC96细胞的自噬

目的探讨槲皮素对高糖离体培养的RSC96细胞自噬变化规律的影响。方法 RSC96细胞培养于含有槲皮素的高糖培养基中,超微结构应用透射电子显微镜观察,用免疫荧光法、Western blot法检测Beclin1、LC3Ⅱ、磷酸化的Akt及磷酸化的m TOR蛋白表达,用实时荧光定量PCR法检测Beclin1 mRNA和LC3B mRNA的转录。结果高糖造成RSC96细胞Beclin1和LC3Ⅱ的表达下调,增加Akt和m TOR的磷酸化水平(P0.05,P0.01),造成病理形态改变,减少自噬体数量。槲皮素能够上调Beclin1和LC3Ⅱ的表达,下调Akt和m TOR的磷酸化水平(P0.05,P0.01),修复病理损伤,增加自噬体数量。结论槲皮素通过下调Akt-m TOR途径磷酸化水平而增加高糖培养RSC96细胞的自噬。     

Laminin和Fibronectin对周围神经中的再生轴突及非神经元细胞的作用和影响

本文用近交克隆系(Close cloned)大鼠研究了内源性Laminin和Fibronectin对周围神经的再生轴突及非神经元的雪旺氏细胞、成纤维细胞等的作用和影响。将从供体鼠获得的坐骨神中段经冷冻、加热处理后再用Laminin或Fibronectin抗血清处理;对照组则用正常兔血清处理。将处理后的神经段(10mm)分别植入三组受体鼠体内,术后不同时期取材,电镜观察。术后15天,抗Laminin组和抗Fibronectin组的轴突总数,只有对照组的50%左右。对照组和抗Fibronectin组约90%的轴突走在基底膜管内,而抗Laminin组,再生轴突似不能识别基底膜而生长在基底膜管外。轴突生长总是先于雪旺氏细胞的迁移,而后雪旺氏细胞才生长粘附并包绕轴突。成纤维细胞能够识别伴随有雪旺氏细胞的轴突,并形成神经周膜包绕这些轴突,但它们不能识别空陷的基底膜管,只有当组织中缺乏Fibronectin时,增生的成纤维细胞方在基底膜管外形成神经周膜。在缺乏Laminin的神经段内,巨噬细胞不仅大量增生,还有包随走在基底膜管外单个轴突的趋向。这些结果提示在神经再生的早期,内源性Laminin和Fibronectin不但调节再生神经纤维的生长,对在神经损伤和再生中起重要作用的巨噬细胞和成纤维细胞也有积极的影响。     

胰岛素样生长因子-1对共培养的神经细胞和施万细胞超微结构的影响

目的分析胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)对体外培养的神经细胞和施万细胞超微结构的影响。方法建立VSC4.1大鼠神经细胞与RSC96大鼠施万细胞共培养模型:将VSC4.1神经细胞与RSC96施万细胞共同培养,通过改善培养条件,使之共同生长。经相差显微镜观察,确定共培养的两种细胞可发生相互作用。透射电镜观察单独培养的神经细胞、施万细胞及共培养时细胞超微结构的变化。观察IGF-1的影响:实验分为共培养对照组和IGF-1组(20 ng/ml)。培养5天后,收集细胞进行扫描电镜和透射电镜观察。结果透射电镜观察单独培养的神经细胞及施万细胞均可见不同的分化状态,其超微结构各异。透射电镜结果:与对照组相比,IGF-1组中细胞表面绒毛状或指状突起明显增多且联系紧密。扫描电镜结果:对照组与IGF-1组中均可见RSC96细胞包绕轴突形成髓鞘(可称之为成髓的施万细胞)。对照组中所有的细胞表面均比较平滑,绒毛样突起不明显。IGF-1组的细胞表面不再光滑,神经细胞和未成髓的施万细胞表面呈明显的绒毛样突起,而包裹轴突的成髓施万细胞表面主要呈片层状突起。结论 IGF-1可引起VSC4.1神经细胞和RSC96施万细胞超微结构及表面形态的改变。这或许是引起其功能改变的外在表现形式。     

施万样细胞对大鼠脊神经节NGF和BDNF表达的影响

目的观察施万样细胞对坐骨神经损伤(sciatic nerve injury,SNI)大鼠脊神经节NGF和BDNF表达的影响,初步探讨施万样细胞对脊神经节的保护作用。方法先将脂肪源性干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)诱导分化为施万样细胞并对后者进行鉴定,后将二者分别植入脱细胞神经移植物(ANA)中,构建组织工程神经。大鼠随机分为正常对照组、ADSC组和施万样细胞组。后两组建立SNI模型并用相应的组织工程神经桥接损伤的神经。术后4周采用Western Blot和Real-time PCR检测各组大鼠脊神经节神经生长因子(nerve growth factor,NGF)和脑源性神经营养因子(brainderived neurotrophic factor,BDNF)蛋白和m RNA的表达。结果 ADSCs能够诱导分化为施万样细胞并表达施万细胞标记物S100β和GFAP蛋白。施万样细胞组大鼠脊神经节内NGF和BDNF蛋白及m RNA表达量均高于ADSC组(P0.05)。结论施万样细胞可上调脊神经节NGF和BDNF的表达,对SNI所致的脊神经节内神经元损伤有保护作用。     

HSPgp96诱导巨噬细胞呼吸爆发与细胞内外游离钙关系的研究

目的：探讨从小鼠H₂₂肝癌细胞中提纯的热休克蛋白gp96（HSPgp96）对小鼠腹腔巨噬细胞（PEMφ）呼吸爆发的影响及其与细胞内外游离钙的关系。方法：(1)用亲和层析和离子交换层析等方法从小鼠H₂₂肝癌细胞中获得纯化的HSPgp96。(2)用细胞内过氧化物荧光探针H₂DCF-DA监测HSPgp96作用于小鼠PEMφ过程中，单个细胞活性氧（ROS）信号的变化,反映PEMφ内呼吸爆发时的变化过程；用荧光探针Fluo-3/AM监测HSPgp96作用于小鼠PEMφ过程中，单个细胞内钙离子（［Ca2+］_i）信号的变化。(3)使用细胞膜和细胞内钙通道抑制剂及钙离子载体后，再观察HSPgp96作用后ROS信号的变化。结果：(1)加入HSPgp96后PEMφ内Fluo-3荧光强度立即上升，70s时增幅达161.05%±50.99%；当分别阻断细胞外钙内流、抑制细胞内钙库释放功能后110s增幅分别为84.81%±29.52%和46.21%±17.24%。同时阻断胞内外钙作用，HSPgp96这一诱发功能明显被抑制。加入钙离子载体后可见细胞内荧光强度迅速增强，于110 s时达156.98%±45.83%，随后迅速下降。(2)小鼠PEMφ受HSPgp96刺激后表征ROS的荧光强度立即上升，620 s达基础荧光值的636.78%±82.02%，随后始终维持在高水平。当分别阻断细胞外钙内流、抑制细胞内钙库释放功能后，再加入HSPgp96后细胞内ROS荧光值上升幅度较小。同时阻断了胞内外钙作用后，HSPgp96刺激后ROS荧光值上升没有明显高峰出现。结论：HSPgp96作用于小鼠PEMφ后，促进了细胞外钙内流并使细胞内钙库释钙，这是HSPgp96诱发细胞内活性氧增加的基本机制。     

富血小板凝胶上清对施万细胞活性的影响

目的:观察富血小板凝胶上清(PRP-r)对大鼠施万细胞(SCs)增殖和分泌神经再生相关活性物质的影响。方法:实验分为PRP-r组和control组。利用大鼠腹主动脉血制备富血小板血浆(PRP),用CaCl₂激活PRP得到PRP-r。CCK-8检测RSC96的增殖能力,ELISA检测RSC96培养上清中神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)和胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)水平,Western Blot检测RSC96细胞中神经细胞黏附分子(NCAM)、p75神经营养因子受体(p75NTR)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和S100钙结合蛋白B(S100B)的表达。结果:RSC96的增殖能力在PRP-r作用下显著提高,与对照组相比,培养上清中NGF、BDNF、GDNF水平增加,细胞中NCAM、p75NTR、GFAP、S100B蛋白表达上调。结论:PRP-r可以促进RSC96细胞增殖,促进神经营养因子分泌及相关蛋白的表达。     

巨噬细胞活化因子的双相效应及巨噬细胞的促瘤细胞生长作用

PHA刺激的人扁桃体T细胞分泌的淋巴因子中含有的MAF,可使TG活化Mφ表达达促进或抑制瘤细胞生长的双相作用。30例样品的分析结果提示,该相反的两种作用是由不同的MAF分子诱导所致,TG活化Mφ能分泌促瘤细胞生长因子,此因子不是IL—1,不能增强小鼠脾脏T细胞的增殖,MAF可抑制TG活化Mφ分泌促瘤细胞生长因子的能力。     

纤维粘连蛋白和层粘连蛋白对培养血管平滑肌细胞生长和分裂的影响

我们用不同剂量的纤维粘连蛋白（Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ，Ｆｎ）和层粘连蛋白（Ｌａｍｉｎｉｎ，Ｌｎ）作用于培养的血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣｓ）观察ＶＳＭＣｓ的生长和分裂情况，发现Ｆｎ和Ｌｎ均能促进ＶＳＭＣＳ的生长和分裂，Ｆｎ的这种作用在４０μｇ以下呈剂量依赖性，Ｌｎ则在２４μｇ以下呈剂量依赖性，当细胞数达到最大后，Ｆｎ和Ｌｎ的促进作用均逐步减弱。     

Convergent pathways of macrophage polarization: The role of B cells

The construction of an inflammatory microenvironment provides the fuel for cancer development and progression. Hence, solid tumors promote infiltration of leukocyte populations, among which tumor‐associated macrophages (TAM) represent a paradigm for cancer‐promoting inflammation. TAM orchestrate various aspects of cancer, including diversion and skewing of adaptive responses, cell growth, angiogenesis, matrix deposition and remodelling, the construction of a metastatic niche and actual metastasis, response to hormones and chemotherapeutic agents. Several lines of evidence indicate that TAM show a remarkable degree of plasticity and functional heterogeneity, suggesting that during tumor progression macrophages undergo a phenotypic “switch”, eventually exhibiting the alternatively activated, “M2”, phenotype that is associated with immunosuppression, promotion of tumor angiogenesis and metastasis. Although recent studies have attempted to address the role of microenvironmental signals on TAM “reprogramming”, the interplay between innate and adaptive immunity is emerging as a crucial step of this event. In this issue of the European Journal of Immunology, a study demonstrates that B1 lymphocytes expressing IL‐10 play a key role in promoting a pro‐tumoral M2‐biased phenotype of macrophages. This article defines a new in vivo pathway of macrophage polarization and suggests that targeting B cells is a possible therapeutic intervention to reinstate anti‐cancer functions by TAM.     

溶血卵磷脂对巨噬泡沫细胞胆固醇外流的影响

目的：探讨溶血卵磷脂（LPC）对巨噬泡沫细胞胆固醇外流的影响，为动脉粥样硬化（AS）的防治研究提供理论依据。方法：分离培养小鼠腹腔巨噬细胞，密度梯度超速离心法分离人血浆低密度脂蛋白（LDL），乙酰化后形成乙酰化低密度蛋白（AcLDL),用AcLDL负载巨噬细胞使之形成巨噬泡沫细胞模型。用酶学荧光法检测细胞胆固醇外流，用乳酸脱氢酶（LDH）检测试剂盒检测培养基中LDH活性来反映LPC的细胞毒性。结果：LPC处理巨噬泡沫细胞24h后，培养基中胆固醇含量明显高于对照组（1．7－4倍），细胞内胆固醇含量明显低于对照组。且LPC引起细胞胆固醇外流增加同时，培养基中LDH活性并没有明显差异。结论：在10－80μmol/L剂量范围内，LPC可以剂量依赖性地促进巨噬泡沫细胞胆固醇外流，且这一效应与LPC的细胞毒性之间没有关系。     

溶血卵磷脂对巨噬泡沫细胞胆固醇外流的影响

目的:探讨溶血卵磷脂(LPC)对巨噬泡沫细胞胆固醇外流的影响,为动脉粥样硬化(AS)的防治研究提供理论依据。方法:分离培养小鼠腹腔巨噬细胞,密度梯度超速离心法分离人血浆低密度脂蛋白(LDL),乙酰化后形成乙酰化低密度脂蛋白(AcLDL),用AcLDL负载巨噬细胞使之形成巨噬泡沫细胞模型。用酶学荧光法检测细胞胆固醇外流,用乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒检测培养基中LDH活性来反映LPC的细胞毒性。结果:LPC处理巨噬泡沫细胞24h后,培养基中胆固醇含量明显高于对照组(1.7-4倍),细胞内胆固醇含量明显低于对照组。且LPC引起细胞胆固醇外流增加同时,培养基中LDH活性并没有明显差异。结论:在10-80μmol/L剂量范围内,LPC可以剂量依赖性地促进巨噬泡沫细胞胆固醇外流,且这一效应与LPC的细胞毒性之间没有关系。     

The secretory IFN-gamma response of single CD4 memory cells after activation on different antigen presenting cell types

It is unknown to what extent the heterogeneity of antigen presenting cells (APC) influences the IFN-gamma response of CD4 memory cells. We re-stimulated DO11.10 T cell receptor (TCR)-transgenic cells and wild-type CD4 memory cells with OVA-peptide 323-339 presented on purified dendritic cells (DC), macrophages, and B cells. Using IFN-gamma ELISPOT assays, we measured the number of cytokine producing T cells and the amount of cytokine produced by individual T cells at different time points after antigen encounter. The data showed that, when CD4 cells recognized antigen on DC, the induction of cytokine production was accelerated compared to macrophages and B cells. In contrast, the per-cell cytokine productivity was independent of the type of APC by which the T cells were re-stimulated. Moreover, the peptide concentration required for CD4 cell activation was comparable for the different APC. The data suggest that DC induce cytokine production in memory cells with accelerated activation kinetics, whereas 24 h of antigen stimulation on DC, macrophages, and B cells results in comparable levels of T cell activation. These data have implications for the understanding of T cell memory responses when T cells re-encounter antigen on different APC as well as for the monitoring of memory T cell responses ex vivo.     

NGF及其受体P75在四氯化碳中毒性大鼠肝组织中表达增强

目的 观察四氯化碳中毒时神经生长因子(NGF)及其受体P75在大鼠肝组织的表达变化,探讨NGF在肝纤维化发生机制中的可能作用.方法 用四氯化碳致大鼠肝中毒模型,用RT-PCR法和Western blot法,分别检测NGF 及其受体P75在大鼠肝组织中的表达.结果 与对照组大鼠肝组织中NGF mRNA及其受体P75蛋白表达量比较,造模组24 h显著增高(P＜0.01,n=6),造模48 h和72 h迅速回降,但仍显著高于对照组(P＜0.05,n=6).结论 在四氯化碳中毒性大鼠的肝组织中,NGF及其受体P75的表达可能与肝纤维化的形成密切相关.