端粒酶与细胞永生化

建立永生化细胞系是生物学研究的热点和难点之一。位于真核生物细胞染色体末端的端粒可以稳定染色体，而由RNA和蛋白质组成的端粒酶以自身RNA为模板合成端粒。因此，将外源性端粒酶逆转录酶（TERT）基因转染至目的细胞，则可能通过M1期－M2期机制，诱导细胞发生永生化。目前，人视网膜色素上皮细胞，肺成纤维细胞等已被此方法永生化，TERT较传统的永生化基因具有许多优越性。     

HPV16 E6/E7对永生化口腔上皮细胞p53、p21表达的影响

目的：为了探讨人乳头状瘤病毒(HPV)转化口腔上皮细胞的作用机制，研究HPV16 E6、E7对永生化口腔上皮细胞细胞周期调节因子p53、p21表达的影响。方法：免疫细胞化学法检测HPV16 E6、E7诱导的永生化口腔上皮细胞HIOEC中野生型和突变型p53的表达；Westem印迹检测HIOEC HPV16 E6、E7、p53、p21蛋白表达，并以正常口腔上皮细胞和转染空白载体的口腔上皮细胞为对照。结果：HIOEC细胞表达HPV16 E6、E7蛋白．野生型p53和p21表达水平高于正常口腔上皮细胞和转染空白载体的口腔上皮细胞。结论：p53的失活可能不是HPV16 E6、E7诱导口腔上皮细胞永生化的主要原因。     

口腔黏膜上皮细胞和成纤维细胞的复合培养

目的 为癌前病变临床病理研究建立一种简便、迅速和有效的口腔黏膜上皮细胞和成纤维细胞复合培养的方法,实现体外模拟组织工程化口腔黏膜的发生发展。方法 用DispaseⅡ分离上皮和皮下组织,用KGM培养口腔黏膜上皮细胞。用细胞培养法和组织块培养法获取验用的口腔黏膜上皮细胞和成纤维细胞,并采用复合培养法对两种细胞进行共同培养。结果 用DispaseⅡ可成分地分离上皮和皮下组织。KGM可明显促进口腔黏膜上皮细胞的分裂繁殖。复合培养的HE染色切片显示薄层的结缔组织之上有方形的基底细胞、颗粒细胞和角化层。结论 KGM可明显促进口腔黏膜上皮细胞的分裂和成熟。采用组织培养法获取原代成纤维细胞是适合口腔黏膜取材等特点的有效方法。气液相培养的口腔黏膜下结缔组织可促进上皮细胞的分层和分化。     

口腔黏膜上皮细胞体外培养研究

近年来国内外众多学者广泛开展了口腔黏膜上皮细胞体外培养的研究,致力于口腔黏膜上皮细胞体外培养体系的完善与简化。本文对近年来的口腔黏膜上皮细胞体外培养的研究作一综述。     

反转录病毒介导端粒酶基因对人口腔黏膜角化细胞寿命的影响

目的:以pBABE-tert重组反转录病毒为载体,介导端粒酶反转录酶基因(hTRT)转染体外培养的人口腔角化细胞,探讨端粒酶对细胞寿命的影响。方法:将含有hTRT的pBABE-tert重组反转录病毒载体扩增后,转染体外培养的人口腔角化细胞,挑选阳性克隆进行传代培养,以PCR-ELISA 和PCR-PAGE电泳检测端粒酶活性。结果:获得端粒酶活性稳定表达的口腔角化上皮细胞克隆,寿命可延长至8~9代。结论:转导端粒酶反转录酶基因的人口腔角化细胞寿命延长1倍,但不能永生化,说明人口腔上皮角化细胞的永生化是复杂和多点调控的过程,端粒酶活性增加是细胞永生化的关键但不是唯一原因。     

口腔黏膜病

人口腔黏膜癌变不同阶段端粒酶逆转录酶及p53蛋白的表达；口腔黏膜扁平苔藓患者口腔黏膜组织中cyclin D1，ki-67及凋亡的表达研究；甘草散治疗口腔溃疡的动物实验研究；Ets-1在口腔扁平苔藓中的表达研究；改良组织块法体外原代培养口腔黏膜上皮细胞；……[编者按]     

涎腺上皮细胞永生化细胞系及其意义

唾液在保护口腔组织、免疫、消化食物等维护口腔内器官的正常功能方面发挥着重要作用 ,它是由各个涎腺的上皮细胞分泌物的混合物 ,但是涎腺上皮细胞的生长、分化的自身调节机制尚不清楚。涎腺上皮细胞在体外培养生长的时间有限 ,妨碍人们的研究工作 ,那么在体外建立永生化细胞系作为研究这些机制的一种模型是必要的。体外初代培养的细胞一经传代便称为细胞系 (cellline) ,一般正常细胞在经过一定的代数后衰退而死亡 ,称为有限细胞系 (finitedcellline)。一些细胞自发地或经人工诱导等方法而转化 ,细胞获得持久性增殖能力这样的细胞群体称无…     

为研究口腔鳞癌发生发展的机制建立实验平台

《口腔黏膜上皮细胞体外癌变模型的建立》通过口腔常见的化学致癌剂B（a）P诱导永生化口腔上皮细胞HIOEC细胞，促使细胞恶性转化，逐步筛选得到具有恶性表型的HIOEC-B（a）P细胞。建立包含正常口腔黏膜上皮细胞、永生化上皮细胞的体外癌变模型。这个过程中包含了生物因素（HPV）、化学因素[B（a）P]和血清中的生长因子等作用因素；细胞经历了从正常到永生化，逐步恶变的过程。这样一个多因素、多步骤、多阶段的长期体外恶变过程，可以在一定程度上反映口腔黏膜上皮细胞的恶变，为进一步研究口腔鳞癌发生、发展的机制建立了实验平台，具有重要的研究价值。国内尚无同类报道。研究结果值得推广和发表，建议以“快速通道”的形式发表。     

外胚间充质干细胞永生化的实验研究

目的：探讨端粒酶催化亚基(hTERT）在外肌间充质十细胞永生化中的作用。方法：质粒pClneo—hTERT转染外胚问充质干细胞，经G418筛选后获得抗性克降。免疫细胞化学法及图像分析检测hTERT的表达，累计生长曲线检测细胞增殖能力。结果：转染后获3个抗性克隆。转染第3代细胞hTERT染色呈强阳性，转染后第15代细胞hTERT活性较正常培养的第15代细胞明显增强、转染细胞增殖能力有不同程度的增加，其中克隆2越过衰老期，寿命延长。结论：外源性hTERT介入可重建外胚间充质干细胞的端粒酶活性，使细胞延长寿命，得以永生。     

慢病毒介导过表达端粒酶逆转录酶的 人口腔黏膜上皮稳定细胞系的构建

目的 通过慢病毒法建立稳定表达外源性人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的口腔黏膜上皮细胞（OMECs）,探索构建高效、稳定的永生化OMECs细胞系的方法。方法 提取293T细胞总RNA,应用聚合酶链反应（PCR）法扩 增hTERT基因全长,构建重组慢病毒载体pLVX-puro-hTERT。包装慢病毒颗粒后感染人正常OMECs,经嘌呤霉素抗 性筛选获得阳性克隆,采用实时荧光定量PCR法和Western blot法检测hTERT基因mRNA和蛋白的表达水平。结果 成功构建了pLVX-puro-hTERT过表达慢病毒载体并感染到OMECs中;感染细胞与正常OMECs形态相似,呈铺路石 样生长;实时荧光定量PCR和Western blot结果均显示,hTERT在感染细胞中高表达,与正常细胞相比差异有统计学 意义（P<0.05）。结论 通过慢病毒法成功建立了过表达hTERT的OMECs稳定细胞系,为构建高效、稳定增殖的人 永生化OMECs细胞系奠定了实验基础。     

口腔鳞癌端粒酶活性的检测及临床意义

目的　探讨端粒酶活性和口腔鳞癌发生、发展的关系。方法　采用TRAP -PCR -ELISA法对 32例口腔鳞癌标本、1 5例癌旁组织和 1 0例正常口腔粘膜组织进行端粒酶活性检测和分析。结果　口腔鳞癌组织中端粒酶活性值显著高于癌旁组织和正常组织 (P <0 .0 5)。端粒酶在口腔鳞癌标本中阳性检出率 71 .87% ,显著高于癌旁组织和正常组织 (P <0 .0 1 ) ,且和鳞癌的病理分级及有无颈淋巴结转移密切相关。结论　端粒酶活性和口腔鳞癌的发生、发展有密切关系     

槟榔碱对口腔角质形成细胞端粒酶逆转录酶表达的影响

目的：观察槟榔碱对人口腔角质形成细胞（KC）端粒酶逆转录酶（hTERT）mRNA及蛋白表达的影响，进一步探讨hTERT在口腔黏膜下纤维性变（OSF）癌变过程中的作用机制。方法：体外培养正常口腔黏膜的上皮细胞，将实验细胞分为0．03、0．06、0．09g／L槟榔碱组、空白对照组。采用Western印迹法和RT-PCR方法观察槟榔碱对KC hTERT mRNA及蛋白表达的影响。结果：槟榔碱能呈剂量依赖性增加KC hTERT mRNA及蛋白表达，0．03、0．06、0．09g／L槟榔碱组hTERT mRNA及蛋白表达均高于空白对照组（P〈0．05）。结论：槟榔碱对KChTERT mRNA与蛋白表达有明显诱导作用，且在一定范围内呈剂量依赖关系，槟榔碱诱导KChTERT过度表达可能在OSF癌变过程中起重要作用。     

端粒酶逆转录酶mRNA在口腔扁平苔藓中的表达

目的 探讨端粒酶逆转录酶(TERT)mRNA在口腔扁平苔藓(OLP)中的表达及临床意义。方法 采用原位杂交(ISH)的方法,检测了20例糜烂型扁平苔藓(erosive oral lichen planus,eOLP)、20例非糜烂型扁平苔藓(non-erosive oral lichen planus,neOLP)和12例正常口腔黏膜TERT mRNA的表达。结果 糜烂型OLP的TERT mRNA阳性率明显高于非糜烂型OLP的TERT mRNA阳性率(P<0.05)。糜烂型OLP与非糜烂型OLP染色强度相比有统计学意义(P<0.05)。结论 糜烂型OLP的上皮细胞可能比非糜烂型OLP的上皮细胞处于更高的增殖状态。     

苦参碱对腺样囊性癌细胞周期阻滞和端粒酶催化亚基表达的影响

目的观察中药苦参有效成分苦参碱对涎腺腺样囊性癌ACC-M细胞的细胞周期及端粒酶催化亚基（hTERT）表达的影响。方法体外培养ACC-M细胞,用不同浓度的苦参碱对体外培养的ACC-M细胞进行干预,以流式细胞仪检测对照组和不同浓度（0.25、0.50、0.75、1.00 mg·mL-1）苦参碱作用不同时间后细胞周期的变化;逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测苦参碱作用48 h后细胞hTERT mRNA的表达改变;流式细胞术定量检测hTERT蛋白的表达变化。结果苦参碱作用后明显抑制ACC-M细胞的增殖,使ACC-M细胞周期阻滞于G0/G1期,并与药物浓度和作用时间呈正相关;苦参碱作用后hTERT基因和蛋白表达明显下降。结论苦参碱对ACC-M细胞有明显细胞周期阻滞作用,同时显著下调hTERT基因表达。细胞周期阻滞作用可能与苦参碱下调hTERT基因表达有关。     

水通道蛋白3在口腔鳞癌中的表达及临床意义

目的: 探讨水通道蛋白3（AQP3）在口腔鳞癌中的表达及临床意义。方法: 收集2014年3月—2017年4月盘锦辽油宝石花医院保存的202例口腔黏膜组织石蜡标本。其中健康者41例（对照组）、口腔黏膜上皮异常增生45例（A组）、口腔鳞癌116例（B组）。利用免疫组织化学方法检测3组口腔黏膜组织中AQP3的表达情况,分析口腔鳞癌口腔黏膜组织中AQP3表达与临床病理因素及预后的关系。采用SPSS 18.0软件包对数据进行统计学分析。结果: B组口腔黏膜组织中AQP3阳性表达率显著高于A组和对照组（P<0.05）,A组口腔黏膜组织中AQP3阳性表达率显著高于对照组（P<0.05）。肿瘤侵袭深度>5 mm、临床T4分期、颈淋巴结转移、低分化患者,口腔黏膜组织中AQP3阳性表达率分别高于肿瘤侵袭深度≤5 mm、临床T2分期、无颈淋巴结转移、中高分化患者（P<0.05）。AQP3阳性表达的口腔鳞癌患者,术后3年生存率（65.85%）显著低于阴性表达患者（90.00%,P<0.05）。Cox回归分析显示,肿瘤临床分期、分化程度、颈淋巴结转移情况、AQP3阳性表达率是影响总生存率的独立预后因素（P<0.05）。结论: 口腔鳞癌患者口腔黏膜组织中AQP3阳性表达率显著高于口腔黏膜上皮异常增生者,AQP3表达与口腔鳞癌患者临床分期、颈淋巴结转移、分化程度、肿瘤侵袭深度及总生存率相关。     

腺病毒介导的人端粒酶反转录酶牙周膜细胞系的建立

目的 通过腺病毒法建立稳定表达外源性人端粒酶反转录酶（hTERT）基因的牙周膜细胞系,以构建腺病毒介导的高效、稳定的hTERT牙周膜细胞系。方法 聚合酶链反应（PCR）法扩增hTERT基因编码序列,构建同源重组腺病毒质粒pAd-pshuttle-cmv-hTERT,收集腺病毒颗粒后感染人牙周膜细胞,实时荧光定量PCR检测hTERT及成骨相关基因碱性磷酸酶、核心结合因子2、骨涎蛋白、骨钙素、骨桥素、Ⅰ型胶原蛋白mRNA的表达水平,茜素红染色观察成骨分化能力,CCK-8检测细胞增殖能力。结果 成功构建了含hTERT基因的腺病毒颗粒并感染牙周膜细胞,感染细胞与正常牙周膜细胞形态相似;实时荧光定量PCR结果显示hTERT及成骨相关基因在感染细胞中高表达;茜素红染色显示牙周膜细胞系成骨能力强;CCK-8结果示牙周膜细胞系增殖能力强。结论 通过腺病毒法成功建立了过表达hTERT的人牙周膜细胞系,其具有较强的成骨分化能力,这为研究牙周膜再生机制提供了一个理想的细胞系。     

端粒酶逆转录酶mRNA在OLP和OSCC中的表达

目的：探讨端粒酶逆转录酶（TERT）mRNA在口腔扁平苔藓（OLP）和口腔鳞状细胞癌（OSCC）中的表达以及在OLP癌变过程中的作用。方法：应用mRNA原位杂交法对正常口腔黏膜12例,非糜烂型OLP20例,糜烂型OLP20例及OSCC20例,进行hTERTmRNA的检测。结果：正常口腔黏膜、非糜烂型OLP、糜烂型OLP及OSCC中hTERTmRNA阳性表达率分别为8.33％（1／12）、15％（3／20）、45％（9／20）、80％（16／20）。其中,除正常口腔黏膜与非糜烂型OLP中hTERT mRNA阳性率无显著性差异外,其余各组间均有显著性差异（P〈0.05）。而且,正常口腔黏膜与非糜烂型OLP的hTERT mRNA染色强度明显低于糜烂型OLP及OSCC（P〈0.05）。结论：hTERT mRNA可能在糜烂型OLP的癌变过程起着一定的作用。