登革2型病毒单克隆抗体的制备与鉴定

用登革2型病毒参考株免疫的BALB/C小鼠脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞在PEG1000作用下进行融合,获得了10株分泌抗登革2型病毒单克隆抗体的杂交瘤。经间接免疫荧光鉴定,有4株杂交瘤产生的单克隆抗体对登革2型病毒是型特异的;2株对登革1型有交叉反应;1株对登革3型有交叉反应;1株对登革4型有交叉反应;另2株为黄病毒属特异的。经补体结合和血凝抑制试验鉴定,有2个单克隆抗体是黄病毒属血凝抑制特异的。这10个单克隆抗体对登革热的诊断是很有用的。     

用单克隆抗体快速鉴定登革病毒

用登革病毒参考株免疫的BALB/C鼠的脾细胞与SP2/O鼠骨髓瘤细胞融合,成功地建立了分泌抗登革1～4型病毒单克隆抗体的杂交瘤31株。经免疫荧光交叉鉴定,其中17株杂交瘤的抗体是属登革型特异的。用4个型特异的单克隆抗体对国内分离的12令登革地方毒株进行了免疫荧光的快速鉴定,获得了高度敏感高度特异的结果。证明获得的单克隆抗体可以作为免疫荧光诊断制剂,提供登革热病原的快速鉴定应用。     

登革1型病毒的单克隆抗体

我们用SP2/0-Ag14小鼠骨髓瘤细胞与用登革1型病毒免疫的BALB/C小鼠脾细胞在融合剂PEG-1000的诱导下进行融合,获得了15株产生抗登革1型病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞系。其中14株属登革病毒型特异,1株属登革病毒亚群特异,它们的荧光效价均在10,240以上。15株杂交瘤均无血凝活性,3株有补体结合活性。1D_4,1B_9的IgG亚类为IgG_1,1F_(11)为IgG_2a,轻链均为K型。1株杂交瘤(1D_4)的染色体数为87～115。用SDS-PAGE测定1D_4分子量,重链为54,000,轻链为24,000。15株杂交瘤连续传代3～6个月,冻存复苏后抗体水平未见下降。     

基孔肯亚病毒中和单克隆抗体的筛选与鉴定

目的 :建立抗基孔肯亚病毒单克隆抗体细胞株 ,筛选具有中和活性的特异性单克隆抗体。方法 :利用细胞融合技术建立抗基孔肯亚病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株 ,用细胞培养中和试验初筛具有中和活性的单克隆抗体 ,用固定单克隆抗体稀释病毒方法进行乳鼠中和试验 ,进一步验证单克隆抗体的保护作用 ;用中和交叉试验鉴定中和单克隆抗体反应的特异性。结果 :用免疫荧光法检测建立了 9株能稳定分泌抗基孔肯亚病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株 ,初筛出 4株具有中和活性的单克隆抗体 ,其中 1F1单克隆抗体稀释 2 0 0倍时可保护 50 %细胞不产生细胞病变 ;乳鼠中和试验1F1单克隆抗体中和指数为 10 3.3,对试验小鼠有较强的保护作用。中和交叉试验表明 ,1F1单克隆抗体只中和基孔肯亚病毒 ,与其他病毒无交叉反应 ,特异性较高。结论 :制备了 9株抗基孔肯亚病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株 ,筛选得到了 1F1具有较强中和活性的特异性单克隆抗体 ,可望为基孔肯亚病毒病的诊断、紧急预防与治疗提供良好试剂     

登革4型病毒的单克隆抗体

用SP2/0小鼠骨髓瘤细胞与用登革4型病毒免疫的鼠脾细胞,在PEG—1000的作用下进行融合,获得了8株产生抗登革4型病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞系。其中5株杂交瘤产生的抗体,对登革4型病毒具有荧光型特异性,1株对登革1型病毒有交叉反应;另2株对登革2型病毒有交叉反应。对上述8株杂交瘤分泌的抗体又进行了补体结合、空斑抑制中和及血凝抑制试验的鉴定,结果有2株是补体结合型特异,另4株有低度的中和活性。然后用3个荧光型特异的单克隆抗体对5个地方毒株进行试用的结果,进一步验证了它们的特异性。上述杂交瘤稳定传代7个月后,冻存于液氮中。     

产生抗登革4型病毒单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立

用登革4型H241株病毒免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,获得了5个产生抗登革4型病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞系。这些杂交瘤细胞的上清液及小鼠腹水抗体均用间接免疫荧光法检测。其中两个杂交瘤细胞系产生的抗体对登革4型病毒具有型特异性,它们的荧光抗体滴度分别为1:10,240～1:20,480和1:2,560。另两个细胞系产生的抗体对登革2型病毒有交叉;另1个对登革1型病毒有交叉。     

登革病毒单克隆抗体鉴定及其血清学性质观察

利用补体结合试验(CF)和血凝抑制试验(HI)对83份免疫荧光阳性的登革病毒单克隆抗体进行了鉴定,11份CF阳性,8份HI阳性。登革1型和4型病毒的单克隆抗体仅有CF活性,其中4F_7和4F_9滴度达到1:20480～1:40960,并且为CF型特异。而登革2型和3型病毒的单克隆抗体,则仅有HI活性,除3D_4为HI型特异外,其余均为HI属特异,与其他黄病毒属抗原有明显交叉。     

非洲猪瘟病毒CD2v胞外区蛋白的真核表达及其单克隆抗体的制备与功能分析

目的 利用真核表达系统制备非洲猪瘟病毒（ASFV）CD2v分子N端胞外区融合蛋白,并作为抗原免疫和筛选特异性识别CD2v单克隆抗体。方法 以pcDNA3.1-CD2v-HA质粒（含ASFV-BA71v株EP402R基因全长编码序列和HA标签）为模板,扩增CD2v蛋白胞外区碱基序列,构建真核表达载体pcDNA3.1-N-CD2v-His,通过Expi-293表达系统获得重组N-CD2v-His蛋白。将纯化后的蛋白免疫小鼠,利用杂交瘤细胞技术制备特异识别CD2v分子单克隆抗体,对获得的抗体经酶联免疫吸附实验（ELISA）、Western印迹以及间接免疫荧光等方法进行鉴定。结果N-CD2v-His融合蛋白基因被成功构建到真核表达载体上,转染Expi-293F细胞收获重组蛋白,纯蛋白经SDS-PAGE分析发现,N-CD2v-His融合蛋白条带呈高度糖基化修饰的梯状分布。用该融合蛋白免疫小鼠,经杂交瘤细胞筛选,获得2株高亲合活性单克隆抗体,2株抗体经间接ELISA、Western印迹及免疫荧光实验等检测均能特异识别糖基化修饰的CD2v全长蛋白。结论 成功制备了抗CD2v特异性单克隆抗体,为进一步...     

用免疫荧光法筛选抗人μ链单克隆抗体的研究

用人血清IgM球蛋白重链——μ链免疫的BALB/C小鼠脾细胞与鼠骨髓瘤SP2/0细胞在聚乙二醇(PEG)作用下融合,用改进的免疫荧光技术筛选出6株分泌单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞,其中5株分泌物确定为抗人μ链McAb,1株未定.杂交瘤细胞经4次克隆,半年多传代,接种BALB/C鼠可稳定地产生腹水抗体.     

肾综合征出血热病毒单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立与鉴定

用陕西省分离的肾综合征出血热(HFRS)病毒82-010H株免疫BALB/c纯系鼠和CxS/2小鼠,取免疫鼠脾细胞与SP2/O小鼠骨髓瘤细胞融合,获得10株分泌HFRS病毒特异性抗体的杂交瘤细胞系,对其中3H_4和4B_9两株单克隆抗体进行了鉴定。用各地分离的16株HFRS病毒抗原片与该两株单克隆抗体作了间接免疫荧光试验,结果表明:4B_9单克隆抗体只能与重型(黑线姬鼠型)HFRS疫区的病毒呈现阳性免疫荧光反应,而对轻型(褐家鼠及大林姬鼠型)HFRS疫区分离的病毒株不呈现免疫荧光反应;而3H_4单克隆抗体又能将重型和轻型HFRS毒株再行区分,这可能对HFRS病毒血清学分型和抗原分析以及流行病学调查研究等均有意义。     

抗人IgM（μ链）单克隆抗体的制备

本实验用可溶性抗原人 IgM 免疫 BALB/C 小鼠,按常规方法取免疫鼠脾细胞,分别与 NS-1、SP2/0细胞进行融合,ELISA 法筛选只与 IgM 反应阳性的抗体分泌杂交细胞,建立了6株杂交瘤株。经鉴定,此6株细胞分泌的抗体与 IgM 产生特异性反应,而不与其它免疫球蛋白重、轻链及 J 链交叉反应。经免疫电转印的硝酸纤维膜染色只显示分子量为72kD 的电泳带。放射免疫方法检测6个单克隆抗体,可分别识别4个不同的抗原决定簇。此组抗体识别 B 细胞胞浆内及膜表面μ链并可检测乙型病毒性肝炎患者血清中 HB_C-IgM 复合物。本组抗体间彼此加合可提高检测的灵敏性。抗 IgM(μ链)单克隆抗体对研究人 B 细胞的分化、成熟及功能提供了重要途径。     

脾内注射法免疫小鼠制备抗—HBc单克隆抗体的研究

用基因工程菌产乙型肝炎核心抗原(HBcAg)对 Balb/c 小鼠脾内多点注射法免疫,将该鼠的脾淋巴细胞与鼠骨髓瘤细胞在 PEG 作用下融合,用固相放射免疫分析法(SPRIA)筛选,成功地获得了2株抗-HBc 阳性的杂交瘤细胞株。通过中和试验和交叉鉴定,2株抗-HBc 单克隆抗体只能与 HBcAg 起反应,而不能与 HBsAg 和 HBeAg 反应。经多次亚克隆后,所得腹水中的抗-HBc 滴度达1:64000～1:28000。这2株单克隆抗体做包被抗体检测 HBcAg 和(125)~Ⅰ标记查患者血清标本时,所测得的结果与人抗-HBc 多克隆抗体做包被或(125)~Ⅰ标记所测得的结果相一致。2株杂交瘤细胞连续传代3个多月,冻存复苏后仍能稳定地分泌特异的抗-HBc 单克隆抗体。     

利用DNA免疫建立分泌登革2型病毒E蛋白单抗的杂交瘤细胞系

目的:利用DNA免疫建立分泌登革2型病毒E蛋白特异单抗的杂交瘤细胞系,为研究E蛋白的结构和功能及其抗原表位提供新手段.方法:以构建的病毒全长prM-E基因的真核重组质粒DNA作为免疫原,免疫BALB/c小鼠后将其脾细胞和SP2/0瘤细胞融合,通过IFA、间接ELISA和空斑减少中和试验对杂交瘤细胞系进行筛选和鉴定.结果:获得了4株分泌登革2型病毒E蛋白单抗的杂交瘤细胞系(2B4,6B4,4C10和2D5),它们结合的抗原表位均位于E蛋白Ⅲ区,其中4C10对登革2型病毒具有中和活性.这些单抗与登革1、3和4型病毒有强的交叉反应,但与黄病毒其他成员反应较弱.结论:DNA免疫法可用于分泌登革2型病毒E蛋白特异单抗的杂交瘤细胞系的建立,该结果有利于登革病毒E蛋白特异抗原表位的研究及新的登革病毒诊断试剂的研制.     

咪唑啉受体抗血清选择性蛋白的表达、纯化及单克隆抗体制备

目的:表达和纯化咪唑啉受体抗血清选择性蛋白(imidazoline receptor antiserum-selected protein,IRAS protein),制备IRAS蛋白的单克隆抗体.方法:采用基因重组技术在大肠杆菌表达IRAS蛋白;金属镍螯合的Ni-NTA亲和层析柱进行蛋白纯化;杂交瘤技术建立分泌IRAS单克隆抗体的杂交瘤细胞株;以间接ELISA方法筛选分泌特异性IRAS单克隆抗体的杂交瘤细胞;采用蛋白免疫印迹、间接免疫荧光方法鉴定单克隆抗体的特异性.结果:成功表达并纯化了IRAS重组蛋白,纯度达到95%.共筛选出5株分泌IRAS单克隆抗体的杂交瘤细胞株,制备腹水并纯化了IRAS的单克隆抗体,腹水中单克隆抗体效价分别为1∶ 8×106,1∶ 2×106和1∶ 5×106,属于IgG1亚型.该抗体能与原核及真核系统表达的IRAS重组蛋白发生特异性反应,间接免疫荧光显示IRAS蛋白主要定位于细胞质中.结论:建立了稳定分泌IRAS单克隆抗体的杂交瘤细胞株,成功制备了特异性好的IRAS单克隆抗体,为研究IRAS的功能提供了有力的研究工具.     

抗T-2毒素单克隆抗体的制备及特性

目的 :建立敏感、特异和快速的针对T 2毒素的ELISA检测方法 ,形成具有我国自主知识产权的快速检测试剂盒。方法 :利用B细胞杂交瘤技术 ,建立抗T 2毒素的单克隆杂交瘤细胞株。结果 :用T 2 羊免疫球蛋白 (T 2 GIgG)偶联物免疫 8～ 10周龄雌性BALB/c小鼠后 ,取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系Sp2 /0融合 ,经过 3～ 4次亚克隆建立了 2个稳定分泌抗T 2毒素抗体的杂交瘤细胞株 ,分别命名为 2A7和 6E4。将上述 2株杂交瘤细胞分别注入BALB/c小鼠腹腔 ,获得含抗T 2毒素单克隆抗体的腹水 ,并将腹水用饱和硫酸铵法进行纯化 ,得到 2A7和 6E4单克隆抗体。两株单克隆抗体的Ig亚类为IgG1,腹水中抗体的滴度分别为 6 .4× 10 6和 1.1× 10 7,参考工作浓度分别为1.0× 10 6和 3.2× 10 6。纯化后 2A7抗体的IgG含量为 16 .4g/L ,亲和常数为 8× 10 -8mol/L。 2A7抗体与其他结构类似物无交叉反应 ,具有较高的特异性。结论 :制备了具有高特异性和亲和力的抗T 2毒素单克隆抗体 ,初步建立了针对T 2毒素的ELISA检测方法。     

抗大鼠HSP70蛋白单克隆抗体的制备及特性研究

目的制备大鼠HSP70蛋白单克隆抗体并对其性质进行研究。方法利用PCR技术扩增大鼠全长hsp70,插入表达质粒pET-28a,pMAL-c2x,诱导表达,采用亲和层析纯化融合蛋白;用HIS-HSP70融合蛋白免疫BALB/c小鼠,杂交瘤技术制备大鼠HSP70单克隆抗体;采用Western印迹和免疫组化方法对抗体性质进行鉴定,ELISA方法确定抗体的表型。结果亲和层析纯化HIS-HSP70蛋白纯度在97.6%,获得6株可稳定分泌抗HSP70mAb的杂交瘤细胞系;抗体的亚类均是IgG1类κ链的。Western印迹结果显示6株单抗均能识别天然的大鼠HSP70蛋白;免疫组化结果显示3株抗体可以识别组织的HSP70蛋白。结论成功获得6株有活性HSP70单克隆抗体,可以识别HSP70蛋白不同表位,为进一步研究HSP70单克隆抗体在疾病中的作用奠定基础。     

分泌抗B型肉毒毒素单克隆抗体的产生与特性鉴定

以B型肉毒类毒素免疫BALB/C小鼠,取脾细胞与NS-1骨髓瘤细胞进行细胞融合。用ELISA方法筛选有杂交细胞生长孔的上清液,其中有66.7％的孔可分泌肉毒毒素特异性抗体。用有限稀释法进行克隆化培养后,获得4株稳定的杂交瘤细胞系(3B10、3B11、3G12和4A5),在体外培养中均持续分泌抗体,培养液抗体效价达10~(-3)～10~(-5);注入BALB/C小鼠腹腔制备出富含抗体的腹水,抗体效价达10~(-6)～10~(-8)。经用A型和B型类毒素作特异性鉴定,表明抗体3G12及4A5与A型无交叉反应,为B型特异性的。抗体3B10及3B11与A型有弱交叉反应。Ig种类鉴定表明抗体3B10及3G12为IgG_1;抗体3B11及4A5为IgG_2。染色体检查证明4株细胞均为杂交瘤细胞。小白鼠体内进行中和保护力测定表明4种单克隆抗体对肉毒毒素均无保护作用。     

抗工程菌产HBcAg单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立

本文用纯化的工程菌产HBcAg免疫Balb/C小鼠,将该鼠的脾淋巴细胞与鼠骨髓瘤细胞在聚乙二醇作用下融合,获得2株抗-HBc阳性、与工程菌茵体蛋白无交叉反应的杂交瘤细胞系.2个亚株经体外培养两月余,传代20次,液氮反复冻存、复苏3次,仍能稳定分泌抗-HBc.该细胞接种经石蜡油致敏的Balb/C小鼠腹腔,产生抗-HBc腹水.其中1株经鉴定,其抗体亚类为IgG2a.     

抗鸡蛋黄IgY单克隆抗体的制备和初步鉴定

以纯化的鸡蛋黄IgG(IgY)为免疫原,免疫BACB/c小鼠.取其脾细胞与小鼠Sp/o骨髓瘤细胞融合,经间接EIISA筛选,3次克隆化后,获得2株能稳定分泌抗IgY单克隆抗体的杂交瘤细胞IGII和3A6.用琼脂双扩散法鉴定,两者均为IgG_1亚类.特异性鉴定表明,IGII和3A6两株单克隆抗体均与鸡血清IgG及鸡蛋黄IgG起强反应,而不与鸭蛋黄、鹌鹑蛋黄、小鼠血清、大鼠血清、兔血清、羊血清、马血清,以及人血清的IgG起反应.IGII与3A6的腹水效价分别为3.1×10~(-6)和6.4×10~(-6).     

产生抗单纯疱疹病毒单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立

用HSV-1 SM44株免疫C×S/1小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/O融合,经HAT选择培养,细胞融合率为100％。ELISA筛选后获得53孔产生抗HSV抗体的杂交瘤阳性孔。对1A12,2A8,1G8,1D10,2C5 5株细胞系用有限稀释法做2～5次克隆化,阳性克隆率均达到100％。杂交瘤细胞系经连续传代培养4个月,仍能稳定产生单克隆抗体,冻存的细胞系经复苏后亦能稳定产生抗体。应用ELISA及IF试验证明,5种单克隆抗体均与HSV-1和HSV-2标准株呈特异性反应。ELISA测定,杂交瘤培养上清抗体效价为10~(-2)～10~(-3),制备免疫腹水效价为10~(-4)～10~(-7)。5种单克隆抗体与EBV,CMV,JEV和HFRSV无交叉反应。