乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因XTP4的克隆化研究

目的 筛选并克隆乙型肝炎病毒X蛋白(HBxAg)反式激活新型靶基因。方法 以HBxAg表达质粒pcDNA3．1(-)-X转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析,应用生物信息学方法对所获基因片段序列进行分析发现,其中之一为新型基因片段,与GenBank(中注册的已知功能基因序列没有同源性。通过序列同源性搜索、比对和电子拼接,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新型基因序列。从转染了pcDNA3．1(-)-X的HepG2细胞提取总RNA,以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增,获得阳性克隆之后,进行鉴定并对克隆的基因及其编码产物的序列进行分析。结果 该新基因的编码序列全长为348个核苷酸(nt),编码产物由116个氨基酸残基(aa)组成,并测序证实,命名为XTP4,在Gen-Bank中注册,注册号为AF490253。结论 通过分子生物学技术与生物信息学技术的结合,发现并鉴定、克隆HBxAg反式激活作用的新型靶基因XTP4,为进一步研究HBxAg反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP3的克隆化研究

目的 筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)反式激活新型靶基因。方法 以HCV NSSA表达质粒pcDNA3．1(-)-NSSA转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析,应用生物信息学方法对所获基因片段序列进行分析发现,其中有新型基因片段,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性。通过序列同源性搜索、比对和电子拼接,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新型基因序列。从转染了pcDNA3．1(-)-NS5A的HepG2细胞提取总RNA,以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增,获得阳性克隆之后,进行鉴定并对克隆的基因及其编码产物的序列进行分析。结果 该新基因的编码序列全长为1572nt,编码产物由524aa组成,并测序证实,命名为NS5ATP3,在GentBank中注册,注册号为AF529364。结论 分子生物学技术与生物信息学技术相结合,发现并鉴定、克隆了HCV NSSA反式激活作用的新型靶基因NS5ATP3,为进一步研究HBxAg反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础。     

丙型肝炎病毒核心蛋白反式激活基因TAHCCP1的克隆化研究

目的 筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白(core)反式激活的新型靶基因。方法 以HCV核心蛋白表达质粒pcDNA3．1(-)-core转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。分析筛选出来的基因,其中之一与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性。通过序列同源性搜索比对及电子拼接,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新型基因序列。从转染pcDNA3．1(-)-core的HepG2细胞提取总RNA,以RT-PCR技术扩增获得该新基因的全长序列,并对克隆的基因及其编码产物的序列进行分析。结果该新基因的编码序列全长为2001nt,编码产物由667aa组成,并测序证实,命名为TAHCCP1,在GenBank中注册,注册号为AY038359。结论 发现并鉴定、克隆了HCV核心蛋白反式激活作用的新型靶基因TAHCCP1,为进一步研究HCV核心蛋白反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定了基础。     

三氧化二砷反式激活基因AsTP2的克隆化及生物信息学分析

目的三氧化二砷反式激活靶基因(AsTP2)的克隆化研究。方法对构建的三氧化二砷差异表达的肝HepG2细胞cDNA消减文库进行筛选，利用RT-PCR技术获得新基因AstTP2的编码序列，结合生物信息学对其氨基酸序列、染色体定位和基因功能进行分析比较。结果AsTP2基因编码区为1119nt，编码产物为372aa。经核苷酸序列数据库(GenBank)和蛋白质一级结构序列数据库(SwissProt)同源序列的搜寻，发现未知功能的同源蛋白，说明克隆的AsTP2基因属于未知功能新基因，GenBank注册号为AY744366。该基因在三氧化二砷诱导的HepG2细胞中表达上调。结论克隆了一条新的三氧化二砷反式激活靶基因AsTP2，为进一步研究三氧化二砷的反式激活作用和揭示砷致癌的生物学机制提供新线索。     

人脑源性神经营养因子序列的获得及鉴定

 目的 获得人脑源性神经营养因子(hBDNF)基因并进行序列分析,为基因治疗提供参考.方法 提取胚胎脑组织基因组mRNA,应用RT-PCR技术获得hBDNF基因序列酶切鉴定,并进行序列测定和分析.结果 DNA序列测定的结果与GenBank提供的已知序列(AY054406)比较,所克隆的hBDNF基因从起始密码子ATG到终止密码子TAG全长共744 bp,序列完全相同.结论 hBDNF基因序列的获得,为进一步开展面神经损伤的基因治疗积累了资料.     

人类内皮活化相关新基因EOLA1的发现及初步研究

为克隆一个在人脐静脉内皮细胞受脂多糖刺激后表达新序列标签ST5 5 (GenBank接受号BI12 16 4 6 )对应基因全长cDNA序列 ,作者在已知ST5 5序列基础上 ,采用快速扩增cDNA末端(RACE)技术延伸ST5 5的 3′和 5′末端以获取其全长cDNA序列 ,并经Northern印迹杂交验证 ,再对序列进行生物信息学分析 ,获得一个新的人类基因 ,命名为内皮细胞高表达脂多糖相关因子 1(EOLA1) (GenBank接受号AY0 74 889) ,该基因定位于人染色体Xq2 7.3,推导编码蛋白EOLA1包含 15 8个氨基酸 ,预测EOLA1是与内皮细胞活化相关的新基因 ,可能在细胞内信号转导中发挥作用     

IRM-2小鼠全长cDNA编码蛋白质分析

目的 分离和鉴定IRM-2小鼠辐射抗性相关基因.方法 以IRM-2小鼠的21条表达序列标签为模板进行PCR扩增,从IRM-2小鼠全长cDNA文库中测定cDNA克隆的序列,通过与GenBank进行同源序列信息比对,对全长cDNA编码的蛋白质进行分析.结果 从IRM-2小鼠全长cDNA文库中获得5条全长cDNA序列,与小鼠已知基因不同源,得到了可能编码蛋白质的氨基酸序列和蛋白质的理化性质等信息.结论 通过对全长cDNA编码的蛋白质进行分析,提示IRM-2小鼠体内可能存在目前尚未发现的辐射抗性相关基因.     

利用套叠PCR技术合成人胰岛素原基因的临床研究

目的设计并分子克隆适宜于大肠杆菌表达系统的人胰岛素原基因。方法以美国国家基因库（GenBank）发布的人胰岛素原的氨基酸序列为模板,参考大肠杆菌表达系统的密码子偏好性以及所用表达载体（pGEX-3x）的特点,经计算机分析、设计人胰岛素原基因为8个寡核苷酸片段,以重叠延伸PCR（SOE-PCR）技术体外延伸获得完整的人胰岛素原基因,分子克隆后测定所得基因的核苷酸序列。结果经限制性内切酶分析确定为重组克隆的质粒进行核苷酸序列分析,结果表明,我们所克隆的基因序列完全符合我们先前的设计。结论SOE-PCR技术可用于体外寡核苷酸片段的延伸并获得完整长度的基因。TaqDNA聚合酶延伸反应前以Klenow片段处理可提高较短覆盖末端或较低专一性末端正确延伸的成功率。     

乙型肝炎病毒基因组中前-X-编码基因启动子序列的确定及转录活性的鉴定

利用长距离精确聚合酶链反应 (LA PCR)扩增慢性乙型肝炎患者血清来源的 5个全长的HBV基因组DNA ,在分析不同克隆之间的序列变异程度时 ,发现所获得的 5个克隆在X区之前可能还存在一个开放读码框架 (ORF) ,长度 16 8bp ,编码 5 6个氨基酸残基(aa) ,并将其暂时命名为前 X(pre X)。为了解前 X编码区上游DNA序列是否具有启动子活性 ,选取翻译起始密码子ATG上游 2 2 5bp的基因片段 ,将其克隆至报告基因表达载体pCAT3中 ,构建pCAT3 前 X promoter表达载体 ,以该质粒转染HepG2细胞 ,用ELISA法检测报告基因编码产物氯霉素乙酰转移酶 (CAT)的表达活性。结果发现 ,质粒 pCAT3 前 X promoter能够指导CAT的表达 ,吸光度 (A值 )是pCAT3的 3 5倍 ,提示pCAT3 前 X promoter中插入的DNA序列具有启动子活性 ,说明这一段基因序列中存在新的启动子区 ,为研究、界定前 X的ORF的存在提供了直接的依据。     

增强型RACE技术克隆辐射诱导小鼠肠上皮新基因RS1

目的 在获得了辐射诱导小鼠肠上皮新基因RS1 EST序列的基础上获得全长cDNA。方法RT-PCR方法对RS1基因进行表达谱分析，找到表达丰度较高的组织提取总RNA作为模板，应用增强RACE技术即结合生物素探针富集靶cDNA的方法克隆RS1的cDNA末端。结果克隆到RS1片段3′端约2kb的序列。该序列5′端包含已知的RS1片段，3′端具有明显的polyA加尾信号，有编码区的终止密码子。明确了RS1的正、负链及其蛋白编码方向，为RS1 5′端的克隆提供了必要信息。结论 结果与本实验的设计完全一致，说明这一方法对从表达丰度低，难以设计最佳基因特异性引物的EST序列克隆其对应的全长cDNA是可行的，同时为下一步研究RS1在小鼠肠上皮辐射应激反应中的作用和被辐射诱导表达的调控模式奠定了基础。     

原代白血病细胞IL-6受体α表达的实验研究

目的：分析不同类型原代白血病细胞IL-6R基因及IL-6R蛋白的表达情况。方法：采用RT-PCR方法对取自29例白血病患者的原代白血病细胞和8例健康人外周血单个核细胞的IL-6R基因表达情况进行了分析，并应用原位杂交技术和免疫组织化学方法对细胞表面的IL-6受体蛋白进行了检测。结果：20例急性髓细胞白血病均明显表达IL-6R mRNA；9例急性淋巴细胞白血病中有2例为阳性，其余7例为阴性；8例正常人PBMC中6例阴性。2例有弱表达。免疫组化和原位杂交结果与RT-PCR实验结果相一致。结论：IL-6R可作为急性髓系白血病免疫治疗的候选靶位点。     

低剂量照射对慢性髓细胞白血病干细胞p16基因mRNA表达水平的影响及其意义

目的 探讨低剂量辐射(LDR)对慢性髓细胞白血病干细胞(LSCs)中P16基因转录表达的影响及其临床意义。 方法 取20例健康产妇脐血100 ml,免疫磁株法分离纯化CD34+、CD38-的正常造血干细胞(HSCs)作为对照组;取20例初诊慢性髓细胞白血病(CML)慢性期患者骨髓液5~10 ml,免疫磁株法分离纯化CD34+、CD38-、CD123+的LSCs作为实验组。将HSCs及LSCs依据LDR剂量(0、12.5和50 cGy)辐照后收集细胞行RT-PCR和荧光实时定量PCR检测两种干细胞中p16基因的变化;另辐照后分别于24、48和72 h收集细胞,流式细胞仪检测两种干细胞的细胞周期和凋亡率。结果 CML-LSCs经12.5 cGy剂量照射后P16 mRNA表达略上调,50 cGy照射后明显增高(Z=-3.39,P＜0.01),而HSCs经各剂量点LDR处理后p16基因转录水平无明显变化。CML-LSCs经12.5 cGy剂量处理后48 h出现G₀/G₁期阻滞,50 cGy剂量点照射后72 h出现了G₀/G₁期阻滞现象。CML-LSCs经LDR处理后,细胞的早期凋亡率随时间推移逐渐增加,50 cGy剂量照射后72 h处达到(17.75±11.76) %,与未照射组 (6.13±4.71)%相比差异有统计学意义(Z=-2.37,P＜0.05)。 结论 LDR可诱导CML-LSCs中P16基因转录水平的表达上调,使得CML-LSCs阻滞在G₀/G₁期,促进LSCs的凋亡,为P16基因作为CML中治疗的靶点及LDR在白血病中的应用提供理论依据。     

慢性髓系白血病bcr—abl融合基因在真核细胞中的表达

克隆慢性髓系白血病（CML）融合基因bcr-abl融合位点周围的cDNA序列,构建重组真核表达载体并表达于p815细胞,探索bcr-abl基因免疫治疗CML的可行性,设计两条引物扩增bcr-abl融合位点周围468bp的cDNA,测序正确后,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1通过电穿法转染至p815细胞中,应用G418筛选阳性细胞克隆,在含10％FCS的RPMI1640中常规培养,收集细胞进行RT－PCR鉴定。结果PCR扩增出了可用于基因免疫的位于bcr-abl融合基因位点周围的468bp的cDNA,序列测定除第448位碱基C突变为T外其余序列均正确,构建了重组真核表达载体,并用电穿孔法将其转染p815细胞,RT－PCR法检测到该细胞系有bcr-ablmRNA水平的表达。     

Increased and decreased expression of CD69 and CD23, respectively, in gravity-stressed lymphocytes

BACKGROUND: Recent studies have shown that gravity-changing stress modulates expression levels of cell surface molecules on human lymphocytes. However, previous in vitro microgravity studies have been performed with lymphocytes treated with mitogenic agents. HYPOTHESIS: The aim of the study was to test if exposure of cells to gravity-changing stress alone alters the expression levels of cell surface molecules. Specifically, we examined whether the expression of activation markers is altered after exposure of lymphocytes to combinations of microgravity and hypergravity. METHODS: We used free-fall in parabolic flight for human subjects and a drop-shaft to expose peripheral blood mononuclear cells (PBMC) to gravity-changing stress. After such exposure, PBMC were isolated, and expression levels of CD69, CD23 and CD38 were estimated using three-color flow cytometry. RESULTS: Increased percentages of CD69-positive cells were observed with PBMC from 3 of 4 volunteers who undertook 10 parabolic flights. Exposure of blood to gravity-changing stress in the drop-shaft increased both ratios of CD69-positive cells and levels of CD69 expression on T and B cells. In contrast, the percentages of CD23-positive B cells was decreased. However, gravity-changing stress was not always followed by significant alteration in CD38 expression. CONCLUSIONS: Our findings suggest that CD69 and CD23 might be useful markers that are up- and down-regulated, respectively, after exposure of lymphocytes to gravity-changing stress.     

慢性粒细胞性白血病中SHIP1基因的表达变化及机制探讨

目的观察SHIP1基因在慢性粒细胞性白血病(CML)患者中的表达变化,并通过特异性小干扰RNA(siRNA)封闭K562细胞株BCR-ABL基因的表达,探讨BCR-ABL基因表达对SHIP1基因的影响。方法应用RQ-PCR方法检测CML患者骨髓、正常人外周血白细胞及白血病细胞株K562中SHIP1基因表达的差异。另取K562细胞分为3组:空白对照组(不加任何干扰成分);非特异性siRNA处理组(加非特异性siRNA);特异性siRNA处理组(加入特异性siRNA封闭BCR/ABL融合基因),应用RQ-PCR及Western blot方法分别检测3组中BCR/ABL、SHIP1基因的mRNA及其相应蛋白P210(BCR/ABL编码)、P145(SHIP1基因编码)的表达,并比较各组中表达水平的变化。结果CML患者骨髓白细胞和K562细胞中SHIP1基因的表达明显低于正常人的外周血白细胞。特异性siRNA处理组中BCR-ABL基因mRNA和P210蛋白的表达水平明显下降,SHIP1基因mRNA和P145蛋白表达水平随BCR-ABL表达下降而增加;非特异性siRNA处理组与空白组相比无明显差异。结论CML患者SHIP1基因的表达低于正常人;特异性siRNA能够抑制BCR-ABL基因的表达;BCR-ABL基因能抑制SHIP1基因及其蛋白表达。