KLF5对吉西他滨诱导的肺腺癌细胞凋亡的促进作用及其机制

目的 研究krüppel-like factor 5基因（KLF5）的表达对吉西他滨介导的肺腺癌细胞凋亡的影响及分子机制。 方法 在体外培养的肺腺癌细胞H441中,分别转染KLF5表达质粒和空载体对照质粒培养68 h后,加入100 nmol/L的凋亡诱导药物吉西他滨处理4 h,使用细胞计数和流式细胞术方法检测细胞增殖和凋亡; Western blot检测KLF5蛋白的表达,RT-PCR检测KLF5及凋亡相关基因CD95和BAX的表达;免疫荧光染色比较凋亡相关蛋白Caspase 3的表达。 结果 Western blot结果证明KLF5转染成功。无吉西他滨诱导情况下,KLF5高表达对H441细胞的凋亡无显著影响,CD95和BAX基因的表达差异无统计学意义;吉西他滨诱导情况下,与对照组相比,KLF5高表达的H441细胞中凋亡细胞比例增加（P<0.05）,CD95和BAX基因的表达上升（P<0.05）,Caspase 3的表达上调。 结论 在吉西他滨诱导下,体外KLF5高表达促进肺腺癌细胞H441的凋亡。其机制可能是通过抑制细胞增殖和修复激活Caspase 3、CD95和BAX等细胞凋亡通路相关蛋白实现。     

RNA干扰AKT2影响人胰腺癌细胞株裸鼠移植瘤对吉西他滨的敏感性

目的 探讨RNA干扰AKT2对人胰腺癌细胞株裸鼠移植瘤对吉西他滨敏感性的影响.方法 构建荷胰腺癌裸鼠模型,采用腹腔给药和瘤内注射方式,以吉西他滨配合AKT2 siRNA表达载体对荷瘤鼠进行联合干预治疗,对比观测裸鼠肿瘤生长情况,RT-PCR检测肿瘤细胞AKT2 mRNA的表达,免疫组织化学法检测肿瘤AKT2蛋白表达,DNA末端原位标记法(TUNEL法)检测细胞凋亡指数. 结果化疗+AKT2-siRNA组移植瘤组织中AKT2 mRNA及AKT2蛋白表达明显低于空白对照组、化疗组、化疗+空白质粒组.化疗+AKT2-siRNA组瘤重、肿瘤体积显著低于其他各组.化疗+AKT2-siRNA组抑瘤率、凋亡指数显著高于其他各组.结论 RNA干扰AKT2明显提高人胰腺癌细胞株对吉西他滨化疗的敏感性.     

吉西他滨联合铂治疗晚期肺鳞癌与肺腺癌疗效分析

目的观察吉西他滨对晚期肺鳞癌与肺腺癌治疗的疗效差别,为临床上晚期肺癌的化疗的药物筛选提供依据。方法肺鳞癌组31例与肺腺癌组37例分别接受吉西他滨（1000mg／m^2）加顺铂（75mg／m^2）或卡铂（AUC=5）化疗,每21d为1周期,每2个周期考评疗效。结果鳞癌组31例和腺癌组37例均能进行临床评价。鳞癌组中部分缓解（partial response,PR）为10例（32．2％）,稳定（stable disease,SD）为14例（45．2％）,进展（progressive disease,PD）为7例（22．6％）,完全缓解（complete response,CR）为24例（77．4％）。中位生存期为12月,1年生存率为54．8％（17／31）。腺癌组中PR为11例（29．7％）,SD为18例（48．7％）,PD为8例（21．6％）,CR为29例（78．4％）。中位生存期为9月,1年生存率为29．7％（11／37）。结论吉西他滨对肺鳞癌与肺腺癌的疾病控制相近,但对鳞癌表现出比腺癌更高的生存时间与生存率。     

吉西他滨对膀胱癌细胞敏感性的实验研究

目的:探讨吉西他滨体外对人膀胱癌T24细胞株,以及对不同个体膀胱癌细胞生长抑制的影响,明确吉西他滨对膀胱癌细胞有无明显抑制效应,是否适用于浅表性膀胱癌的术后灌注化疗.方法:体外培养膀胱移行细胞癌T24细胞,用生物荧光肿瘤体外药敏检测技术(ATP-TCA)检测不同浓度吉西他滨对肿瘤胞生长抑制的影响,光学显微镜观察不同时间段肿瘤细胞形态学变化.收集我院经尿道膀胱肿瘤切除术的40例浅表性膀胱癌患者的新鲜肿瘤标本,应用ATP-TCA技术检测肿瘤细胞对的吉西他滨的敏感率.结果:T24膀胱癌细胞株对吉西他滨表现为耐药;吉西他滨作用T24膀胱癌细胞株一定时间后,与对照组相比未见明显细胞凋亡或坏死;ATP-TCA法检测40例不同个体膀胱癌细胞对吉西他滨耐药率为90％.结论:吉西他滨体外对膀胱癌T24细胞株无生长抑制作用,对40例不同个体膀胱癌细胞耐药率为90％,初步说明该药不适合浅表性膀胱癌的术后灌注化疗.     

吉西他滨增强肝癌HepG2细胞体外辐射敏感性的机制研究

目的探讨吉西他滨对肝癌HepG2细胞辐射增敏作用的影响及机制的初步研究。方法采用克隆形成实验计算不同剂量照射后L-Q模型放射生物学参数比和放射增敏比;应用流式细胞技术检测Gemcitabine(GEM)和辐射前后细胞周期及凋亡率的变化。结果经GEM处理后的HepG2细胞组,Survival fraction at 2 Gy(SF2)较未处理组显著偏低,α值显著增高,GEM处理后增加了辐射诱导的G0/G1期细胞阻滞和细胞凋亡。结论 GEM可显著增强HepG2细胞的辐射敏感性,这种作用是通过增强辐射诱导的G0/G1期细胞阻滞和细胞凋亡来实现的。     

吉西他滨联合顺铂对晚期肺鳞癌与肺腺癌的疗效分析

目的：比较吉西他滨联合顺铂对不同病理类型非小细胞癌的疗效差异。方法：选取晚期鳞癌组和腺癌患者作为研究资料,采用吉西他滨联合顺铂进行治疗,比较两组肿瘤缓解情况、安全性评价、生活质量及1年期随访生存率。,结果：两组治疗后肿瘤体缓解情况比较差异无统计学意义（P〉0．05）;两组治疗中主要不良反应比较差异有统计学意义（P〉0．05）;两组生活质量改善情况比较差异无统计学意义（P〉0．05）;腺癌组随访1年生存率高于鳞癌组（P〈0．05）。结论：联合用药对晚期肺鳞癌及肺腺癌的肿瘤缓解情况、安全性及生活质量改善情况相当,但联合用药对肺腺癌组1年期生存率的改善情况较好。     

PUMA与c-myc在吉西他滨诱导CaPan-1细胞凋亡中的作用

目的 研究吉西他滨体外对人胰腺癌CaPan-1细胞生长的作用及机制。方法 将CaPan-1细胞暴露于浓度分别为1、5、10、15μmol／ml的吉西他滨10μl中，RT-PCR法检测细胞中PUMA、bax、bcl-2和c-myc mRNA的表达，MTT检测细胞存活率，流式细胞仪检测细胞凋亡。结果 吉西他滨促进CaPan-1细胞凋亡，抑制细胞生长，并有明显的剂量依赖性；药物处理的细胞凋亡伴有PUMA mRNA和c-myc mRNA上调，而bcl-2 mRNA和bax mRNA无明显变化。结论 吉西他滨通过促进体外CaPan-1细胞凋亡而抑制其生长，其诱导凋亡与表达上调的PUMA和c-myc的协同作用有关。     

吉西他滨联合顺铂治疗非小细胞肺癌的临床观察

目的观察吉西他滨联合顺铂治疗非小细胞肺癌(NSCLC)的临床疗效。方法60例NSCLC初治患者,随机分为联合用药组(30例,吉西他滨联合顺铂治疗)和对照组(30例,单用吉西他滨治疗),所有患者在治疗2个周期结束后行胸部MSCT扫描及体表测量,至少有一个可测量病灶,目标病灶代表所累及的器官,用常规技术测量病灶直径≥20mm或螺旋CT测量直径≥10mm的的病灶;临床表浅病灶如可扪及淋巴结,超声检查作为体表可测量病灶,进行疗效评价。结果2组均无完全缓解,联合用药组临床受益率(以完全缓解+部分缓解+稳定计算)明显高于对照组(83.3%vs53.3%,P<0.05);进展率明显低于对照组(16.7%vs46.7%,P<0.05);不良反应率略高于对照组;2组均无毒性相关死亡病例。结论吉西他滨与顺铂联合化疗治疗NSCLC可取得较好疗效。     

吉西他滨联合顺铂方案治疗晚期肺腺癌的体会

目的:观察应用吉西他滨联合顺铂治疗晚期肺腺癌的疗效、不良反应,以及耐药情况。方法:应用GP方案治疗晚期肺腺癌39例:吉西他滨1000mg/m2,第1、8天静滴,顺铂25mg/m2,第1～3天静滴。每两周期判定疗效1次,至患者出现病情进展或出现无法耐受的副作用。若应用6周期后,仍判定有效患者,给予单药吉西他滨维持治疗。结果:CR1例,PR21例,SD10例,进展7例。其中5例初步判定有效患者在应用6周期后出现进展,8例在进入吉西他滨单药维持阶段出现耐药。最常见不良反应为骨髓抑制,其中以血小板下降为主。结论:吉西他滨联合顺铂治疗晚期肺腺癌疗效确切,副作用可耐受,不易发生耐药。     

腺病毒介导RNA干扰抑制血管内皮生长因子的表达治疗人肺腺癌的实验研究

目的:构建针对人血管内皮生长因子(VEGF)的腺病毒载体pAd-Easy/VEGF,应用RNA干扰的方法,观察其在体内和体外对人肺腺癌细胞株A549生长的抑制作用.方法:应用PCR构建RNA干扰pAd-Easy/VEGF腺病毒载体,并利用该线性化质粒用Lipofectamine 2000转染293细胞,制备携带人VEGF的腺病毒转染A549细胞.荧光显微镜和流式细胞仪观察增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的转染效率,RT-PCR和蛋白质印迹法检测VEGF mRNA的表达,MTT比色法测定活细胞数并绘制细胞生长曲线.同时制备裸鼠A549细胞移植瘤模型,观察肿瘤生长情况.结果:pAd-Easy/VEGF重组质粒经测序证实已把预设人VEGF基因RNA干扰的siRNA模板序列插入载体.转染重组腺病毒及空病毒24 h后流式细胞术测得转染效率分别为100%、99.7%.pAd-Easy/VEGF组VEGF表达水平较生理盐水对照组明显降低.pAd-Easy/VEGF组细胞生长明显减缓.pAd-Easy/VEGF治疗组肿瘤体积和质量明显小于对照组(P＜0.01).结论: pAd-Easy/VEGF介导的VEGF shRNA能有效抑制A549细胞中VEGF的表达,并在体内抑制肿瘤生长.     

RNA干扰血管内皮生长因子受体表达对人肺腺癌细胞的抑制作用

目的:观察人血管内皮生长因子受体(VEGFR)RNA干扰重组腺病毒(Ad-VEGFRshRNA)对人肺腺癌细胞株A549生长的抑制作用.方法:制备携带人VEGFR的RNA干扰重组腺病毒,转染A549细胞,通过荧光显微镜观察转染效率.应用Western印迹法检测A549细胞VEGFR蛋白的表达,MTT比色法测定活细胞数并绘制细胞生长曲线,细胞周期及集落形成试验测定细胞生长抑制情况.同时,制备裸鼠A549细胞移植瘤模型,观察肿瘤生长情况.结果:Western印迹法显示RNA干扰组VEGFR表达水平明显降低;细胞生长曲线表明,RNA干扰后细胞生长明显减缓;细胞周期及集落形成试验提示RNA干扰后肿瘤细胞生长受到明显抑制.裸鼠皮下移植瘤生长情况提示RNA干扰可以显著抑制肿瘤生长.结论:RNA干扰重组腺病毒Ad-VEGFRshRNA能有效抑制A549细胞中VEGFR的表达,并能抑制肿瘤生长.     

靶向C-erbB-2基因小干扰RNA对肺腺癌Calu-3细胞株放疗敏感性的影响

目的 探讨转染靶向C-erbb-2基因小下扰RNA(siRNA)对肺腺癌Calu-3细胞株放疗敏感性的影响.方法 合成四对C-erbb-2基因的siRNA,实时荧光定量PCR检测siRNA的干扰效果,筛选出干扰效果最好的一对,用LipofectamineTM2000转染肺腺癌细胞Calu-3,实验分为6组:空白组、单纯干扰组、2 Gy照射组、干扰加2 Gy照射组、5Gv照射组和干扰加5 Gv照射组,每组设3个复孔,最后Annexin V-FITC Kit检测各组细胞的凋亡.结果 从合成的shRNA中筛选出一对siRNA.其干扰效果较其他3种有统计学差异;用其干扰Calu-3细胞后,分别用2 Gy和5 Gy的剂量照射细胞,得到的凋亡率如下:李白组7.767±0.551、干扰组14.400±1.114、2 Gy剂量组11.867±0.737、2 Gy+干扰组23.000±1.664、5 Gy剂量组16.100±0.624、5 Gy+干扰组27.900±1.709.结论 靶向转染C-erbB-2基因siRNA至Calu-3细胞可提高其凋亡率;靶向转染C-erbB-2基因siRNA至Calu-3细胞可提高其对γ射线的敏感性.     

吉西他滨联合长春瑞滨治疗铂类耐药中晚期非小细胞肺癌23例

目的:评价吉西他滨(GEM)与长春瑞滨(NVB)联合(GN方案)治疗对铂类方案耐药的中晚期非小细胞肺癌(non-smallcell lung cancer,NSCLC)的疗效及毒副反应。方法:23例既往接受铂类治疗2周期以上无效的中晚期NSCLC患者,改为GN方案治疗。具体为吉西他滨1000mg/m2静脉滴注d₁、d₈;长春瑞滨25mg/m2静脉滴注d₁、d₈。结果:23例对铂类耐药的中晚期NSCLC患者经本方案治疗后,总有效率39.1%,中位生存期9.8个月,疾病进展时间为5.7个月,1年生存率45.8%,主要不良反应是血液学毒性,表现为Ⅰ~Ⅱ度白细胞减少78.3%,Ⅲ~Ⅳ度白细胞减少13.0%,Ⅰ~Ⅱ度血小板减少和红细胞减少分别为43.5%和30.4%;非血液学毒性包括Ⅰ~Ⅱ度的恶心、呕吐、局部静脉炎等。结论:GN方案对铂类方案耐药的中晚期NSCLC疗效较好,毒副反应可以耐受,值得在临床上推广和应用。     

RAIL泰素帝协同诱导人肺腺癌细胞凋亡的研究

目的：探讨肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand,TRAIL）和化疗药物泰素帝（TXT）联合应用对体外培养人肺腺癌A549细胞的凋亡诱导作用,并初步探讨其作用机制。方法：通过形态学观察和MTT比色法检测TRAIL、TXT及二者联合应用对A549细胞的形态学影响和细胞增殖的抑制作用； Annexin Ⅴ FITC/PI染色，流式细胞术检测A549细胞的凋亡率；半定量RT PCR检测TXT对A549细胞死亡受体DR4、DR5基因表达的影响。结果：①TXT对A549细胞的生长有明显的抑制作用，且呈显著的剂量依赖性，IC50为62.1?ng/ml；而A549对TRAIL不敏感，100?ng/ml的抑制率仅为（6.84±1.14）%，1600?ng/ml的抑制率为（26.10±4.02）%。4?ng/ml TXT与100?ng/ml TRAIL联合应用有显著的协同抑制作用（P＜0.05），抑制率为（19.98±4.15）%；②100?ng/ml TRAIL、4?ng/ml TXT单独作用A549细胞24?h的凋亡率为4.44%和12.26%。100?ng/ml TRAIL与4?ng/ml TXT联合作用A549细胞24?h的凋亡率为16.84%；③4?ng/ml TXT作用前后，死亡受体DR4、DR5mRNA表达水平无明显改变。结论：人肺腺癌细胞A549对TRAIL不敏感，但TRAIL与TXT联合有显著的协同诱导细胞凋亡作用，这种协同作用机制与DR4、DR5的表达无关。     

RNA干扰HO-1表达对肺腺癌A549细胞生物学行为的影响研究

目的应用RNA干扰技术特异性抑制血红蛋白加氧酶-1（HO-1）的表达,观察HO-1对肺腺癌A549细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响。方法将体外构建的HO-1小分子RNA（siRNA）转染入肺腺癌A549细胞,分为空白对照组（blank组）、脂质体组（mock组）、阴性对照组（NC组）、HO-1siRNA组;应用实时荧光定量PCR、蛋白质印迹法检测HO-1mRNA和蛋白表达水平;分别以CCK-8法、流式细胞术检测细胞增殖能力和凋亡率,用Transwell试验检测细胞迁移能力。结果细胞培养48、72h后,与blank组、mock组、NC组比较,HO-1siRNA组细胞存活率均降低（均P＜0.05）,细胞凋亡率均增高（均P＜0.05）,G0期/G1期细胞比例均增高（均P＜0.05）,Transwell试验中穿膜细胞数均减少（均P＜0.05）。结论RNA干扰HO-1基因表达后能有效调控肺腺癌A549细胞的恶性生物学行为,抑制肺腺癌A549细胞的增殖,促进凋亡,降低细胞的侵袭能力。     

针对增强型绿色荧光蛋白RNA干扰表达载体的构建和鉴定

目的：构建针对增强型(EGFP)的pSUPER siRNA(small interferencing RNA)表达载体,并在哺乳动物细胞COS-7细胞中观察其干扰效果．方法：设计针对EGFP编码区的寡核苷酸链,体外退火后克隆入经Bgl Ⅱ和HindⅢ双酶切线性化的干扰载体pSUPER中,对重组质粒进行酶切分析和DNA序列测定．通过脂质体介导,将重组干扰质粒与pIRESE2-EG-FP瞬时共转染COS-7细胞,48h后荧光显微镜下观察干扰效果．结果：经酶切鉴定及DNA序列测定证实,重组质粒中已插入了目的基因片段．瞬时共转染后荧光显微镜观察结果显示：只转染pIRES2-EGFP及共转染pIRES2-EGFP和空载体pSUPER的COS-7细胞中有大量的EGFP表达．而共转染pIRES2-EGFP和pSUPER-R237、pSUPER—R304、pSUPER-R447的COS-7细胞中发出荧光的细胞数量明显减少,荧光强度也明显降低．结论：成功构建了针对EGFP的RNA干扰表达载体pSUPER—R237,pSUPER—R304和pSUPER—R447,并与pIR—ESE2一EGFP瞬时共转染COS-7细胞,有效地抑制了EGFP在哺乳动物细胞中的表达。     

培美曲塞或吉西他滨联合顺铂治疗晚期肺腺癌的疗效比较

目的研究培美曲塞联合顺铂对比吉西他滨联合顺铂治疗晚期肺腺癌的疗效及不良反应。方法选择2010-2011年永州市中心医院肿瘤科收治的Ⅲb/Ⅳ期肺腺癌患者80例,随机均分为观察组和对照组。观察组：培养曲塞500 mg·m-2静滴（d1）,顺铂25 mg·m-2静滴（d1-3）;对照组：吉西他滨1000 mg·m-2静滴（d1,d8）,顺铂25 mg·m-2静滴（d1-3）。每21天为1周期重复,每2周期后复查以评价疗效和不良反应,直至疾病进展。结果 80例患者均可评价疗效和不良反应,观察组总有效率为17.5%,疾病控制率为47.5%,中位无进展生存时间为6.1个月,中位总生存时间为13.7个月;对照组总有效率为12.5%,疾病控制率为45.0%,中位无进展生存时间为5.9个月,中位生存期为13.2个月。2组比较差异均无统计学意义（均P〉0.05）。观察组粒细胞减少、血小板减少、胃肠道反应、皮疹等不良反应显著低于对照组（均P〈0.05）。结论培美曲塞与吉西他滨联合顺铂治疗晚期肺腺癌的疗效相近,但培美曲塞联合顺铂组较吉西他滨联合顺铂组不良反应明显减少,耐受性较好,可作为晚期肺腺癌安全有效的药物进行临床一线治疗。     

RNA干扰对胆囊癌细胞上皮细胞黏附因子表达的影响

目的:观察RNA干扰(RNAi)对胆囊癌GBC-SD细胞株中上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,EP-CAM)表达的抑制作用。方法:针对EP-CAM基因的不同位点构建4个miRNA重组质粒。经DNA测序后,用LipofectamineTM2000介导转染人胆囊癌GBC-SD细胞株,48 h后用RT-PCR和Western blot检测EP-CAM的mRNA和蛋白的表达变化情况。结果:经测序分析证实,靶向EP-CAM的4个miRNA重组质粒均构建成功。RT-PCR及Western Blot技术显示,4个重组质粒均不同程度地抑制靶基因EP-CAM的表达。结论:针对人EP-CAM基因的miRNA表达载体能有效地下调GBC-SD细胞中EP-CAMmRNA及蛋白的表达。     

RNA干扰技术抑制EC-109细胞survivin基因表达及其促凋亡研究

目的:应用RNA干扰技术(RNAi)研究针对survivin基因的siRNA,抑制survivin基因的表达并诱导食管癌细胞系EC-109细胞的凋亡. 方法:构建针对survivin的siRNA表达质粒,转染至EC-109细胞,荧光显微镜判断转染效率,蛋白质印迹和半定量RT-PCR检测survivin蛋白表达及基因转录水平的变化,并在不同时间点收集转染细胞,利用流式细胞术及基因组DNA凋亡检测试剂盒,观察siRNA抑制survivin基因表达后诱导细胞凋亡的情况. 结果:荧光显微镜结果表明,重组质粒转染效率达46.70%. 半定量RT-PCR检测到pSIREN/S质粒在EC-109细胞内对survivin基因的转录抑制率为74.04%;蛋白质印迹结果表明,转染重组质粒pSIREN/S的EC-109细胞survivin蛋白表达量仅为正常组的41.64%,而对照质粒pSIREN/CN对survivin基因的蛋白表达及转录均没有抑制作用. 经pSIREN/S转染的EC-109细胞基因组DNA出现明显的DNA ladder,流式细胞仪分析结果也显示凋亡细胞为60.78%. 结论:survivin特异性siRNA可明显抑制survivin基因的转录和表达,并能有效地诱导EC-109细胞的凋亡,为下一步在体内利用pSIREN/S重组质粒沉寂survivin基因,促肿瘤细胞的凋亡提供实验基础.