DPC4基因转染对结肠癌细胞生长的抑制作用及其作用机制

目的 研究DPCA基因转染对结肠癌细胞生长及p21^WAFI mRNA表达的影响。方法 构建pcDNA3．1-DPCA真核表达质粒．利用脂质体转染技术将pcDNA3．1质粒和pcDNA3．1-DPCA质粒分别导入结肠癌细胞系SW620;采用免疫细胞化学和Western蛋白印迹检测细胞中DPCA基因的表达;通过检测细胞生长曲线、克隆形成实验研究DPCA基因转染对SW620细胞生长的抑制作用。通过逆转录．聚合酶链反应(RT-PCR)检测各组细胞内p21^WAFI mRNA的表达。结果 转染DPC4基因后,在SW620细胞中可检测到高表达的DPCA蛋白;细胞生长倍增时间(74h)明显延长;细胞克隆形成率(21％)明显降低。DPCA基因转染后SW620细胞p21^WAFI mRNA含量增加。结论 DPC4基因的高表达能够抑制结肠癌细胞的生长,DPCA基因可能通过诱导p21^WAFI基因的表达而抑制结肠癌细胞的生长。     

过表达Oct4B1 诱导结直肠癌SW480 细胞发生上皮间质转化

目的:探讨Oct4B1 基因过表达是否诱导人结直肠癌SW480 细胞发生上皮间质转化(EMT)及其可能的机制。方法:用带G418 抗性的Oct4B1 基因过表达质粒及阴性对照质粒转染人结直肠癌SW480 细胞株,分别称为实验组(SW480-Oct4B1)及对照组(SW480-NC),转染成功后用G418 筛选建立稳定转染的细胞株,对两种稳定转染细胞进行如下检测: RT-qPCR 检测Oct4B1 的mRNA 水平;于划痕实验和Transwell 小室实验检测迁移和侵袭能力;盂Western blot 检测EMT 相关标记物E-cadherin、N-cadherin 及Vimentin 蛋白表达; RT-qPCR 和Western blot 检测EMT 转录因子Twist 的mRNA 及蛋白表达。结果:稳定转染细胞株建立后,实验组与对照组比较:Oct4B1 基因表达水平明显升高(P<0.01);细胞迁移明显增强(P<0.01);细胞侵袭能力明显提高(P<0.01);上皮标记物E-cadherin 蛋白表达量明显下降(P<0.01);而间质标记物N-cadherin 及Vimentin蛋白表达量明显上调(P<0.01);Twist 的mRNA 及蛋白表达量均明显升高(P<0.01)。结论:过表达Oct4B1 基因可诱导人结直肠癌SW480 细胞发生EMT,增强细胞迁移及侵袭能力,其分子机制可能与提高Twist 表达有关。     

小分子干扰RNA 沉默RhoGDI2 基因表达对结肠癌细胞增殖侵袭的影响及其机制

目的:应用小分子干扰RNA(siRNA)沉默RhoGDI2 基因的表达,初步探讨其对结肠癌细胞增殖、迁移能力的影响及可能的机制。方法:分别运用Western blot 和RT-qPCR 检测结肠癌细胞株RKO、HT29、SW620、SW480、HCT116 基因RhoGDI2 的表达情况。设计并合成RhoGDI2 siRNA 干扰序列,按照LipofectamineTM2000 转染方法将siRNA 干扰序列转染到目的细胞,设置实验干扰组、空白对照和阴性对照组;CCK-8 实验检测细胞增殖能力,细胞划痕试验和Transwell 实验检测细胞迁移、侵袭能力。结果:人结肠癌细胞株RhoGDI2 表达量由高到低依次是RKO、HT29、SW620、SW480、HCT116;RKO 细胞siRNA干扰后RhoGDI2 表达抑制率大于70%:实验干扰组、阴性对照组、空白对照组细胞增殖率分别是(0.683±0.013)、(0.866±0.088)、(0.905±0.008),P<0.05;实验干扰组细胞迁移、侵袭速率较对照组均减慢。沉默RhoGDI2 基因的表达,实验组细胞E-Cadherin 较对照组表达量高,Vimentin 蛋白表达下降。结论:结肠癌RhoGDI2 基因沉默可能通过抑制EMT 进程阻止肿瘤恶性生物学行为。     

miR-581 对结直肠癌SW620 细胞增殖能力的影响

目的:探讨miR-581 对结直肠癌SW620 细胞增殖能力的影响。方法:分别用携带miR-581 基因的慢病毒颗粒(LV-miR-581-GFP)和miR-581 mimics(miR-581)转染人结肠癌细胞株SW620 作为实验组;用对照组病毒颗粒(LV-GFP)和对照组mimics (Vector)转染SW620 细胞株作为阴性对照组。用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测各组细胞中miR-581 的mRNA 表达水平;CCK8 和克隆形成实验检测细胞增殖能力和克隆形成能力的变化。结果:实验组SW620 细胞中miR-581 表达较对照组明显增高(P<0.05);CCK8 和克隆形成实验显示过表达实验组细胞的增殖及克隆形成能力较对照组明显增强(P<0.05)。结论:miR-581 对结直肠癌SW620 细胞的增殖具有促进作用。     

miR-126 对结肠癌细胞生物学行为的影响及其在调控结肠癌EMT 转化中的作用

目的:观察miR-126 在不同转移潜能的人结肠癌细胞系中的表达情况及其对结肠癌细胞增殖、侵袭转移能力的影响并探讨可能的作用机制。方法:采用实时荧光定量PCR 检测结肠癌细胞系(SW480、SW620 及HCT116)中miR-126 的表达量。通过脂质体瞬时转染法将miR-126 过表达(miR-126 mimics),并设置阴性对照组,然后采用CCK8 法检测细胞的增殖能力,细胞划痕实验检测细胞的迁移能力,Transwell 侵袭小室实验检测细胞的侵袭能力,Western blot 实验检测E-cadherin 和Vimentin 蛋白表达量的变化。结果:相对于低转移潜能的结肠癌细胞株SW480,miR-126 在高转移潜能的SW620 和HCT116细胞中的表达降低。过表达miR-126 可使SW620 细胞增殖、迁移和侵袭能力降低,E-cadherin 蛋白表达增加,Vimentin 蛋白表达降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:低表达的miR-126 与结肠癌的转移密切相关,miR-126 影响结肠癌细胞生物学行为的作用可能是通过调控EMT 进程实现的。     

高迁移率族蛋白B1促进结肠癌细胞增殖、迁移与侵袭的机制探讨

目的:探讨高迁移率族蛋白B1(HMGB1)在结肠癌细胞中的表达和对结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法:采用qPCR与Western blot法检测人结肠癌SW620细胞与正常结肠上皮细胞FHC中HMGB1的mRNA和蛋白表达。通过Lipofectamine 3000转染质粒构建稳定下调HMGB1表达(shHMGB1)的SW620细胞,同时设置阴性对照(shNC)细胞和空白对照(blank)细胞;采用CCK-8、平板集落形成实验和Transwell实验检测细胞的增殖、迁移及侵袭能力。采用Western blot检测HMGB1表达下调对p-ERK、ERK、c-Myc、基质金属蛋白酶(MMP)-2/9、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、Bcl-2及Bax的蛋白表达水平的影响。结果:SW620细胞中HMGB1在mRNA及蛋白水平表达均高于正常结肠上皮细胞FHC(P0.05)。经qPCR与Western blot验证,HMGB1低表达细胞构建成功。与blank组和shNC组相比,shHMGB1组细胞增殖、迁移和侵袭能力受到显著抑制(P0.01)。Western blot结果表明,同blank组和shNC组比较,shHMGB1组细胞的MMP-2、MMP-9、N-cadherin、c-Myc、Bcl-2及ERK磷酸化蛋白表达显著下调,Bax蛋白表达显著上调(P0.05)。结论:HMGB1可促进结肠癌SW620细胞的增殖、迁移和侵袭能力,ERK/c-Myc信号通路参与了这一过程。     

非编码基因MALAT1功能性序列真核表达载体的构建及其在SW620细胞中的表达

目的构建人肺腺癌转移相关转录本1（MALAT1）功能性序列重组真核荧光表达载体,并在人大肠癌SW620细胞株中表达。方法采用RT-touchdown PCR方法,从人正常大肠黏膜组织中提取总RNA,扩增MALAT1功能性序列,将扩增产物克隆至pTA2载体,测序证实后,克隆至pEGFP-C1质粒中,构建重组真核荧光表达载体;阳离子脂质体介导下转染人大肠癌SW620细胞,荧光显微镜检测细胞中增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的表达。通过Real-time PCR检测质粒转染前后MALAT1/fgf mRNA表达水平的变化。结果经pTA2载体和pEGFP-C1载体克隆、酶切鉴定及序列分析后,证实人MALAT1功能性序列重组真核荧光表达载体构建成功。在荧光显微下观察到带绿色荧光的SW620细胞。pEGFP-C1-MALAT1/fgf转染前后SW620细胞MALAT1/fgf mRNA表达水平倍比关系为2.376±0.573,差异具有统计学意义（P〈0.05）。结论成功构建了人MALAT1功能性序列真核荧光表达载体pEGFP-C1-MALAT1/fgf,转染SW620细胞后可引起MALAT1/fgf mRNA表达上调,为进一步研究MALAT1的结构、功能及其与人大肠癌的关联奠定了基础。     

骨桥蛋白基因真核表达载体构建及对结肠癌细胞的作用

目的：构建骨桥蛋白（Osteopontin,OPN）基因真核表达载体,转染人结肠癌细胞SW480,分析其对SW480细胞株增殖及生存能力的作用。方法：构建重组表达载体pEGFP-N1/OPN,经测序鉴定无误后,转染人结肠癌SW480细胞。RT-PCR检测SW480细胞转染后OPN mRNA表达;Western blot检测SW480细胞转染后OPN蛋白表达量;Cell Counting Kit-8（CCK-8）测定细胞增殖;软琼脂克隆形成实验观察细胞的锚定非依赖性生长能力。结果：pEGFP-N1/OPN转染SW480后,OPN基因获得很好转录,OPN蛋白表达增高,转染OPN后SW480细胞增殖率（光吸收值）显著高于转染阴性组（P〈0.05）,软琼脂克隆形成速度增快,数量明显多于对照组和空载体组（P〈0.05）。结论：OPN基因真核表达载体pEGFP-N1/OPN构建成功,OPN具有促进SW480细胞增殖、存活的作用,为进一步研究OPN作用机制奠定了重要基础。     

miR-95对结肠癌细胞系SW620侵袭和迁移的影响及机制

目的探讨小分子非编码RNA-95(miR-95)表达对结肠癌细胞系SW620侵袭、迁移能力的影响及其机制。方法将miR-95干扰慢病毒转入结肠癌细胞系SW620,用qRT-PCR检测细胞中miR-95表达,用Transwell小室和划痕实验检测细胞侵袭和迁移能力;MTT法检测细胞同种、异种细胞黏附能力;用Western印迹检测3组细胞的EMP1,VEGFC和MMP2蛋白表达。结果 SW620转染miR-95干扰慢病毒72 h后,转染率较高;与空病毒组和对照组比较,转染组miR-95的表达降低(P0.05);侵袭和迁移能力减弱(P0.05);同种黏附能力增强(P0.05);异种黏附能力减弱(P0.05);同时转染组EMP1蛋白表达明显增高,VEGFC、MMP2蛋白表达明显降低(P0.05)。结论 miR-95能够促进SW620细胞侵袭和迁移能力,可能是通过EMP1、VEGFC和MMP2实现的。     

RIP2对大肠杆菌的抗菌作用研究

目的: 探讨受体相互作用蛋白2(RIP2)对人肠细胞清除大肠杆菌的作用。方法: 使用阳离子聚合物JetPei^TM介导人 RIP2 基因(pEGFP-C2-PIP2)转染人结肠癌SW480细胞株,以转染空质粒及未转染的SW480细胞株作为对照,应用RT-PCR检测外源性RIP2mRNA水平的变化、Western blotting法检测细胞RIP2蛋白的表达;并利用大肠杆菌ATCC25922感染转染和未转染的SW480细胞24 h, 用平板培养菌落计数活菌数。应用p38 MAPK通路抑制剂SB203580作用于3组细胞,计数活菌数。结果: 与对照组相比,转染RIP2组其mRNA和蛋白表达水平均有明显升高(P<0.01, P<0.05),表明RIP2表达质粒成功转染SW480细胞。转染RIP2细胞能清除胞内大肠杆菌;而阻断p38 MAPK信号通路后,RIP2清除胞内大肠杆菌的作用被阻断。结论: RIP2转染细胞可有效清除胞内大肠杆菌,这种胞内细菌的清除作用可能与p38 MAPK信号通路有关。这些结果提示RIP2在细菌感染性疾病治疗中具有广阔的临床应用前景。     

KLF4对结直肠癌细胞生长抑制及化疗敏感性的影响

目的:探讨Krüppel样因子4(KLF4)对结直肠癌细胞活力、凋亡及顺铂化疗敏感性的影响。方法:Western blot法检测KLF4在结直肠癌Caco2、SW480和HCT116细胞中的表达。将SW480细胞分为pc DNA3. 1组(转染pc DNA3. 1空质粒)、pc DNA3. 1-KLF4组(转染构建的pc DNA3. 1-KLF4过表达质粒)和pc DNA3. 1-KLF4+顺铂组(转染pc DNA3. 1-KLF4 48 h后用1 mg/L顺铂处理细胞48 h),Western blot检测KLF4、p-IκBα、细胞周期素D1(cyclin D1)和生存素(survivin)的蛋白水平; CCK-8法检测各组细胞活力;流式细胞术检测细胞凋亡率; DCFH-DA探针检测活性氧簇(ROS)含量。结果:KLF4在结直肠癌细胞中的表达均显著低于在人结肠黏膜上皮NCM460细胞的表达(P 0. 05)。与pc DNA3. 1组相比,pc DNA3. 1-KLF4组的KLF4蛋白表达显著增高(P 0. 05),细胞活力及cyclin D1和survivin的蛋白表达均显著降低,细胞凋亡率、ROS含量及p-IκBα的蛋白表达均显著增高;而pc DNA3. 1-KLF4+顺铂组细胞活力及cyclin D1和survivin的蛋白表达均显著低于pc DNA3. 1-KLF4组,细胞凋亡率、ROS含量及p-IκBα的蛋白表达均显著高于pc DNA3. 1-KLF4组(P 0. 05)。结论:上调结直肠癌细胞KLF4基因表达可降低肿瘤细胞活力,诱导细胞凋亡,增强顺铂化疗敏感性,其机制可能与提高细胞内ROS含量及下调NF-κB信号关键分子IκBα的磷酸化水平有关。     

小鼠凋亡相关新基因PNAS-4真核表达载体的构建、表达及体外抗肿瘤作用

目的：对小鼠凋亡相关新基因PNAS-4（mPNAS-4）进行克隆，构建其真核表达载体，并在小鼠Lewis肺癌细胞系LL2中转染表达；探讨mPNAS-4基因转染LL2细胞过表达所诱导的体外肿瘤细胞凋亡情况。方法：用RT-PCR从小鼠肝脏组织中克隆mPNAS-4编码区cDNA，构建重组真核表达载体pcDNA3．1（＋）-mPNAS-4；用脂质体将pcDNA3．1（＋）-mPNAS-4转染小鼠Lewis肺癌LL2细胞；用RT—PCR检测转染细胞中mPNAS-4的过表达情况；通过MTT、流式细胞术（FCM）及DNA Ladder分别检测转染细胞的增殖与凋亡情况。结果：从小鼠肝脏组织中克隆到mPNAS-4全长cDNA并成功构建其真核表达载体pcDNA3．1（＋）-mPNAS-4，转染小鼠Lewis肺癌LL2细胞可使其mRNA表达明显上调。mPNAS-4过表达能抑制LL2细胞增殖并诱导其凋亡。结论：mPNAS-4过表达对小鼠Lewis肺癌LL2细胞的生长有明显的抑制和诱导凋亡作用。     

miR-143-3p 靶向MAPK1对人结肠癌细胞增殖，凋亡和侵袭的调节作用#br#

目的　研究miR-143-3p靶向MAPK1与人结肠癌细胞增殖、凋亡和侵袭的关系。 方法　qRT-PCR检测miR-143-3p mimic转染效果和MAPK1的mRNA表达水平;双荧光素酶报告实验分析miR-143-3p与MAPK1的靶向关系;蛋白质印迹检测MAPK1的蛋白表达水平,CCK-8检测细胞增殖倍数,Hoechst染色检测细胞增殖,体外侵袭实验检测细胞侵袭,蛋白质印迹检测Ki67、VEGF、MMP-2和cleaved caspase-3的表达。 结果　miR-143-3p mimic抑制人结肠癌细胞SW620中MAPK1 mRNA和蛋白的表达水平;miR-143-3p mimic与MAPK1野生型报告载体共转后,荧光素酶的活性显著降低;miR-143-3p mimic转染SW620细胞后,细胞增殖、侵袭能力显著降低,凋亡细胞数目显著增加,Ki67、VEGF和MMP-2的表达水平显著降低,cl-caspase-3的表达水平显著上升;miR-143-3p mimic能缓解MAPK1高表达对SW620细胞增殖、侵袭的诱导作用和对细胞凋亡的抑制作用。 结论　miR-143-3p抑制人结肠癌细胞增殖和侵袭,诱导细胞凋亡,其作用机制与靶向抑制MAPK1有关。     

MicroRNA143调节结肠癌细胞KRAS蛋白的表达

目的：探讨结肠癌细胞中microRNA143（miR-143）对KRAS蛋白表达的影响及其作用机制。方法: 从基因组DNA中克隆pri-miR-143基因，构建miR-143的表达载体。miR-143转染结肠癌细胞系SW480，用Northern blotting方法测定miR-143水平的变化，通过RT-PCR和Western blotting方法检测转染细胞中KRAS基因的表达。构建含miR-143结合位点的荧光素酶报告载体，与miR-143表达载体共转染，检测细胞中的荧光素酶活性。结果: 基因转染的SW480细胞中miR-143的表达显著升高， KRAS蛋白的表达水平下降约40%，KRAS mRNA则未受影响。miR-143表达载体与含miR-143结合位点的报告载体共转染可以抑制细胞中的荧光素酶活性。结论: 结肠癌细胞中microRNA143在转录后水平抑制KRAS蛋白的表达。     

RNAi双沉默Survivin和hTERT基因抑制人结肠癌SW480细胞增殖促进凋亡

目的探讨双向沉默Survivin和h TERT基因对结肠癌SW480细胞增殖和凋亡的影响,为结肠癌的基因治疗提供实验依据。方法设计并构建能够稳定转录shRNA并可分别及联合干扰Survivin和h TERT分子表达的质粒,将其转染结肠癌SW480细胞后,分阴性对照组、空白质粒对照组、Survivin RNAi组、h TERT RNAi组和Survivinh TERT RNAi组。转染48h后TRAP-PCR-ELISA法检测端粒酶活性,RT-PCR法检测Survivin和h TERT mRNA的表达,Western blot检测Survivin和h TERT蛋白的表达,流式细胞仪及cck-8法分别检测细胞凋亡和细胞增殖的变化。结果 Survivin-h TERT RNAi组SW480细胞端粒酶活性明显下降(P0.01),Survivin-h TERT RNAi组Survivin及h TERT的mRNA水平较正常对照组分别减低82.8%和73.6%(P0.01),蛋白表达抑制率分别为79.2%和66.7%(P0.01)。实验各组中Survivin-h TERT RNAi组细胞增殖抑制率和凋亡率最高,分别为43.6%±0.1%和39.2%±2.3%(P0.01)。结论 Survivin和h TERT双干扰质粒可明显下调Survivin和h TERT蛋白的表达,抑制结肠癌SW480细胞的增殖,促进其凋亡。     

MicroRNA-98通过下调EZH2表达抑制结直肠癌细胞的活力与侵袭能力

目的:探讨微小RNA-98(mi R-98)与Zeste基因增强子同源物2(EZH2)之间的靶向关系,及其对结直肠癌细胞活力和侵袭能力的影响。方法:Target Scan软件预测EZH2和mi R-98之间的靶向结合,双萤光素酶报告基因实验验证mi R-98与EZH2之间的靶向关系。用mi R-98 mimic和mi R-98 inhibitor分别转染人结直肠癌SW480细胞和SW620细胞,Western blot检测EZH2的蛋白表达; MMT法检测细胞活力; Transwell法检测细胞的侵袭能力。转染EZH2过表达质粒检测其对细胞活力和侵袭的影响。结果:mi R-98能够靶向调节EZH2并负向调节SW480细胞和SW620细胞中EZH2的蛋白表达。在SW480细胞和SW620细胞中,过表达mi R-98显著下调细胞活力和侵袭能力,而抑制mi R-98表达显著促进细胞生长和侵袭。过表达EZH2也可促进SW480细胞和SW620细胞的生长和侵袭。结论:mi R-98通过下调EZH2表达抑制SW480细胞和SW620细胞的活力和侵袭。本研究为结直肠癌的治疗提供了新的靶点和方向。     

Tiam1对结直肠癌细胞生物学特性的影响

目的探讨Tiam1(Tlymphomainvasionandmetastasis)对结直肠癌细胞株生物学特性的影响。方法用逆转录聚合酶链反应方法检测Tiam1基因在结直肠癌细胞株中的表达,筛选Tiam1不表达的细胞株;将Tiam1/C1199HAcDNA导入内源性不表达Tiam1基因的人结直肠癌HT29细胞株中,G418筛选抗性克隆,免疫组织化学和Western蛋白印迹法鉴定转染后Tiam1基因在细胞中的表达,利用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测Tiam1对细胞增殖的影响,体外侵袭实验检测Tiam1对结直肠癌侵袭转移的影响。结果Tiam1基因在高转移的LoVo和SW620中高表达,在低转移的HT29中不表达,在SW480和HCT116细胞表达相应较低。通过7d的连续比较,HT29/mock和HT29/Tiam1两组的细胞增殖能力差异有统计学意义(F=10.512,P=0.003)。Tiam1基因的导入使结直肠癌细胞的增殖能力明显增强,体外侵袭转移能力显著增加,HT29/Tiam1穿过细胞为(88.6±9.2)个/200倍视野,HT29/mock为(46.8±3.4)个/200倍视野,二者的差异具有统计学意义(t=9.54,P<0.01)。结论Tiam1基因具有促进结直肠癌细胞增殖的能力,Tiam1与结直肠癌的侵袭转移密切相关,Tiam1表达可作为结直肠癌侵袭转移过程中一个有价值的指标。