甲型流感病毒NP基因真核载体的构建及初步表达

目的构建甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)NP基因的真核表达载体,转染HEK293细胞,检测其表达情况。方法采用RT-PCR技术克隆甲型流感病毒株NP基因,将克隆的片段插入真核表达载体pcDNA3.1(+)。经酶切、PCR和测序鉴定后,构建好的pcDNA3.1(+)/NP用脂质体转染法转染HEK293细胞,通过免疫荧光技术检测其目的蛋白的瞬时表达。结果RT-PCR扩增到NP基因,插入真核表达载体pcDNA3.1(+),转染HEK293后经免疫荧光技术检测到目的蛋白的表达。结论本实验构建的甲型流感病毒NP部分基因序列的真核表达载体,为深入研究流感病毒核衣壳蛋白和有效的核酸疫苗奠定了基础。     

乙型脑炎病毒NS5蛋白原核表达与亚细胞定位研究

目的对乙型脑炎病毒NS5蛋白进行原核表达和亚细胞定位研究。方法通过PCR扩增乙型脑炎病毒NS5基因,并将之克隆至原核表达载体pET-28a（＋）中,构建的重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞,经IPTG诱导表达目的蛋白。将表达产物纯化后,免疫BALB/c小鼠,制备NS5蛋白特异性的多克隆抗体。同时,构建NS5基因与绿色荧光蛋白（EG-FP）融合表达的真核表达质粒pcDNA-NS5-EGFP,将之转染BHK-21细胞,利用激光共聚焦荧光显微镜观察NS5蛋白在BHK-21细胞中的亚细胞定位。结果 NS5蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达,表达蛋白分子量大小约为103kD,该蛋白在真核细胞中的表达呈颗粒状不均匀分布于整个细胞,且颗粒状主要分布在细胞质中。结论成功表达乙型脑炎病毒NS5蛋白,并对NS5蛋白的亚细胞定位进行了分析,为进一步研究NS5蛋白提供依据。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活基因11的克隆化研究

目的 为了探索丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)病毒蛋白反式激活作用的新的靶基因，我们应用基因芯片技术对于转染和末转染的肝母细胞瘤细胞系H叩G2进行分析。研究结果将有助于阐明HCV感染相关疾病的发病机制。方法 根据HCV—H病毒株序列设计、合成序列特异性的引物。以含有全长HCV—H株cDNA的pBRTN-3011质粒DNA作为模板，进行多聚酶链反应(PCR)扩增，获得的HCVNS5A编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定，构建真核表达载体pcDNA3．1(-)-NS5A。以pcDNA3．1(-)-NS5A转染肝母细胞瘤细胞系HepG2，提取总RNA，逆转录为cDNA后进行表达谱基因芯片分析。应用分子生物学技术，结合生物信息学技术（bioinformatics)，克隆HCVNS5A反式激活作用的新的靶基因。结果 构建了真核表达载体pcDNA3．1(-)-NS5A，经过限制性内切酶作图分析和核苷酸序列分析证实正确无误。以PCDNA3．1(-)-NS5A转染HepG2后提取总RNA，逆转录后进行表达谱基因芯片技术分析。应用分子克隆技术结合生物信息学技术克隆NS5A反式激活的新型靶基因，命名为NS5AWll，新基因的编码基因序列全长为1257个核苷酸(nt)，编码产物由418个氨基酸残基(aa)。结论 HCVNS5A是一种典型的病毒基因组编码的具有反式激活作用的蛋白。基因芯片技术是分析基因表达谱变化的有效和高通量技术。发现了HCVNS5A反式激活作用的新的靶基因，这一发现，为阐明HCVNS5A蛋白的反式激活作用及其机制，开辟了新的研究方向。     

结核分支杆菌ESAT-6真核表达质粒的构建及蛋白表达的鉴定

目的 用6kDa早期分泌性抗原靶蛋白(ESAT-6)基因构建真核表达重组质粒pcDNA3．1( )-ESAT-6，并鉴定其在真核细胞(COS-7)中的蛋白表达。方法 以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板，用PCR对ESAT-6基因进行扩增，将扩增的产物连接于测序载体pUCm—T上，经测序反应确定无误后，再将PCR反应产物克隆于真核表达载体pcDNA3．1( )上。并用脂质体介导真核表达重组质粒pcDNA3．1( )-ESAT-6转染真核细胞COS-7，72h后，通过SDS—PAGE和免疫印迹鉴定ESAT-6基因表达的蛋白。结果 用结核杆菌基因ESAT-6构建重组真核表达质粒pcDNA3．1( )-ESAT-成功，通过SDS—PAGE证明重组质粒转化的细胞内有一分子量6kDa的特异蛋白，免疫印迹证明该6kDa蛋白能与抗ESAT-6单克隆抗体反应。结论 结核杆菌早期分泌性蛋白ESAT-6真核表达重组质粒成功构建，该质粒转染的细胞能够产生、分泌结核杆菌早期分泌性蛋白ESAT-6。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活蛋白5反式调节基因的筛选

目的:应用基因表达谱芯片技术研究丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活蛋白5的反式调节基因. 方法:以分子生物学技术构建NS5ATP5的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5ATP5,以表达质粒pcDNA3.1(-)- NS5ATP5转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA.应用基因表达谱芯片技术对差异表达mRNA进行检测和分析. 结果:HepG2细胞经转染NS5ATP5后,有17条基因表达增强,12条基因表达降低. 结论:成功筛选了NS5ATP5的反式调节基因,为进一步阐明NS5ATP5的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据.     

基因表达谱芯片技术筛选NS5ATP2(615)蛋白反式调节基因

目的:对新基因NS5ATP2(615)转染肝癌细胞的基因表达谱进行分析,探索该基因表达对肝细胞基因表达的调节机制及其生物学功能.方法:应用生物信息学(bioinformatics)技术,分析我们研究组通过抑制消减杂交(SSH)技术筛选得到的新基因NS5ATP2(615)的全长编码序列,构建NS5ATP2的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5ATP2(615).应用基因表达谱芯片技术对重组表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5ATP2(615)和pcDNA3.1(-)空载体分别转染的HepG2细胞的mRNA的差异性表达进行检测.结果:确定基因NS5ATP2(615)由615nt组成,编码204aa的蛋白.基因表达谱芯片所检测的1 152条目的基因均为GenBank中登录的基因,NS5ATP2(615)表达质粒转染的细胞有40条差异表达基因,其中18条基因表达增强,22条基因表达降低.这些差异表达的基因与细胞信号转导、凋亡、肿瘤的发生密切相关.结论:基因表达谱芯片技术对于初步探索新基因的功能提供重要的资料.本实验结果为进一步阐明NS5ATP2(615)生物学功能及HCV NS5A的致病机制提供了理论依据.     

核心蛋白聚糖真核表达载体的构建及其在A549中的表达

目的 建立人核心蛋白聚糖(decorin,DCN) 真核表达载体,并在A549细胞中进行表达,为进一步研究其抗肿瘤作用奠定基础.方法 用PCR法扩增出DCN分子编码序列的cDNA全长,与pcDNA3.1(+)载体连接,构建真核表达载体pcDNA3.1-decorin,并转化到大肠杆菌JM109中扩增以获得重组载体,应用双酶切、PCR以及测序鉴定此重组载体;脂质体介导重组载体转染A549细胞,经G418筛选建立稳定转染细胞株,分别采用RT-PCR、免疫组化法和Western印迹法检测其表达.结果 获得了约1 080 bp大小的特异性DNA片段;PCR产物与真核表达载体进行连接,经过双酶切、PCR以及测序鉴定证实分泌型DCN cDNA片段正确插入真核表达载体pcDNA3.1中.RT-PCR方法可见转染组mRNA表达明显增多,免疫组化和Western印迹方法可见转染组细胞DCN蛋白表达明显增高.结论 成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-decorin,建立了稳定转染DCN的A549细胞株.     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A上调硫氧还蛋白还原酶1基因表达的研究

目的探讨丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A对硫氧还蛋白还原酶1(TXNRD1)启动子转录的激活作用.方法以我室构建的丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式调节基因的cDNA文库抑制性消减杂交(SSH)筛选结果及基因表达谱芯片结果为基础,利用生物信息学技术确定TXNRD1的启动子区域(TXNRD1p),聚合酶链反应(PCR)扩增TXNRD1p,克隆至真核报告载体pCAT3-Basic中,构建pCAT3-TXNRD1p报告载体;以该质粒转染肝癌细胞系HepG2,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性;并与pcDNA3.1(-)-NS5A共转染HepG2细胞系,用ELISA法检测CAT的表达活性.结果pCAT3-TXNRD1p和pcDNA3.1(-)-NS5A瞬时转染的HepG2细胞的CAT表达活性是pCAT3-Basic空载体的9.6倍,pCAT3-TXNRD1p的2.1倍.本实验进一步验证了我室利用SSH技术及基因表达谱技术发现的HCV NS5A蛋白反式激活TXNRD1基因转录作用的结果.结论我室克隆的TXNRD1启动子有顺式激活下游基因的活性;HCV的NS5A蛋白具有对TXNRD1基因启动子的反式激活作用.     

Krüppel-like factor4慢病毒表达载体构建及其对胃癌细胞BGC-823生物学行为的影响

目的 构建Krüppel-like factor4(KLF4)过表达慢病毒载体,探讨其对胃癌细胞株BGC-823生物学行为的影响.方法 检测BGC -823中KLF4 mRNA的表达水平;用真核表达质粒pcDNA3.1IE-KLF4-EGFP,将KLF4基因连人慢病毒载体pLv-UbC-IRES2-EGFP中,构建pLv-KLF4-IRES2-EGFP重组慢病毒表达载体.将酶切和测序鉴定后的重组质粒转染至BGC-823中,观察转染情况,RT-PCR检测KLF4 mRNA.慢病毒包装后转染BGC-823细胞,Western印迹检测KLF4蛋白.结果 重组质粒经酶切和DNA测序证实目的基因插入正确;pcDNA3.1IE-KLF4-EGFP转染BGC-823细胞后KLF4 mRNA升高.慢病毒包装后转染BGC-823检测到目的蛋白KLF4.KLF4能够将细胞阻滞于G1/S,抑制其生长、促进细胞凋亡,减少细胞侵袭能力.结论 转染BGC-823后KLF4蛋白检测证实慢病毒载体成功构建,KLF4能抑制胃癌细胞的恶性转化.     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活基因6的克隆化研究

目的 丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3(NS3)是一种具有显著反式激活作用的病毒蛋白质。为了探索HCVNS3病毒蛋白反式激活作用的新的靶基因，我们应用微矩阵(microarray)技术对于转染和末转染的肝母细胞瘤细胞系HepG2进行分析。研究结果将有助于阐明HCV感染相关疾病的发病机制。方法 根据HCV-H病毒株序列设计、合成序列特异性的引物。以含有全长HCV—H株cDNA的PBRTM-3011质粒DNA作为模板，进行多聚酶链反应(PCR)扩增，获得的HCVNS3编码基因片段克隆到TA载体中进行核昔酸序列的测定，构建真核表达载体PcDNA3．1(-)-NS3。以pcDNA3．1(-)-NS3转染肝母细胞瘤细胞系HepG2，提取总RNA，逆转录为cDNA后进行表达谱基因芯片分析。应用分子生物学技术，结合生物信息学技术(bioinformatics)，克隆HCVNS3反式激活作用的新的靶基因。结果 构建了真核表达载体PcDNA3．1(-)-NS3，经过限制性内切酶作图分析和核苷酸序列分析证实正确无误。以PcDNA3．1(-)-NS3转染HepG2后提取总RNA，逆转录后进行表达谱基因芯片技术分析。应用分子克隆技术结合生物信息学技术克隆NS3反式激活的新型靶基因，命名为NS3TP6，新基因的编码基因序列全长为414个核苷酸(nt)，编码产物由138个氨基酸残基(aa)组成。结论 HCVNS3是一种典型的病毒基因组编码的具有反式激活作用的蛋白。微矩阵技术是分析基因表达谱变化的有效和高通量技术。发现了HCVNS3反式激活作用的新的靶基因，并成功克隆其中的NS3TP6，为阐明HcvNs3蛋白的反式激活作用及其机制，开辟了新的研究方向。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因4剪切体Ns5atp4a基因原核表达载体的构建和表达

目的构建丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因4剪切体（NS5ATP4A）的原核表达载体并进行表达。方法用PCR扩增NS5ATP4A基因,克隆入pET32a（＋）质粒,构建pET32a（＋）-NS5ATP4A表达重组体,转化DH5α和BL21菌,经IPTG诱导。SDS-PAGE分析,Western Blot验证蛋白带。结果成功构建大肠杆菌原核表达载体。经IPTG诱导,得到了目的蛋白分子量为35kD,用Western Blot证实其具有良好的抗原性。结论构建原核表达载体pET32a（＋）-NS5ATP4A,为抗原的制备及临床检测奠定了基础。     

不同型别登革病毒融合外膜基因重组腺病毒的构建及表达

目的构建登革病毒1型和2型外膜蛋白(E蛋白)DⅢ区融合基因的重组腺病毒,在BHK-21细胞中表达。方法用PCR法扩增登革病毒1型和2型EDⅢ基因,依次克隆入pCDNA3.1(+),构建重组质粒pCDNA-D1/D2EDⅢ。以此为模板,扩增包含CMV启动子-D1/D2EDⅢ-BGHpA的表达片段,与pENTR4载体连接形成质粒pENTR4-D1/D2EDⅢ,与pAd/PL-DEST进行体外同源重组,形成重组腺病毒载体pAd-D1/D2EDⅢ,在293A细胞系中包装成具有感染性的重组腺病毒,进一步感染BHK-21细胞,用间接免疫荧光法和Westernblot法检测重组蛋白在细胞中的表达情况。结果重组腺病毒构建成功,转染293A细胞后获得2×109pfu/mL滴度的重组腺病毒,感染哺乳动物细胞后能够表达1型和2型EDⅢ区目的蛋白。结论不同型别融合基因的重组腺病毒表达载体能有效地表达相应型别的目的蛋白,为进一步构建单一的四价重组腺病毒应用于登革疫苗研究奠定基础。     

西尼罗河病毒NS1的克隆、表达及抗原性分析

目的克隆和表达西尼罗河病毒（WNV）非结构蛋白1（NS1）,并分析其与登革病毒NS1的抗原交叉反应性。方法合成WNV NS1全基因序列,将NS1全基因克隆到pGEX-5X-3原核表达载体中表达GST—NS1融合蛋白,用4型登革病毒免疫血清及登革病毒NS1单克隆抗体并应用Western Blot方法分析WNV—NS1重组蛋白的抗原性。结果重组质粒pGEX-5X-3-WNV—NS1经IPTG诱导,高效表达GST-NS1融合蛋白,经变性纯化和复性获得可溶性WNV-NS1重组蛋白,经WesternBlot证实WNV—NS1重组蛋白可与各型登革病毒免疫小鼠血清及部分4型登革病毒NS1交叉单抗识别。结论成功获得可溶性WNV—NS1重组蛋白,该蛋白与登革病毒NS1具有抗原交叉反应性,其结果为建立西尼罗河病毒的血清学诊断和鉴别诊断奠定了基础。     

肺炎嗜衣原体MOMP和人IL-2融合基因DNA疫苗的免疫原性研究

目的构建肺炎嗜衣原体(Chlamydophila pneumoniae,Cpn)主要外膜蛋白(MOMP)单基因及momp和人IL-2融合基因的真核表达载体并比较其免疫反应性,为研制Cpn核酸疫苗提供理论和实验依据。方法扩增Cpn momp及人IL-2基因并将二者融合,将momp和momp-IL-2分别克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体;制备纳米粒DNA疫苗免疫BALB/c小鼠,免疫荧光组化法检测重组质粒在小鼠组织内的稳定表达;ELISA法检测小鼠血清中的特异性抗体和小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ水平;MTT法测定脾淋巴细胞特异性增殖反应。结果成功制备了pcDNA3.1(+)-momp和pcD-NA3.1(+)-momp-IL-2的纳米核酸疫苗;Cpn momp单基因和momp-IL-2融合基因核酸疫苗均能刺激小鼠产生特异性抗体,且pcDNA3.1(+)-momp-IL-2能诱导小鼠产生更高效价的特异性抗体(P<0.05);pcDNA3.1(+)-momp-IL-2诱导小鼠脾细胞产生IFN-γ的量及对特异抗原的刺激指数明显高于pcDNA3.1(+)-momp。结论Cpn momp单基因核酸疫苗和momp-IL-2融合基因核酸疫苗均能刺激小鼠产生较强的体液免疫和细胞免疫应答;pcDNA3.1(+)-momp-IL-2的免疫效果强于pcDNA3.1(+)-momp。     

登革病毒(NGC株)C与prM全长基因的扩增与克隆

目的　从登革病毒 (NGC株 )中快速分离基因组RNA ,RT -PCR扩增及克隆C和 prM全长基因 ,从而为研究蚊虫细胞对登革病毒的细胞内免疫研究奠定基础。方法　以Trizol试剂从C6 / 36细胞培养上清中提取基因组RNA ,RT -PCR扩增全长C和 prM基因 ,T -A重组入pGEM -T载体 ,重组质粒的双酶切、PCR与测序鉴定。 结果与结论　应用Trizol试剂从蚊细胞培养液上清中快速分离到高纯度和完整登革病毒RNA基因组 ,成功扩增与克隆出全长登革病毒C和 prM基因     

Analysis of antibody response in human dengue patients from the Mexican coast using recombinant antigens

This study was undertaken to evaluate the feasibility of using recombinant dengue proteins to discriminate between acute dengue infections versus uninfected dengue samples. Dengue virus proteins E, NS1, NS3, and NS4B were cloned as fusion proteins and expressed in Escherichia coli. Recombinant products were tested in 100 serum samples obtained from acute dengue fever cases collected from 3 states of Mexico where dengue is endemic. Sera from 75 healthy individuals living in nonendemic areas for dengue were used as a control group. In sera from the dengue patients group, antibody responses to E protein were demonstrated in 91% of cases and NS1 protein was recognized to various extents (99%) within the first 7 days of infection. The antibody responses to NS3 and NS4B were frequently of low magnitude. Consistent negative antibody responses to all proteins were found in sera from the control group. These data suggest that the glutathione-S-transferase (GST)-dengue fusion proteins may be feasible antigens for a sensitive and specific serological assay.     

细粒棘球绦虫H3蛋白的克隆表达及囊型包虫病检测效果评价

目的克隆、表达细粒棘球绦虫基底膜特异性硫酸乙酰肝素聚糖核心蛋白（H3）,并评价其检测囊型包虫病的 效果。方法将从细粒棘球绦虫原头节cDNA文库中免疫筛选的H3基因,克隆入pGEX?4T表达载体,将重组质粒转化 大肠杆菌BL21细胞,用异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）进行诱导表达,用亲和层析法纯化重组蛋白,用ELISA方法检测囊型 包虫病患者血清、其他寄生虫病患者血清及健康人血清,评价其检测效能,并与本课题组制备的细粒棘球蚴包囊液粗抗 原（Hydatid cyst fluid,HCF）和重组AgB8/2进行比较。结果成功构建细粒棘球蚴pGEX?4T?H3重组质粒,并在原核细胞 中成功表达。重组H3抗原、纯化HCF和rAgB8/2检测囊型包虫病患者血清的敏感度分别为84.0%（68/81）、90.1%（73/ 81）、77.8%（63/81）,3者差异无统计学意义（ χ2 = 4.58,P > 0.05）。重组H3抗原与泡型包虫病患者、囊虫病患者及血吸虫 病患者血清分别存在63.3%（19/30）、16.7%（5/30）和5.0%（1/20）的交叉反应,与50份健康者血清无交叉反应;H3检测总 特异度为80.8%（105/130）,H3、纯化HCF［71.5%（93/130）］和rAgB8/2［82.3%（107/130）］特异度间差异无统计学意义 （χ2 = 5.71,P > 0.05）。结论重组H3抗原在囊型包虫病诊断上具有潜在的应用价值。     

分泌性内皮抑制素真核质粒治疗小鼠肝癌的初步研究

目的 构建并表达分泌性内皮抑制素真核表达质粒,以此对肝癌进行基因治疗。方法 人工合成Ig κ信号肽序列,和内皮抑制素编码序列一起克隆入pcDNA3.1质粒。重组质粒转染上清液作用于ECV304内皮细胞,MTT法检测内皮细胞的增殖。局部注射重组质粒治疗接种在小鼠腿部肌肉内的H_(22)肝癌瘤株,疗程结束后解剖称取瘤重。结果 构建的内皮抑制素真核表达质粒转染上清液可以抑制内皮细胞的增殖抑制率为29.2％。经质粒裸DNA注射治疗后,治疗组瘤重[(1.34±0.96)g]比空载体组[(2.70±0.82)g]和生理盐水组[(3.73±1.41)g]明显减小(P<0.05)。结论 分泌性内皮抑制素真核表达质粒用于H_(22)肝癌的基因治疗有一定效果。     

HCV非结构蛋白5A对HIV长末端重复序列影响的初步探讨

目的本研究拟探讨HCV非结构蛋白5A(NS5A)对HIV长末端重复序列(long terminal repeat,LTR)影响,从而为HCV对HIV的影响提供实验依据。方法将构建的LTR启动子驱动的荧光素酶(Luc)报告基因表达质粒(pGL3-LTR-Luc)和含HCV NS5A基因的表达质粒pCNS5A共转染肝癌细胞株(Huh7细胞),采用免疫细胞化学技术、Western Blot及逆转录聚合酶链反应检测HCV NS5A蛋白及mRNA的表达;本实验分三组,将质粒pGL3-LTR-Luc(空白组)、质粒pRc/CMV+pGL3-LTR-Luc(对照组)、质粒pCNS5A+pGL3-LTR-Luc(实验组)分别转染Huh7细胞,48 h后收集细胞,采用Luc活性检测LTR的活性,以观察HCV NS5A对LTR的调控影响。所得荧光活性值以均数±标准差表示,采用Levene's方差齐性检验,多组间比较采用单因素方差分析,两两比较行LSD-t检验。结果转染pcNS5A质粒的Huh7细胞质经RT-PCR及Western Blot检测,HCV NS5A mRNA及蛋白在细胞中获得表达。方差分析结果提示LTR荧光活性在三组间有明显的差异(F=7.876,P=0.002),进一步比较各组间的差异,结果提示共转染质粒pcNS5A+pGL3-LTR-Luc组的Huh7细胞中Luc相对活性(22 476±4471)明显高于单转染pGL3-LTR-Luc组(15 887±3039,P=0.002)及共转染质粒pRc/CMV+pGL3-LTR-Luc组(16 321±4162,P=0.008),差异有统计学意义。结论表达HCV NS5A的质粒pCNS5A成功转染至Huh7细胞;HCV NS5A蛋白能激活HIV LTR,提示HCV NS5A可能为HCV促进HIV复制的分子机制之一。