人胎儿表皮干细胞的体外分离培养及基因转染

目的：探讨人胎儿表皮干细胞体外分离培养的方法以及作为体外基因转染靶细胞的可行性。方法：利用Ⅳ型胶原快速贴附法分离人胎儿表皮干细胞，以人胎儿成纤维细胞条件培养液配制表皮干细胞培养基，通过角蛋白19（K19）和整合素β1免疫组化染色、细胞周期分析及克隆形成率测定，对培养细胞进行鉴定。采用脂质体介导法，以含血管内皮细胞生长因子165（VEFG165）基因片段的真核表达载体pcDNA3.1(pcDNA3.1/VEGF165)转染培养细胞；采用病毒载体介导法，以含报告基因绿色荧光蛋白（GFP）的重组腺相关病毒载体（raav/GFP)转染培养细胞。应用免疫组化染色及荧光显微镜观察检测转染效果。结果：人胎儿表皮干细胞呈明显克隆性生长、克隆形成率高，G1期细胞比例明显高于普通基底层角质细胞，K19和整合素β1免疫组化染色呈强阳性。pcDNA3.1/VEGF165转染的表皮干细胞VEGF165免疫组化染色阳性，raav/GFP转染的表皮干细胞呈现强荧光。结论：利用Ⅳ型胶原快速贴附法及人胎儿成纤维细胞条件培养基，可初步实现人胎儿表皮干细胞的分离培养。以质体为介导或以腺相关病毒为载体进行人胎儿表皮干细胞的体外基因转染是可行的。     

表皮干细胞的分离培养和鉴定

目的分离培养和鉴定人表皮基底层干细胞。方法中性蛋白水解酶选择性的消化表皮与真皮之间的细胞连接,采用改良的Ⅳ型胶原铺板选择黏附法分离、培养表皮中的干细胞,观察培养第2、4、6天时a6、β1整合素、K19、K14、p63、Nestin、CD34、PCNA及K10在表皮干细胞中的表达差异。结果改良过的Ⅳ型胶原铺板选择黏附法能够有效地促进表皮干细胞的贴壁和伸展。原代分离的表皮基底层干细胞a6、β1整合素,K19,K14,p63,Nestin,CD34及PCNA表达为强阳性而K10不表达。这些细胞具有干细胞的特点,可以形成克隆。随着培养时间的增加,表皮干细胞形态发生变化,a6、β1整合素、K19、K14,表达逐渐减弱,K10表达逐渐增强。此外,在原代分离的细胞中可见单个核样干细胞表达a6、β1整合素,K19,K14,p63,Nestin,CD34及PCNA,这些细胞形态相似体积较表皮基底层干细胞大,胞核为肾形,染色较深。结论中性蛋白水解酶消化合并改良过的Ⅳ型胶原铺板选择黏附法能够高效地分离表皮中的干细胞。分离的细胞具有干细胞的特点,可以形成集落。此外,原代分离培养的表皮干细胞中仍然可见单个核样干细胞,这些细胞形态相似,类似血液系统来源的单核细胞,胞质内均匀分布着粗大的阳性颗粒。单个核样干细胞可能与皮肤的发生、发育以及创伤修复有关。     

人表皮干细胞的体外分离和培养

目的:建立人表皮干细胞的体外分离和培养体系的方法,探索表皮干细胞体外大量扩增的途径.方法:采用0.375%的DispaseⅡ和0.05%胰蛋白酶二步酶消化法从小儿包皮中分离表皮细胞,采用MTF法筛选表皮细胞基础培养基和表皮细胞生长因子(epidermal growthfactor,EGF)的最适浓度,建立表皮干细胞培养的干预体系.逐日观察培养的细胞呈表皮干细胞样的形态,免疫组化方法检测β1整合素和角蛋白19的表达.结果:以表皮细胞数量和活性作指标,不同浓度EGF干预条件细胞活性不同,以15 ng/mL EGF的无血清SFM培养液为最适培养液,可使细胞呈表皮干细胞克隆样生长,β1整合素和角蛋白19表皮干细胞活性表达呈阳性.结论:采用0.375%的Dispase Ⅱ和0.05%胰蛋白酶二步酶消化法从小儿包皮中分离表皮细胞,以15 ng/mL EGF的无血清SFM培养液培养,此方法是一种简便、快速、经济的表皮干细胞分离和培养的方法.     

胎鼠表皮干细胞的分离培养及毛囊再生研究

目的：分离培养胎鼠的表皮干细胞及毛囊乳头层细胞，通过动物模型观察两者复合移植后，上皮形成及毛囊的再生情况。方法：采用IV型胶原分离培养胎鼠表皮干细胞，检测β1整合素及角蛋白15的表达水平，测定其细胞周期及克隆形成率（以角质细胞为对照）；分离培养毛囊乳头层细胞，并接种在纤维蛋白胶中，与表皮干细胞膜片复合形成全层皮肤等同物，移植在裸鼠全层皮肤缺损创面作为实验组，同时将胎鼠成纤维细胞替代乳头层细胞作为对照组，8－10周后观察创面及囊的组织学变化。结果：胎鼠表皮干细胞表达高水平的β1整合素及角蛋白15；细胞周期分析显示，G1期细胞百分率为94．9％，S期为3．5％，提示为慢循环细胞周期；角质细胞的G1期细胞有百分率为74．1％，S期为17．5％；表皮干细胞的克隆形成率为15．3％，明显高于对照组的6．7％；裸鼠创面愈合后8－10周，实验组可见新生毛囊形成，对照组未见到此现象。结论：能初步实现对胎鼠表皮干细胞的体外分离培养；在毛囊乳头层细胞的诱导下，胎鼠表皮干细胞可参与形成新的毛囊结构。     

人诱导性多潜能干细胞向表皮样干细胞分化的实验研究

目的 探讨人诱导性多潜能干细胞( iPSC)向表皮样干细胞分化的可能性.方法 (1)以经过灭活处理的小鼠胚胎Fb株作为滋养层,将人iPSC株接种于其上,加入胚胎干细胞完全培养液培养,Ⅳ型胶原酶消化法传代,倒置相差显微镜下观察人iPSC形态及生长状况并行碱性磷酸酶(AKP)染色.以胚胎干细胞不完全培养液悬浮培养iPSC,观察拟胚体形成能力.(2)将人iPSC接种于铺有人羊膜的6孔培养板培养,设为诱导组;另于未铺羊膜的6孔培养板上培养iPSC,作为对照组.观察2组iPSC形态,免疫细胞化学染色法检测整合素β1和细胞角蛋白19( CK19)表达.结果 (1)人iPSC在胚胎干细胞完全培养液中呈典型的干细胞克隆状生长,边界清楚,增殖旺盛;AKP染色阳性.iPSC在无滋养层条件下悬浮培养可形成拟胚体.(2)诱导组iPSC经培养4d后形成干细胞克隆,部分细胞整合素β1和CK19表达阳性.对照组细胞大量死亡,未见整合素β1和CK19表达.结论 人iPSC在羊膜诱导下可定向分化为表皮样干细胞,有望成为皮肤组织工程新的种子细胞.     

去分化表皮干细胞的来源鉴定和分析

目的：利用染色体特异性分析方法鉴定去分化表皮干细胞的来源。方法：包皮皮片去除皮下脂肪后,中性蛋白酶消化过夜,分离表皮和真皮。分离的表皮片用Ⅳ型胶原反复粘贴并冲洗去除表皮干细胞。处理后的表皮片经免疫组化鉴定无表皮干细胞后移植到雌性BALB／c裸鼠背部全层皮肤缺损创面,5d后用免疫组化法检测皮片内角蛋白10（CK10）、CK19和β1整合素的表达,然后用Ⅳ型胶原粘贴法分离皮片内去分化来源的表皮干细胞,并采用PCR的方法检测去分化细胞内的Y染色体。结果：未经处理的表皮片基底部细胞呈CK10染色阴性,CK19和β1整合素染色阳性;Ⅳ型胶原处理后的表皮片内细胞全呈CK10染色阳性。而去基底皮片移植后5d,在皮片的基底侧重新出现CK10染色阴性、CK19和β1整合素染色阳性的细胞。Ⅳ型胶原粘贴分离去分化来源的表皮干细胞,结果表明,移植皮片组在10min内约有4．56％的贴壁细胞出现,而未移植皮片组3h内无贴壁细胞出现。PCR分析结果显示在上述贴壁细胞内能检测到Y染色体的特异序列,而宿主来源的组织检测不到。结论：去分化表皮干细胞来源于移植皮片内成熟表皮细胞的去分化,而非宿主体内的干细胞。     

成人表皮干细胞和汗腺细胞的体外分离和培养

背景：人表皮干细胞和汗腺细胞的分离培养及鉴定,为探讨人表皮干细胞再生汗腺的可行性打下基础。目的：探讨体外分离培养人表皮干细胞及汗腺细胞的有效方法。方法：采集不同年龄段的泌尿外科患者术后包皮组织,充分清洗消毒后去除皮下组织,将其修剪成0.5cm×0.5cm的皮片,用Ⅳ型胶原纯化、富集成人表皮干细胞,倒置相差显微镜观察细胞形态：使用免疫荧光染色对成人表皮干细胞表型进行分析;CCK-8检测细胞的增殖曲线;采用胶原酶消化法从人全层无损伤皮肤中分离提取汗腺细胞,并进行扩增和鉴定。结果：倒置相差显微镜下见分离培养的成人表皮干细胞呈卵圆形、细胞之间紧密相连,呈铺路石状,免疫荧光染色显示细胞表达CK19、β1整合素。倒置相差显微镜下见汗腺细胞呈扁平多角形,表达汗腺细胞标志细胞CK7、18、19及CEA。结论：本实验结果说明胶原酶消化法分离培养成人表皮干细胞及汗腺样细胞是可行的。     

人表皮角质细胞系培养过程中细胞生物学行为和表型的变化

目的:获得较高比例的已分化表皮细胞,为表皮细胞去分化研究奠定基础.方法:采用常规表皮细胞培养方法对人表皮角质细胞系(HEK)进行培养和传代.每一代细胞均通过免疫细胞化学染色和Western blot 方法进行表皮干细胞和表皮细胞相应标志物的检测,包括β1整合素、角蛋白19(K19)、角蛋白10(K10)等指标.结果:第1代HEK呈克隆样生长,表皮干细胞标志物β1整合素、K19均有高表达,而K10的表达为阴性.经过数次传代,细胞克隆形成数目减少,细胞逐渐呈分散分布,K10的表达逐渐增高,而β1整合素、K19的表达呈下降趋势,比例减少.细胞培养至第5～6代时,为其生长的一个转折点,即此时细胞增殖能力开始明显降低,但形态良好,K10表达阳性细胞比例明显增高,而β1整合素、K19表达阳性细胞比例迅速降低.细胞培养至10～11代时,为其生长的第二个转折点,此时细胞几乎丧失增殖能力,数量显著减少,体积变大,核浆比明显减小,完全见不到β1整合素、K19表达阳性细胞,K10染色均为阳性.结论:可以选取适当代数的HEK用于去分化研究,为增加HEK的新用途提供了实验基础.     

快速贴壁法分选表皮干细胞及其评价

目的:认识表皮干细胞对IV型胶原的黏附特性,评价重复利用IV型胶原以快速贴壁法在分选表皮干细胞中的作用。方法:未包被胶原培养瓶的细胞作为对照组I,首次IV型胶原和三次IV型胶原包被的培养瓶分别作为实验组I和实验组II,将包被IV型胶原并曾黏附细胞的培养瓶消化后作为实验组III。人角质形成细胞分别接种其上,15min后对贴壁细胞进行显微摄像并计数,数据用SAS软件分析。对贴壁细胞的生长及增殖活性进行观察,并用β1整合素、K19对贴壁的细胞进行鉴定。结果:与对照组相比,胶原包被组的贴壁细胞数明显增多(P≤0.05),并于5天铺满培养瓶底,而对照组12天后仍未铺满瓶底。各实验组细胞15min贴壁数无明显差异(P>0.05)。贴壁细胞β1整合素和K19表达阳性。结论:表皮干细胞对IV型胶原具有较好的黏附特性,利用快速贴壁法可以得到较高纯度的表皮干细胞,重复利用IV型胶原对表皮干细胞的黏附特性几乎无影响并可节约费用。     

β1整合素在鼠切牙颈环上皮细胞中的表达

目的:观察β1整合素在鼠切牙颈环上皮细胞中的表达情况及意义.方法:体外分离、培养和纯化鼠切牙颈环上皮细胞,以β1整合素多克隆抗体为一抗,进行免疫组织化学染色.结果:颈环上皮细胞呈多角形,克隆状生长,免疫组织化学染色发现β1整合素在鼠切牙颈环上皮细胞中呈阳性表达.结论:鼠切牙颈环上皮细胞中富含干细胞,β1整合素可作为颈环上皮干细胞的标记物.     

Dendritic branch typing and spine expression patterns in cortical nonpyramidal cells

To understand the dendritic differentiation in various types of cortical nonpyramidal cells, we analyzed quantitatively their dendritic branching and spine expression. The dendritic internode and interspine interval obeyed exponential distributions with type-specific decay constants. The initial branching pattern, internode interval and spine density at the light microscopic level divided nonpyramidal cells into three dendritic types, correlated with axonal, neurochemical and firing types. The initial branching pattern determined the overall vertical spread of dendrites. Basket cell subtypes with different firing and chemical expression patterns were distinct in the vertical and horizontal spatial spread, providing diverse input territories. Internode densities of dendritic spines, as well as those of axonal synaptic boutons, did not correlate with the tortuosities and intervals, suggesting a tendency to distribute synapses homogeneously over the arbor. Dendritic spines identified at the electron microscopic level were different in length and shape among subtypes. Although the density was lower than that of pyramidal cells, spines themselves were also composed of several morphological types such as mushroom and multihead ones, which were expressed differentially among subtypes. Correlation of dendritic branching characteristics with differences in spine structure suggests distinct ways to receive specific inputs among the subtypes.     

大鼠失神经靶肌肉注射异体不同细胞对神经再生影响的研究

目的研究注射异体不同细胞于大鼠失神经靶肌肉对神经再生的影响.方法 SD成年大鼠36只,雌性,体重120～150 g,随机分为4组,每组9只.无菌条件下切断左侧坐骨神经,一期神经外膜缝合.术后即于小腿三头肌处注射相应细胞,7天注射1次,共4次.A组注射单纯雪旺细胞1×106/ml 1 ml,B组注射雪旺细胞加成肌细胞(雪旺细胞∶成肌细胞为1∶1)1×106/ml 1 ml,C组注射肾内皮细胞提取液1 ml,D组注射无血清培养液1 ml作对照.术后3个月取手术侧坐骨神经及坐骨神经所支配的小腿三头肌,进行大体和组织形态学观察、神经鞘细胞密度及单位面积靶肌肉(小腿三头肌)运动终板计数.结果术后3个月,各组近端神经鞘细胞均数为A组0.134 5±0.029 8,B组0.093 1±0.025 6,C组0.072 4±0.023 7,D组0.187 7±0.054 2;A组∶D组P值<0.05,B组∶D组、C组∶D组及A组∶B组P值均<0.01,B组∶C组P值＞0.05.术后3个月各组远端神经鞘细胞密度均数为A组0.186 0±0.042 5,B组0.155 1±0.032 1,C组0.104 7±0.013 3,D组0.240 9±0.056 8;A组∶D组P值<0.05,B组∶D组、C组∶D组及B组∶C组P值<0.01,A组∶B组P值＞0.05.术后3个月各组靶肌肉运动终板个数均数为A组6.000±0.866,B组9.000±2.291,C组12.780±1.394,D组3.110±0.782;A组∶D组、B组∶D组及C组∶D组P值<0.01,A组∶B组、A组∶C组及B组∶C组P值<0.01.结论雪旺细胞、混合细胞、肾内皮细胞提取液均有促进神经再生作用,肾内皮细胞提取液优于雪旺细胞及混合细胞.     

尿嘧啶脱氧核苷及超顺磁性氧化铁双标记的神经干细胞活体移植后细胞迁徙及功能性分化的实验研究

目的观察尿嘧啶脱氧核苷(Brdu)及超顺磁性氧化铁(SPIO)双标记的神经干细胞活体移植后存活细胞的迁徙及分化。方法SPIO和Brdu对神经干细胞进行双标记,移植至大脑中动脉梗死模型的对侧脑组织,术后采用MRI监测。第6周MRI检查后取组织切片行免疫组织化学染色,观察神经干细胞的迁徙及分化。结果双标神经干细胞活体移植后第3周MRI开始显示细胞沿胼胝体迁徙,第6周脑组织免疫组织化学染色亦显示干细胞沿胼胝体向对侧迁徙,免疫组织化学荧光双标染色显示移植的神经干细胞可以分化为星形胶质细胞及神经元。结论移植存活的神经干细胞在迁徙过程中能够进行功能性分化。     

肝干细胞的研究进展及应用前景

目的阐述肝干细胞（liver stem cell，LSC）的研究进展并展望其应用前景。方法广泛查阅近年来相关文献，根据研究成果，综述LSC研究的最新进展。结果LSC向特定的细胞分化和增殖受多种因素影响。LSC活化、分离培养、筛选及鉴定等方法尚未成熟。结论随着研究不断地深入，LSC有望成为肝病治疗的新型种子细胞，但其研究有待进一步完善。     

大鼠肝窦内皮细胞分离、培养及其生物学特性的初步研究

目的　建立大鼠肝窦内皮细胞 (SEC)的原代分离、培养方法 ,并研究其生物学特性。方法　胶原酶灌注结合Percoll密度梯度离心加选择性贴壁的方法分离SEC ;用光镜、扫描电镜观察培养SEC的形态学变化及超微结构 ;用Ⅷ因子和CD14免疫细胞化学染色及RECA 1单抗间接免疫荧光法观察SEC表面分子的表达。结果　分离培养的SEC得率为 (2 .0 6± 0 .35 )× 10 7/只大鼠 ,活力≥ 92 % ,纯度达 90 % ;光镜下细胞形态典型 ,SEM下可观察到特征性的窗孔结构 ;Ⅷ因子染色阴性而CD14染色阳性 ,RECA 1单抗间接免疫荧光染色阳性。结论　分离培养的SEC细胞得率、活力及纯度较高 ,形态典型且具有一般细胞所没有的窗孔结构及表面标志 ,为其功能和作用机制的深入研究奠定了基础。     

骨质疏松小鼠模型骨髓间充质干细胞特性的研究

目的 探讨骨质疏松小鼠模型骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells ,MSCs）生物学特性的改变。方法 通过皮下注射地塞米松构建小鼠骨质疏松动物模型（OP组）,同时设立对照（NC组）,分离OP组及NC组骨髓MSCs进行体外培养;通过流式细胞术检测细胞表面分化抗原;运用CKK-8实验检测细胞增殖活力;通过脱氧核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记法（TUNEL）检测细胞凋亡水平;运用碱性磷酸酶（ALP）活性检测、油红O染色及Western blot法检测两组细胞成骨分化及脂肪分化能力。结果 经过骨组织学检测证明模型建立成功,体外培养OP组及NC组骨髓MSCs细胞形态无差异。OP-MSCs细胞表面分化抗原Scal1及CD44为阳性, CD34及CD11b为阴性,与NC-MSCs相似,但OP-MSCs增殖活力下降（P<0.05）;此外两组细胞凋亡水平类似（P>0.05）。成骨分化诱导7 d后OP-MSCs的ALP活性显著低于对照组（P<0.01）,21 d后矿化小结明显减少（P<0.001）;脂肪分化诱导8 d后OP-MSCs形成更多脂滴（P<0.05）。Western blot结果显示OP-MSCs在成骨分化中低表达转录因子Runx2（P<0.05）及Osterix (P<0.001）,但在脂肪分化早期高表达PPARγ（P<0.001）及C/EBPα（P<0.01）。结论 骨质疏松小鼠骨髓MSCs的增殖及分化潜能显著下降。     

兔雪旺细胞的培养方法及形态学研究

利用兔坐骨神经组织进行体外细胞培养研究，获得了雪旺细胞。兔雪旺细胞的形态与其他文献报道的鼠或人的外周神经培养获得的雪旺细胞形态基本相似，典型的雪旺细胞形态特征为胞体较小、梭形、两侧突起纤长、核窄长。倒置显微镜下看，胞体四周常有亮边，细胞成极性生长排列。通过免疫组织化学染色证实具有典型形态的梭状细胞为雪旺细胞，而扁平状形态不规则的细胞为成纤维细胞     

肿瘤干细胞的研究进展

肿瘤具有异质性的特征,随着研究的深入,越来越多的证据提示肿瘤组织中也存在少量具有干细胞性质的肿瘤干细胞,于是人们在此基础上提出了肿瘤干细胞学说,肿瘤干细胞已成为当今肿瘤研究领域的热点。目前,已经从白血病、脑肿瘤、乳腺癌、恶性黑色素瘤及前列腺癌等多种恶性肿瘤中初步分离鉴定出肿瘤干细胞。肿瘤干细胞学说的提出,使得靶向性杀伤肿瘤干细胞从而根治肿瘤成为可能。     

Evidence of pluripotent human prostate stem cells in a human prostate primary xenograft model

INTRODUCTION: The phenotypic plasticity of the human prostate stem cell within human prostate tissue was examined to determine the response of the stem cell to changes in the androgenic environment. METHODS: Prostate xenografts were transplanted into athymic nu/nu mice implanted with testosterone pellets, allowed to establish for 1 month time point, the hosts were castrated and pellets removed, and following 1 month of androgen deprivation, the hosts were stimulated with androgen for 2 days to induce proliferation of the residual population of stem cells (2-month time point). RESULTS: Glands in benign xenografts harvested at the 1- and 2-month time points contained basal cell layers that expressed p63 and high molecular weight cytokeratin, and in which essentially all of the cellular proliferation was localized, consistent with the proposed localization of the prostate stem cell. Benign glandular structures in the xenografts were populated by basal, secretory epithelial, neuroendocrine (NE), or squamous cells overlaying the basal cell layer, whereas, adenocarcinoma glands in the xenografts resembled the original prostate cancer (CaP) tissue. CONCLUSIONS: In this human prostate primary xenograft model, the residual stem cell population that survives transplantation, or androgen deprivation, maintains significant pluripotentiality as demonstrated by the capacity to generate progeny that differentiate along multiple lineages in response to microenvironmental signals, particularly along the secretory epithelial lineage in response to androgen, and along the NE cell lineage in response to androgen deprivation.