血小板保存3天后再冷冻保存的实验研究及临床应用

本研究探讨血小板常温保存3天后再进行-80℃冰箱内冷冻保存及临床应用的可行性。对当天冷冻和保存3天后再冷冻血小板进行了计数，并检测聚集力、黏附力以及CD62p的表达，并通过可对比性病例观察保存3天后再冷冻与当天冷冻血小板，临床应用的可能性。结果表明：在保存期3天之内血小板数量、低渗性休克反应、黏附功能无显著差异性改变（P〉0．05），但聚集功能和CD62p的表达率的变化有显著性差异（P〈0．05）。当天保存并冷冻的血小板与保存3天后再冷冻的血小板各项指标的变化都无显著性差异。CD62p的再表达率（CD62p凝血酶激活后阳性率-CD62p激活前的阳性率）也无显著性差异，分别是51．1±4．5和51．1±4．4（P〉0．05）。临床应用当天冷冻和保存3天后再冷冻血小板的CCI值分别是48％和49％，无显著性差异（P〉0．05）。结论：血小板保存3天后可以再-80℃冷冻保存，其临床应用效果与当天冷冻血小板比较后无明显差异。     

保存期内机采血小板的生理活性及功能的分析

目的:探讨保存期内机采血小板的生理活性及功能的变化。方法:随机选择17例来源于符合国家标准的献血者的机采血小板,(22±2)℃振荡保存。分别于保存第0、1、3、5天进行血小板计数、平均血小板体积、血气分析、p H值、葡萄糖、乳酸、乳酸脱氢酶、血栓弹力图、低渗休克反应以及CD62p表达的测定,从而对血小板在保存期内的生理活性及功能的变化做出综合评价。结果:随保存时间的增加,与采集时比较,机采血小板计数、平均血小板宽度以及血小板低渗透反应性的变化,均无统计学意义;血小板的p H值,血气分析、葡萄糖、乳酸、乳酸脱氢酶等代谢指标,CD62p表达率和再表达率等指标的变化,均具有统计学意义;血栓弹力图参数中,血小板的R值的变化、及MA保存第5天的变化,具有统计学意义,而K值、αAngle的变化及MA保存第1、3天的变化,均无统计学意义。结论:机采血小板在保存期内能保持良好的活性及功能,临床上输注保存期内的机采血小板,不会因保存时间而影响输注效果。     

白细胞滤除对机采血小板质量的影响研究

本研究旨在评价白细胞滤除对机采血小板整体质量的影响。随机选取20单位单供者机采血小板在（22±2）℃条件下振荡保存24—96小时后使用血小板型白细胞过滤器进行过滤,分别检测机采血小板过滤前后的血小板浓度、平均血小板体积（MPV）、血小板单位容量、白细胞量、pH值、乳酸脱氢酶（LDH）浓度、K^＋浓度、血小板膜表面CD62p表达率、血小板凝血指数MA值,并计算白细胞去除率和血小板损失率。结果表明：机采血小板经白细胞过滤器过滤后,残留白细胞计数明显低于滤前白细胞计数（P〈0．001）,白细胞去除率达到了99．97％;血小板损失率为（8．1±4．2）％,明显低于20％的国家标准规定（P〈0．001）;与过滤前相比,过滤后MVP、机采血小板保存介质中的LDH浓度、K^＋浓度和pH值无明显变化（P〉0．05）,过滤后的血小板膜表面CD62p表达率出现轻度下降（P〉0．05）,但滤盘灌注液内血小板膜表面CD62p表达率却明显高于滤前（P〈0．05）;过滤后血小板MA值出现轻度下降,但无明显统计学差异（P〉0．05）。结论：使用白细胞过滤器可以有效去除机采血小板中混杂的白细胞及部分活化血小板,使血小板损失率控制在较低水平,且对于血小板凝血活性没有产生明显影响。过滤后的机采血小板达到预防巨细胞病毒感染及HLA同种免疫的质量要求。     

糖基化修饰血小板冷藏稳定性研究

本研究旨在观察尿苷二磷酸半乳糖（UDP-6ai）糖基化修饰人血小板的稳定性、理化指标及体外功能变化。实验分为室温对照组、冷藏对照组以及修饰组（U＋4组和4＋U组）。机采人浓缩血小板悬液，4℃保存前或后添加适量UDP—Gal，进行糖基化修饰，分别于0、1、3、5、7、14天，通过荧光标记识别血小板膜糖蛋白末端半乳糖残基的凝集素（FITC—RCAⅠ）检测糖基化修饰效果；pH计检测血小板悬液pH值；血细胞计数仪检测血小板平均体积；比浊法测定血小板聚集率；流式细胞术检测血小板活化标志CD62P、血小板膜蛋白CD42b及Ps的表达。结果表明：保存14天时，修饰组血小板RCAⅠ结合率是室温组的5—6倍；修饰组血小板悬液pH低于室温组，但二者之间无显著性差异（P〉0．05）；保存14天时室温组和修饰组血小板平均体积分别为10．6±1．9fL和11．14±1．1fL，二者之间无显著性差异（p〉0．05）；各组体外聚集活性在保存过程中均逐渐下降，但修饰组优于室温组（p〈0．05）；流式检测结果显示，保存1—5天修饰组CD62P、CD42b和Ps表达的阳性率与新鲜血小板无显著性差异（P〉0．05），但保存14天时，CD62P和Ps表达的阳性率升高，CD42b表达的阳性率降低，与新鲜血小板相比差异极显著（p〈0．01）。结论：在修饰血小板保存过程中，糖基化修饰的效果稳定，修饰血小板的pH和平均体积均处于正常值范围之内，聚集活性良好，优于室温保存组，但在保存5天后表现出不同程度的活化。     

2型糖尿病患者微血管病变与血小板活化关系的研究

目的：探讨血小板活化在糖尿病及其微血管病变发生、发展中的作用。方法：对糖尿病微血管病变患者按尿清蛋白排泄率（UAER）分为正常清蛋白尿（NA）组、微量清蛋白尿（MA）组、临床清蛋白尿（CP）组三组，分别用流式细胞术、血液聚集仪、全自动血细胞分析仪测定血小板内“一颗粒膜蛋白（CD62p）、溶酶体蛋白（CD63）的表达及血小板聚集功能和平均体积，并与30例正常对照组比较。结果：糖尿病微血管病变患者各组血小板膜糖蛋白CD62p、CD63的表达水平及血小板聚集功能和血小板平均体积均增高，与对照组比较差异有显著性（P〈O．01或P〈0．05）；糖尿病微血管病变患者中，CP组CD62p、CD63的表达水平及血小板聚集功能和血小板平均体积显著高于NA组（P〈0．01）和MA组（P〈0．01），MA组又显著高于NA组（P〈0．01或P〈0．05）。结论：CD62p、CD63的表达及聚集功能和平均体积的测定是反映血小板活化的指标，对判断糖尿病微血管病变的发生、发展及早期诊断和早期预防具有重要意义。     

改良血小板添加液低温液态保存血小板的形态及功能研究

本研究探讨使用改良的血小板添加液替代70％自体血浆在低温（10℃）液态条件下对血小板的保存效果。采集6名供者单采血小板,每一名供者单采血小板平均分为3组,A组（常规保存组）加入100％血浆、22℃保存：B组（添加液10℃保存组）加入70％PAS—ⅢM／30％血浆、10℃保存;C组（冰冻保存组）加入100％血浆和海藻糖、-85℃保存;另设D组（血浆4℃保存组）加入100％血浆、4℃保存,作为扫描电子显微镜对照组。A、B组在第1、5、7、9天取样,C组在20天后复苏取样,分别检测CD62p、HSR、PAgT、LDH的变化。血浆常温组、添加液低温组于保存后第3、9天取样扫描电镜观察,血浆低温组于保存后第3天取样观察．冰冻组在20天后复苏取样观察,同时使用新鲜血小板作为对照。结果表明,保存期内随保存时间延长,A组和B组CD62p表达增加,HSR和最大聚集率降低;A组的LDH释放、CD62p表达、HSR、血小板最大聚集率与B组比较有显著统计学差异（P〈0．05）。C组LDH释放明显较其他两组增多,但CD62p表达较少（P〈0．05）。A、B组血小板形态保持较好,C组血小板形态保持差。结论：改良的PAS—ⅢM保存液能够替代血浆用于血小板的保存,在低温条件下能够很好地保护血小板的功能,保存效果优于血浆常温保存。     

白膜法手工富集血小板与单供者机采血小板质量对比研究

本研究旨在对比白膜法手工富集血小板与单供者机采血小板的质量差异。将15袋（2单位/袋,400ml全血制备）白膜法手工富集血小板和15单位单供者机采血小板在（22±2）℃条件下振荡保存。在制备后1小时检测血小板浓度、体积、白细胞残留量、红细胞残留量;分别在血小板保存的0、1、2、3、4、5天检测平均血小板体积、pH值、乳酸浓度、血小板膜表面CD62p表达率、凝血酶激活后CD62p再表达率、血小板低渗休克反应。结果显示：二组的血小板得率、红细胞残留量、白细胞残留量都分别达到相应的国家质量标准,但在达到相同血小板计数的情况下,白膜法手工富集血小板组的红细胞残留量、白细胞残留量明显高于单供者机采血小板组（p〈0.01）;二组的乳酸、血小板膜表面CD62p表达率均随保存时间延长而升高;二组间比较,白膜法手工富集血小板组CD62p表达率在保存0-5天均高于单供者机采血小板组（p〈0.01）。二组的pH值、凝血酶激活后CD62p再表达率均随保存时间的延长而下降;二组间比较,2-5天白膜法组pH值明显低于单供者机采血小板组（p〈0.01）,0-5天白膜法组CD62p再表达率明显低于单供者机采血小板组（p〈0.01）。单供者机采血小板组血小板低渗休克反应水平在0-5天无明显变化,而白膜法手工富集血小板组血小板低渗休克反应水平随保存时间的延长而下降,保存1-5天时均明显低于单供者机采血小板组（p〈0.01）。结论：白膜法手工富集血小板质量低于单供者机采血小板质量,其制备工艺有待改进和优化,以降低红细胞、白细胞残留量和活化血小板水平,提高其血小板质量。     

二甲亚砜对血小板冻存中功能保护作用的实验研究

本研究探讨二甲亚砜（DMSO）对血小板冻干保存中激活的抑制作用。以CD62p和PAC-1表达作为血小板的激活标志，CD62p和PAC-1再表达和血小板最大聚集率作为评价血小板功能的指标。对血小板经离心、洗涤及海藻糖负载等顸处理过程中加与不加DMSO的实验组，分别进行血小板膜表面糖蛋白CD62p和PAC-1表达及再表达的流式细胞术（FCMs）分析，血小板最大聚集率和血小板平均体积（MPV）的测定，研究DMSO对血小板激活抑制作用的可逆性。结果显示，血小板经预处理后，不含DMSO组的CD62p和PAC-1表达率显著增高，分别达30．37％和15．01％；含DMSO的组，CD62p表达率为10．72％，PAC．1几乎不表达（0．11％），显著低于不含DMSO组（P〈0．01）。DMSO稀释后，血小板CD62p再表达为54．39％，显著低于对照组（71．69％）和高于不含DMSO组（35．98％）（P均〈0．01）；PAC-1再表达率为49．28％，与对照组（54．48％）无显著差异，显著高于不含DMSO组（P〈0．叭）。在含DMSO组，血小板用原血浆稀释后，血小板聚集功能恢复，对restocetin，thrombin和propylgallate诱导的血小板聚集率分别为92．76％，91．24％和89．66％，与对照组和无DMSO组比无显著性差异，对ADP诱导的聚集率有34．33％，显著高于无DMSO组（P〈0．01），但仍显著低于对照组（P〈0．01）。结论：DMSO对体外处理所致的血小板膜表面CD62p和PAC-1表达具有抑制作用，且该抑制作用是可逆的，DMSO稀释后血小板仍具有CD62p和PAC．1表达能力和聚集反应功能，提示DMSO具有抑制激活损伤和低温保护的双重功能，这一生物学特性使DMSO在血小板的冻干保存中发挥重要作用。     

脑梗死患者活化血小板的检测及其临床意义

目的探讨脑梗死患者全血血小板膜糖蛋白Ⅱb／Ⅲa（PAC-1）、血小板颗粒膜糖蛋白140（CD6p）的变化及其临床意义。方法用全血流式细胞术测定76例脑梗死患者急性期和恢复期、30例高血压病患者和28例糖尿病患者外周血中血小板PAC-1、CD62P的表达水平，并与20例健康对照者比较。结果脑梗死组急性期、恢复期、高血压病组、糖尿病组PAC-1、CD62p的表达均明显高于正常对照组（均P〈0．01）。脑梗死患者急性期PAC-1、CD62P的表达大梗死灶组〉中梗死灶组〉小梗死灶组，各组之间比较有显著性差异（P〈0．01～0．05）。脑梗死患者急性期PAC-1、CD62P的表达重型〉中型〉轻型，各组之间比较有显著性差异（P〈0．01～0．05）。结论脑梗死急性期、恢复期、高血压病患者、糖尿病患者均存在血小板活化；脑梗死病人血小板活化与病情及梗死灶大小有关，PAC-1、CD62p可作为判断病情的指标。     

血栓弹力图在评价不同营养状况血液透析患者凝血功能中的作用

目的评价血栓弹力图（TEG）在诊断营养不良血液透析患者凝血功能障碍中的作用。方法选择30例维持性血液透析（MHD）患者和20例正常人,检测血红蛋白、血小板数量、凝血功能、白蛋白、前白蛋白、血脂和TEG。以主观综合性营养评估将患者分为营养不良组和营养正常组,比较三组以上指标的差异。结果（1）MHD患者血红蛋白、血小板、高密度脂蛋白较对照组降低。营养不良的发生率为46．6％,营养不良患者白蛋白、前白蛋白、总胆固醇低于营养正常者（P〈0．05）。（2）营养正常组患者常规凝血功能检查与对照组相比无显著性差异（P〉0．05）。营养不良组与对照组比较,凝血酶原时间、国际标准化比值延长,纤维蛋白原升高（P〈0．05）;与营养正常组比较,常规凝血功能检查无显著性差异（P〉0．05）。（3）与对照组相比,MHD患者TEG反应时间（R值）延长,凝血指数（CI）负值增大,营养不良患者最大振幅（MA值）增大（P〈0．05）。营养不良组与营养正常组比较,MA值增大,CI负值增大（P〈0．05）。结论MHD患者常存在营养不良,凝血功能改变较为复杂,常规凝血功能结合TEG检查能够早期发现不同营养状况血透患者凝血功能的异常。     

血小板添加液保存单采血小板的研究

目的研发一种新型血小板添加液(H-sol),并评价其对血小板的保存效果。方法新型血小板添加液(H-sol)的组成成分:氯化钠80.0mmol/L、醋酸钠25.0mmol/L、氯化钾5.0mmol/L、氯化镁2.0mmol/L、枸橼酸钠15.0mmol/L、葡萄糖15.0mmol/L、碳酸氢钠13.0mmol/L、磷酸二氢钠4.0mmol/L、L-精氨酸180.0μmol/L。将超浓缩单采血小板(PLT≥10×109/ml)悬浮在H-sol和100%血浆(对照组)介质中,置22℃±2℃振荡条件下保存,分别于1、5、7d取样检测血小板计数(PLT)、血小板平均体积(MPV)、血小板体积分布宽度(PDW)、pH、葡萄糖、乳酸、血小板低渗休克反应(HSR)、血小板形变能力(ESC)、CD62P表达率。结果血小板保存至7d时,H-sol组(含<10%的血浆)与对照组比较,PLT、MPV、PDW、CD62P表达率、HSR、ESC的差异无统计学意义(P>0.05),其pH高于对照组(P<0.01),1～7d葡萄糖平均消耗量和乳酸平均产生量明显低于对照组(P<0.01)。结论单采血小板在H-sol中的保存效果与100%血浆相同,血小板在H-sol中保存能更好地维持pH的稳定。     

25Gy γ射线辐照对手工富集人血小板CD62p表达的影响

本研究观察25Gyγ射线照射对22℃保存条件下的手工富集血小板悬液不同保存期CD62p、血小板计数及平均血小板体积(MPV)的影响。将富浆法分离的16袋血小板,每袋平均分为两份,其中1袋经25Gy137铯γ射线辐照,另1份不辐照,然后按美国血库协会(AABB)标准保存72小时。经辐照的血小板作为观察组,未辐照的血小板作为对照组。流式细胞术检测两组血小板辐照前及保存24和72小时后P选择蛋白的表达水平;同时用血细胞计数仪检测血小板数和平均血小板体积(MPV)。结果表明:辐照组与对照组血小板表达CD62p百分率均随保存时间的延长而增高;保存24小时与新鲜血小板比较有显著性差异(p(0.05),保存72小时与保存24小时比较有非常显著性差异(p(0.01)。在保存24、72小时后,两组血小板CD62p表达率、血小板计数无显著差异(p0.05);但两组血小板在保存72小时后MPV与新鲜血小板比较有显著性差异(p(0.05)。结论:γ射线照射不影响血小板的数量和质量,但手工血小板液态储存时间应尽可能缩短。     

流式细胞术测定保存血小板再表达CD62p方法的建立及应用

目的　①建立并优化测定血小板再表达膜表面激活标志物CD6 2p能力的流式细胞术 (FCM) ;②测定2 2℃保存液体血小板不同保存期再表达CD6 2p的能力 ,以评价该指标在血小板质量监测以及新的保存方法研究中的应用价值。方法　①采用浓度梯度法优化GPRP浓度条件 ,采用析因设计优化凝血酶浓度和 37℃孵育时间条件 ,寻找最佳阴、阳性对照 ;②将 13份血小板按AABB标准保存 ,并延长保存至 12d ,测定每天血小板CD6 2p再表达率 ,与其相应体内存活期作直线相关性分析。结果　①约 1.5× 10 6个血小板内加入 2 .5mmol/LGPRP可有效防止过量凝血酶诱导的聚集反应 ,孵育条件以 1U/L凝血酶 37℃ 15min然后室温置 15min最佳。采用新鲜富含血小板血浆(FPRP)为阴性对照 ,以凝血酶激活FPRP为阳性对照效果良好。② 2 2℃保存血小板CD6 2p再表达率与其相应体内存活期呈明显正相关 ,单份相关系数 (r) 0 .91～ 0 .99,总体相关系数为 0 .99。结论　①优化建立了一种灵敏简便 ,稳定性和重复性并好的流式细胞术方法用于测定保存血小板CD6 2p再表达率 ;②保存液体血小板CD6 2p再表达率与其相应体内存活期呈明显正相关 ,且相关性良好 ,提示CD6 2p再表达率是监测保存血小板质量的良好指标 ,同时还可能在新的保存方法研究和临床血小板功?     

急性血小板分离制备心脏手术患者富血小板血浆的质量分析

为评价心脏直视手术患者急性血小板分离制备的富血小板血浆（platelet—richplasma,PRP）的效率和效果,对PRP质量进行了分析。20例ASAⅡ—Ⅲ级择期心脏手术患者在麻醉诱导后进行全血采集和血小板分离。分别测定分离前（T1）的全血,分离后（T2）的PRP和回输前（T3）的PRP中的血小板数（Plt）、血小板平均体积（MPV）、血小板分布宽度（PDW）、血浆内pH、血浆乳酸（IA）浓度和乳酸脱氢酶（LDH）浓度、细菌培养结果、血小板CD62p和PAC-1阳性率以及ADP激活后的CD62p和PAC-1阳性率。结果表明：与全血相比,分离后的PRP中的血小板计数为（783±184）×10^9／L,MPV、PDW和pH值显著降低（P〈0．01）,LA、LDH浓度及CD62p和PAc-1阳性率无明显变化;回输前PRP血小板计数为（765±167）×10^9／L,MPV、PDw和pH值与T1相比显著降低（P〈0．01）,而LDH浓度、CD62p和PAC-1阳性率与T1和T2比较显著增高（P〈0．05或P〈0．01）;ADP激活后的CD62p和PAC-1阳性率各阶段无明显差异。结论：本研究所采取的方法可在术前高效分离心脏手术患者的血小板,而且不引起血小板活化;PRP在术中振荡保存后有部分血小板出现活化,但血小板整体活化功能无明显改变。     

Annexin V and platelet antigen expression is not altered during storage of platelet concentrates obtained with the AMICUS cell separator.

During storage of platelet concentrate the so-called "storage lesion" occurs. During this time, platelets loose their morphological and functional capacities that are necessary for proper in vivo efficacy following transfusion. Annexin V represents a marker for apoptosis. In this study, Annexin V and additional antigens were analyzed by flow cytometry. Platelet concentrates were obtained with a new cell separator (AMICUS Separator, Fenwal). Following apheresis, platelet units were stored for an experimentally prolonged time of seven days. Daily aliquots of the platelet-rich plasma were obtained to measure Annexin V and platelet antigens CD62p, CD63, CD41a, CD42b, and the binding of fibrinogen. All analyses were performed using flow cytometry. During storage, no significant changes in mean channel fluorescence intensity (MCFI) of CD41a (P = 0.99) and CD42b (P = 0.29), percentage of CD62p+ and CD63+ platelets (P = 0.23 for CD62p; P = 0.52 for CD63), and the binding of fibrinogen to platelets occurred (P = 0.85). Also, the expression of Annexin V remained constant with no significant change (P = 0.36). This study shows that antigens of platelets, obtained with the AMICUS cell separator are well preserved during storage. Regarding Annexin V, no obvious signs of apoptosis can be detected by flow cytometry. These findings demonstrate the high degree of biocompatibility of the apheresis device and storage container.