小鼠抗人Nanog多克隆抗体的制备及其鉴定

目的用基因免疫方法制备小鼠抗人Nanog多克隆抗体并进行鉴定。方法应用Accelrys软件分析Nanog抗原表位,选择其中免疫原性较强的抗原表位（A16-V101）,从Nanog cDNA全长质粒中扩增其cDNA（258bp）序列,克隆到pBQAP-TT构建基因免疫载体,鉴定正确后与辅助载体pCMVi-GMCSF和pCMVi-Fh31。同时免疫小鼠,12周后用ELISA方法检测血清抗体滴度,Western blot方法鉴定抗体对人肾组织的特异性。同时将Nanog-AAV2病毒转染到HKC细胞,免疫荧光定位Nanog在细胞的表达。结果成功构建了Nanog基因免疫载体,经酶切及序列分析鉴定完全正确。ELISA结果显示抗体滴度为1：32000。Western blot结果显示小鼠抗Nanog多克隆抗体识别人肾组织34kD的Nanog蛋白。免疫荧光结果表明转染的Nanog基因主要表达在HKC细胞细胞核。结论用基因免疫的方法可以成功制备高效价和高特异性抗Nanog多克隆抗体。     

抗人红细胞单链抗体基因的克隆与表达

目的：获得抗人红细胞单链抗体（single-chain antibody,ScFv)基因,并在大肠杆菌中表达具有能与人红细胞特异性结合的ScFv。方法：以从分泌抗人红细胞单克隆抗体细胞株中提取细胞的总RNA为模板,利用扩增鼠源性抗体可变区基因的通用引物,通用RT－PCR分别获得轻链（VL）、重链（VH）可变区基因,并通过15个氨基酸的加接肽（Gly4Ser)3按VL－接头－VH的顺序连接起来,组建成ScFv基因。结果：核苷酸序列分析证明,获得的单链抗体基因VH基因属于小鼠抗体重链可变区基因家族的V（A）组,VL基因属于小鼠抗体k轻链可变区基因家族的IV组。与PGEX－5X－3表达载体上的GST融合蛋白表达后,在相对分子质量54000有一明显的空载体对照没有的蛋白带（ScFv28000,GST26000）。间接免疫荧光证明该表达产物能与人红细胞特异性结合。结论：获得抗人红细胞ScFv基因和具有抗体活性的抗人红细胞ScFv,为建立患者自身红细胞凝集试验奠定了基础。     

抗人胃癌相关蛋白GCRG224多克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备胃癌相关蛋白GCRG224的多克隆抗体,为进一步深入研究其生物学功能及其在胃癌发生发展中的作用奠定基础.方法 在大肠杆菌中表达Thioredoxin/GCRG224融合蛋白,并以所获蛋白免疫新西兰兔,制备抗GCRG224的多克隆抗体.分别用ELISA、Western blot法鉴定抗体的效价及特异性.结果 在大肠杆菌中高效表达出相对分子量约为16.8kD的Thioredoxin/GCRG224融合蛋白,经凝胶回收法得到纯度近100%的蛋白产品.制备了抗GCRG224多克隆抗体.ELISA法检测抗体的效价达到1∶256 000,Western blot证实该抗体可与原核表达的GCRG224蛋白特异性结合.结论 成功地制备了胃癌相关蛋白GCRG224多克隆抗体.     

酶联免疫法与金标法检测抗-HIV的比较

目的 观察ELISA(间接法、双抗原夹心法)快速诊断金标法(胶体金免疫分析技术)在检测抗-HIV中试剂质量比较,并分析其原因。方法 用2001年卫生部免疫检验室间质评HIV质控血清10份,其中6份为阳性血清(经Weet-Blot确诊),用两厂家生产的ELISA间接法、双抗原夹心法、金标法做比较。结果 两厂家生产的ELISA间接法一份阳性标本不能检出,但两厂家生产的ELISA双抗原夹心法和金标法阳性检出率为100％。结论 试剂的质量对保证大量的献血员、高危人群的HIV筛查工作至关重要。     

酶联免疫法与金标法检测抗-HIV的比较

目的 观察EUSA(间接法、双抗原夹心法)快速诊断金标法(胶体金免疫分析技术)在检测抗-HIV中试剂质量比较，并分析其原因。方法用2001年卫生部免疫检验室间质评HIV质控血清10份，其中6份为阳性血清(经Weet-Blot确诊)，用两厂家生产的EUSA间接法、双抗原夹心法、金标法做比较。结果两厂家生产的ELISA间接法一份阳性标本不能检出。但两厂家生产的EUSA双抗原夹心法和金标法阳性检出率为100％。结论试剂的质量对保证大量的献血员、高危人群的HIV筛查工作至关重要。     

人PD-L1胞外区基因的克隆、原核表达及抗体制备

目的 克隆人PD-L1胞外区基因并进行原核表达及相应蛋白的抗体制备,为进一步研究PD-1/PD-L1通路及针对该通路进行疾病治疗和药物筛选奠定基础.方法 用PCR方法扩增编码人PD-L1胞外区的基因序列,克隆到原核表达载体pET28a(+)中并进行表达,用His抗体为一抗进行Western blotting鉴定并验证结合活性.用纯化的hPD-L1胞外区蛋白作为抗原免疫日本大耳白兔,制备多克隆抗体.通过酶联免疫吸附实验(ELISA)和流式法检测抗体滴度及其特异性.结果 原核表达质粒pET28a(+)-hPD-L1成功构建,并可在大肠埃希菌BL21(DE3)中诱导高效表达,得到的hPD-L1胞外区蛋白经SDS-PAGE和Western blotting鉴定正确.用纯化蛋白免疫日本大耳白兔,制备的多克隆抗体具有较强的免疫结合活性,抗体滴度可达105.结论 鉴定和纯化了原核表达的hPD-L1蛋白,制备的相应多克隆抗体能够检测真核细胞表达的hPD-L1蛋白,为进一步研究PD-1/PD-L1生物学活性奠定了实验基础.     

人源化小鼠抗人交联纤维蛋白单链抗体基因的克隆与表达

目的：克隆和表达人源化小鼠抗人交联纤维蛋白单链抗体。方法：首先依照人源化单链抗体的蛋白序鲁设计并优化人源化单链抗体的核苷酸序列，然后在化学合成１４条人源化单链抗体基因片段的基础上，利用二次ＰＣＲ方法构建完整的人源化单链抗体基因，并把构建的全长人源化单链抗体基因直接克隆到表达载体上，利用表达筛选和测序验证相结合的方法挑选正确的基因，并在大肠杆菌中进行了人源化单链抗体基因的ＩＰＴＧ诱导表达。结果：构建     

肝素联合阿司匹林治疗抗磷脂综合征

目的：探讨肝素联合阿司匹林治疗抗磷脂综合征的疗效。方法：分析42例患者治疗前后的情况。结果：统计学分析表明，42例抗磷脂综合征患者治疗后，不孕症及胎儿宫内发育迟缓较治疗前有显著性差异，习惯性流产、早产、胎死宫内和妊娠高血压综合征与治疗前相比无显著差异。结论：肝素联合阿司匹林治疗抗磷脂综合征安全有效。     

免疫PCR方法检测乳癌患者血清抗P53蛋白抗体

p5 3基因是人类肿瘤中突变频率最高的抑癌基因 ,几乎发生在所有肿瘤 ,与肿瘤产生、生长调控和细胞凋亡等关系密切 ,检测p5 3基因 /蛋白对诊断肿瘤、评价患者预后和提高患者术后生存期限具有重要价值。p5 3突变基因编码突变型P5 3蛋白并在细胞内积聚 ,与细胞内的热休克蛋白HSP70结合 ,导致异常的P5 3蛋白过度表达 ,释放入血而诱发机体自身免疫应答 ,产生抗P5 3蛋白抗体。最近的研究发现 ,抗P5 3蛋白抗体可以反映早期p5 3基因突变和P5 3蛋白表达 ,可用于肿瘤的诊断、肿瘤转移和复发检测及p5 3表达动态观察 ,已引起了国内外研究者的关注[1…     

Inhibition of gallium-67 uptake in melanoma by an anti-human transferrin receptor monoclonal antibody

The effect of an anti-human transferrin receptor (anti-TFR) monoclonal antibody (MoAb), designated B3/25, and an anti-melanoma antibody, designated 96.5, on the uptake of gallium-67 (67Ga) by tumor was studied. Three groups of six athymic mice bearing a human melanoma were injected via tail vein with (a) 0.55 mg human serum albumin (HSA) (control group), (b) 0.5 mg MoAb B3/25 + 0.55 mg HSA, and (c) 0.5 mg MoAb 96.5 + 0.55 mg HSA, respectively. Twenty-four hours later, each mouse was given an intravenous dose of 5 microCi [67Ga] citrate. Biodistribution of activity (percent injected dose per gram) determined 48 hr after injection of 67Ga showed a 75% decrease in tumor uptake in the group of mice that received B3/25 (anti-TFR MoAb) compared with the control group. In contrast, MoAb 96.5 did not show any effect on melanoma uptake of 67Ga. Histologic findings suggest that the decreased uptake was not due to cellular damage resulting from binding of B3/25 to TFR. The results of this study strongly suggest the involvement of TFR in the in vivo tumor uptake of 67Ga.     

乙型肝炎病毒前-X蛋白在大肠埃希菌中的表达及多克隆抗体的制备

目的在大肠埃希菌中表达乙型肝炎病毒(HBV)前-X蛋白,纯化、鉴定并制备多克隆抗体。方法通过PCR技术获得HBV前-X编码基因片段,克隆至载体pET32a( ),构建原核表达重组质粒,转化至大肠埃希菌中诱导表达,表达产物进行Ni 亲和层析纯化,经Western blotting证实该蛋白的免疫原性,然后免疫新西兰兔获得多克隆抗体并经ELISA实验测定效价,经Western blotting证实其免疫反应特异性。结果成功构建原核表达载体并在大肠埃希菌中高效表达,表达产物主要以包涵体形式存在,融合蛋白的相对分子量约为25kD,Western blotting结果表明目的蛋白具有特异性的免疫反应识别。成功获得前-X蛋白的多克隆抗体,ELISA检测抗体效价为>1:128000,Western blotting实验证实获得的抗体能发生特异性免疫反应。结论成功完成了HBV前-X蛋白的体外表达及多克隆抗体制备,为检测前-X蛋白在乙型肝炎患者体内的表达及进一步研究其生物学特性奠定了实验基础。     

四唑蓝比色法测定肝素酶活性

目的：建立一种检测肝素酶活性的简便快捷的方法。方法：肝素酶作用于肝素／硫酸肝素特定位点的β-1，4糖苷键生成还原性醛基末端，还原性醛基末端可将生色底物四唑蓝还原成蓝色产物。颜色变化反映还原性醛基基团数量的改变的特性，被用于肝素酶活性的检测。结果：四唑蓝比色法的结果表明，颜色的改变程度与酶活性戍正比；凝胶和SDS-PAGE电泳法验证了四唑蓝比色法的结果。结论：四唑蓝比色法可较准确地反映肝素酶活性，可以成为测定肝素酶活性的简便、经济、有效的方法。     

XTP3基因融合蛋白的表达纯化及多克隆抗体制备

目的构建稳定表达乙肝病毒XTP3蛋白的原核表达载体并在大肠埃希菌中诱导融合蛋白的表达,制备兔抗XTP3蛋白多克隆抗体并检测该抗体在乙肝肝癌、正常肝组织中的作用效果。方法PCR获得XTP3基因片段,插入至pET-32a( )中构建原核表达载体pET-32a( )-XTP3,测序正确后转化大肠埃希菌BL21,IPTG诱导表达。SDS-PAGE、Western blotting分析鉴定融合蛋白的表达。利用Ni 亲和柱对表达蛋白进行纯化及柱上复性。免疫新西兰兔,制备多克隆抗体并进行ELISA、Western blotting及免疫组化验证。结果成功构建pET-32a( )-XTP3表达载体并在大肠埃希菌中诱导出高水平表达的XTP3融合蛋白,目的蛋白分子量为52kD,SDS-PAGE分析表明为包涵体表达。经亲和树脂纯化后免疫新西兰兔,成功获得融合蛋白及兔抗XTP3多克隆抗体。ELISA检测证明多克隆抗体效价>1:128000。免疫组化证实本实验中XTP3多克隆抗体在肝癌组织中的表达呈明显的细胞膜阳性,特异性良好。结论成功表达、纯化了XTP3基因融合蛋白,获得高特异性、高效价兔抗XTP3多克隆抗体,为进一步研究XTP3蛋白的生物学特性奠定了基础。     

Detection of thyroid tumour using a monoclonal 123I anti-human thyroglobulin antibody

A monoclonal antibody to human thyroglobulin was radiolabelled with 123I NaI and shown to be a stable and biologically active reagent in vivo. When injected intravenously into 12 patients with cancer of the thyroid on thyroxine-replacement therapy, 6 of the 12 patients had localization of the labelled antibody in tumour sites. These results were compared to 131I scans done on the same patients 1 month after stopping thyroxine. The biological half-life of the antibody in the blood was influenced by the levels of circulating thyroglobulin.     

Detection of thyroid tumour using a monoclonal 123I anti-human thyroglobulin antibody

A monoclonal antibody to human thyroglobulin was radiolabelled with ¹²³I NaI and shown to be a stable and biologically active reagent in vivo. When injected intravenously into 12 patients with cancer of the thyroid on thyroxine-replacement therapy, 6 of the 12 patients had localization of the labelled antibody in tumour sites. These results were compared to ¹³¹I scans done on the same patients 1 month after stopping thyroxine. The biological half-life of the antibody in the blood was influenced by the levels of circulating thyroglobulin.     

Evaluation of a transgenic mouse model for anti-human CEA radioimmunotherapeutics.

In this study, a human carcinoembryonic antigen (CEA) transgenic (CEA.Tg) mouse model was evaluated for the preclinical assessment of agents directed against CEA. METHODS: Cell-type and organ-specific expression of CEA was studied in CEA.Tg mice derived from a colony that carries the complete human CEA gene together with flanking regulatory sequences and also in wild-type controls. Biodistribution studies were performed on wild-type and CEA.Tg mice by intravenous injection of 125I-labeled anti-CEA (PR1A3) or isotype control (IC) murine monoclonal antibodies (mAbs). Studies were also performed on tumor-bearing CEA.Tg and nude mice. RESULTS: As with humans, the CEA.Tg mice had low serum levels of CEA (mean, 8.8 +/- 5.52 ng/mL), and cell-surface CEA expression was primarily localized in the gastrointestinal tract. Both mAbs showed similar biodistribution patterns in the wild-type mice, whereas in the CEA.Tg mice, PR1A3 specifically localized to the CEA-expressing tissues. In the gastrointestinal tract, the percentage injected dose for PR1A3 was significantly higher than that for IC mAb at all the time points sampled. In CEA.Tg mice bearing a murine tumor transfected with human CEA, PR1A3 targeted tissues with constitutive CEA expression and was retained at the tumor site at high levels, whereas in nude mice, PR1A3 localized only to the site of the transplanted tumor. CONCLUSION: These results demonstrate the targeting potential of the anti-CEA antibody, PR1A3, and emphasize the value of using a transgenic model in preclinical studies.     

Epo多克隆抗体对抗Epo活性的研究

目的:探讨促红细胞生成素(Epo)多克隆抗体是否具有拮抗Epo所致的高原红细胞增多症患者骨髓红系增殖活性的功能。方法:抽取高原红细胞增多症病人骨髓,分离单个核细胞,进行红系定向体外培养,观察加入Epo及Epo多克隆抗体对红系集落形成单位(CFU-E)的影响。结果:Epo多克隆抗体体外能抑制高原红细胞增多症病人骨髓红系增殖。结论:Epo抗体可以显著拮抗Epo促红细胞增生作用。     

抗SARS冠状病毒N蛋白多克隆抗体的制备和鉴定

目的制备抗SARS冠状病毒(SARS-CoV)N蛋白的多克隆抗体。方法以纯化的GST-N免疫新西兰白兔,制备抗SARS-CoVN蛋白多抗,间接ELISA法检测兔血清效价,Westernblot和免疫组化鉴定多抗的特异性。结果制备的抗SARS-CoVN蛋白多克隆抗体经ELISA检测效价为1·2×10-5,Westernblot和免疫组化证实此抗体可与SARS-CoVN蛋白特异性结合。结论成功地制备了抗SARS-CoVN蛋白多抗,为进一步的临床诊断和实验研究创造了条件。