As2 O3上调FOXO3a促人大肠癌SW620细胞凋亡及其相关研究

目的观察三氧化二砷(As2 O3)对人大肠癌SW620细胞凋亡的影响,进一步研究As2 O3作用后,凋亡相关基因FOXO3a、Bcl-2和Bax 表达的关系.方法体外常规培养人大肠癌SW620细胞,以不同浓度As2 O3干预24 h ,观察细胞形态变化;Hoechst检测药物作用后细胞核形态变化;RT-PCR检测药物作用后FOXO3a、Bcl-2和Bax mRNA的表达;SP法检测药物作用后FOXO3a、Bcl-2和Bax蛋白的表达.结果 As2 O3作用后,SW620细胞数量明显减少,细胞变小、变圆,染色质固缩,胞核致密浓染,核碎裂增多并出现凋亡小体;FOXO3a和Bax mRNA和蛋白的表达随As2 O3浓度增加而增加,Bcl-2 mRNA和蛋白的表达随As2 O3浓度增加而减少.结论 As2 O3具有诱导大肠癌SW620细胞凋亡的作用,且与As2 O3浓度有量效关系.其机制可能是通过上调FOXO3a因子,继而上调Bax和下调Bcl-2的表达影响细胞凋亡.     

三氧化二砷对人结肠癌SW620细胞OCT4和FOXO3a因子表达影响的研究

目的研究已证实三氧化二砷(As2O3)可杀伤干细胞,最新研究表明大肠癌是一种干细胞起源的疾病。实验研究As2O3对于大肠癌干细胞因子的作用及相关机制。通过观察FOXO3a基因沉默和激动后,As2O3对人结肠癌SW620细胞FOXO3a和OCT4表达的影响,探究As2O3对OCT4表达影响是否通过FOXO3a途径。方法采用脂质体转染siRNA方法降低人结肠癌SW620细胞FOXO3a的表达,采用PI3K抑制剂LY294002提高FOXO3a的表达。给予As2O3作用后,RT-PCR方法检测FOXO3a和OCT4 mRNA的表达,Western blot方法检测FOXO3a和OCT4蛋白的表达。结果①As2O3增加SW620细胞中FOXO3a mRNA及蛋白的表达,同时降低OCT4 mRNA及蛋白表达(P﹤0.05);②FOXO3a siRNA处理后,FOXO3a mRNA及蛋白的表达明显降低,OCT4 mRNA及蛋白的表达增加。LY294002处理后,FOXO3a mRNA及蛋白的表达增加,OCT4 mRNA及蛋白的表达减少(P﹤0.05);③FOXO3a siRNA处理后,As2O3对FOXO3a和OCT4蛋白及mRNA表达无影响(P>0.05),LY294002处理后,As2O3对FOXO3a和OCT4蛋白及mRNA表达无影响(P>0.05)。结论 As2O3能下调人结肠癌SW620细胞OCT4因子表达,其机制可能与上调FOXO3a因子表达有关。     

三氧化二砷对结肠癌凋亡及耐药基因表达影响的研究

目的 研究三氧化二砷(As2O3)对结肠癌SW620的抑制和诱导凋亡作用及对MRP基因表达的影响.方法 选用结肠癌SW620细胞系,运用流式细胞术检测As2O3对结肠癌的抑制和诱导凋亡作用;用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测MRP mRNA的表达.结果 As2O3对结肠癌SW620细胞具有抑制生长作用及增加凋亡诱导率,不同浓度的As2O3均可诱导凋亡.1.0 pmol/L、2.0μmol/L的As2O3可下调MRP mRNA的表达.结论 As2O3具有诱导细胞凋亡的作用,并能下调MRP mRNA表达.     

As2O3在HuH7及CD13+ CD133+LCSCs增殖和分化中作用的初步观察

目的 观察As2O3对人肝癌细胞系HuH7及CD13+ CD133+肝癌干细胞(liver cancer stem cells,LCSCs)增殖和分化的作用.方法 用荧光激活流式细胞术(fluorescence activated cell sorter,FACS)从HuH7细胞系分选CD13+CD133+ LCSCs,MTF和EdU法分析As2O3刺激HuH7及CD13+ CD133+ LCSCs增殖作用.流式细胞术检测As2O3处理第3、5天HuH7细胞凋亡,和As2O3处理第3天细胞周期变化.Western blot分析HuH7粒细胞白血病(promyelocytic leukaemia,PML)蛋白表达情况.观察As2O3处理前后HuH7对吡柔比星敏感性和肿瘤球形成能力变化.结果 早期(5 d)低浓度As2 O3促进HuH7和CD13+ CD133+ LCSCs增殖,高浓度As2O3则抑制CD13+ CD133+ LCSCs增殖.As2O3虽然没有阻滞HuH7细胞周期,但使G0/G1期细胞降低2.32％.As2O3处理3d的HuH7细胞凋亡与正常对照HuH7细胞相似,凋亡率在8％～9.5％,第5天使HuH7细胞凋亡率上升到12％～15％,1.0 μg/ml As2O3组晚期凋亡率比0.5μ/ml As2O3高.As2O3改变HuH7细胞对THP敏感性,还显著降低CD13+ CD133+ LCSCs成球能力.HuH7细胞表达PML蛋白,As2O3可使HuH7细胞PML蛋表达降低,而且与HuH7细胞和CD13+ CD133+ LCSCs增殖有刺激作用,HuH7细胞凋亡及CD13+ CD133+LCSCs分化结果一致.结论 低浓度As2O3不仅刺激HuH7及CD13+ CD133+ LCSCs增殖,促进HuH7细胞凋亡,而且可能诱导CD13+ CD133+ LCSCs分化,其作用通过PML蛋白介导.     

HepG2、Hep3B细胞中肿瘤干细胞相关标志分子的表达

目的富集培养肝癌干细胞,研究肝癌干细胞相关标志物CD90、CD133、八聚体4(Oct4)和ATP结合盒转运蛋白ABCG2在肝癌细胞HepG2、Hep3B中的表达,并初步分析其意义。方法使用流式细胞仪从肝癌细胞(检测HepG2、Hep3B两种细胞系)中分选肝癌干细胞并行无血清成球培养。设肝癌细胞组为对照组。单细胞克隆形成实验检测细胞增殖能力。分别给予肝癌细胞及肝癌干细胞阿霉素处理,MTT法测阿霉素处理后各组细胞的存活率,Real-time PCR及Western blot分别检测各组细胞CD90、CD133、Oct4和ABCG2 mRNA及蛋白水平的表达。结果肝癌干细胞单个细胞增殖能力强于肝癌细胞,克隆形成分析显示培养第14天克隆形成率Hep3B细胞组低于Hep3B CSCs组[8/27(30%)vs 12/23(52%),P<0.05];HepG2细胞组克隆形成率也低于HepG2 CSCs组[7/38(18%)vs 9/26(35%),P<0.05]。用阿霉素处理肝癌细胞及肝癌干细胞48 h后,MTT法测定结果显示肝癌干细胞组细胞活性显著高于对照组(P<0.05):HepG2细胞组细胞活性为(38.17±6.92)%、HepG2 CSCs组为(69.88±5.43)%;Hep3B细胞组(50.16±4.89)%,Hep3B CSCs组为(78.53±7.86)%。Real-time PCR结果显示肝癌干细胞组中CD90、CD133、Oct4及ABCG2基因mRNA表达较亲代细胞组显著上调(P<0.05)。Western blot结果显示肝癌干细胞组Oct4及ABCG2蛋白水平显著上调,与亲代细胞组间表达差异有显著性(P<0.05)。结论肝癌干细胞相关标志CD90、CD133、Oct4及ABCG2均高表达于肝癌干细胞,并且Oct4及ABCG2基因的高表达有可能与肝癌干细胞耐药性相关。     

Expression of cancer stem cell-associated markers in liver cancer cell lines HepG2 and Hep3B

目的 富集培养肝癌干细胞,研究肝癌干细胞相关标志物CD90、CD133、八聚体4(Oct4)和ATP结合盒转运蛋白ABCG2在肝癌细胞HepG2、Hep3B中的表达,并初步分析其意义.方法 使用流式细胞仪从肝癌细胞(检测HepG2、Hep3B两种细胞系)中分选肝癌干细胞并行无血清成球培养.设肝癌细胞组为对照组.单细胞克隆形成实验检测细胞增殖能力.分别给予肝癌细胞及肝癌下细胞阿霉素处理,MTT法测阿霉素处理后各组细胞的存活率,Real-time PCR及Western blot分别检测各组细胞CD90、CD133、Oct4和ABCG2 mRNA及蛋白水平的表达.结果 肝癌干细胞单个细胞增殖能力强于肝癌细胞,克隆形成分析显示培养第14天克隆形成率Hep3B细胞组低于Hep3B CSCs组[8/27(30％)vs 12/23(52％),P＜0.05 ];HepG2细胞组克隆形成率也低于HepG2CSCs组[7/38(18％)vs 9/26(35％),P＜0.05].用阿霉素处理肝癌细胞及肝癌干细胞48 h后,MTT法测定结果显示肝癌干细胞组细胞活性显著高于对照组(P ＜0.05):HepG2细胞组细胞活性为(38.17 ±6.92)％、HepG2CSCs组为(69.88±5.43)％;Hep3B细胞组(50.16±4.89)％,Hep3B CSCs组为(78.53±7.86)％.Real-time PCR结果显示肝癌干细胞组中CD90、CD133、Oct4及ABCG2基因mRNA表达较亲代细胞组显著上调(P＜0.05).Western blot结果显示肝癌干细胞组Oct4及ABCG2蛋白水平显著上调,与亲代细胞组间表达差异有显著性(P＜0.05).结论 肝癌干细胞相关标志CD90、CD133、Oct4及ABCG2均高表达于肝癌干细胞,并且Oct4及ABCG2基因的高表达有可能与肝癌干细胞耐药性相关.     

结肠癌细胞体外模拟缺氧的相关研究

目的研究结肠癌细胞SW480与CD133+SW480肿瘤干细胞亚群对CoCl2模拟缺氧的反应性,及缺氧后抗凋亡、血管生成等相关基因mRNA水平表达的变化。方法 Western blotting比较SW480经不同浓度、不同时间CoCl2模拟缺氧后缺氧诱导因子1α(HIF-1α)表达的差异;免疫磁珠分选(MACS)CD133+SW480肿瘤干细胞亚群,流式细胞术检测其中CD133+细胞比例,选取稳定SW480细胞HIF-1α表达的最佳CoCl2浓度和时间作用后,Western blotting比较SW480细胞与CD133+SW480肿瘤干细胞亚群HIF-1α的表达差异;观察缺氧对肿瘤干细胞球形成和增殖能力的影响;实时定量PCR比较SW480经CoCl2模拟缺氧后结肠癌干细胞表面标志CD133(PROM1)、抗凋亡基因survivin、血管内皮生长因子(VEGF)mRNA水平表达的差异。结果 SW480细胞经200μmol/L CoCl2模拟缺氧8 h,HIF-1α表达量最高;经MACS分选所得CD133+SW480细胞中,CD133+细胞比例为85.56±0.89%;CD133+SW480亚群200μmol/L CoCl2模拟缺氧8 h未见HIF-1α表达;CoCl2模拟缺氧培养后CD133+SW480肿瘤干细胞亚群无血清培养肿瘤干细胞球形成率较常规培养明显增强;SW480经CoCl2模拟缺氧其CD133、survivin、VEGF等mRNA表达分别升高1.607±0.103倍(P<0.05)、2.745±0.370倍(P<0.05)、3.798±0.091倍(P<0.05)。结论 (1)CoCl2能够在体外模拟结肠癌细胞缺氧,稳定HIF-1α的表达;(2)结肠癌细胞模拟缺氧后HIF-1α的表达与CoCl2呈浓度和时间依赖性;(3)CD133抗体标记免疫磁珠分选SW480细胞后,CD133+SW480细胞有较高得率和细胞活性;(4)缺氧可使肿瘤干细胞球形成能力增强,CD133+SW480肿瘤干细胞亚群较普通SW480更能够耐受缺氧,肿瘤干细胞具有不同于普通肿瘤细胞的特殊生物学特性;(5)缺氧可改变肿瘤细胞表型,促进其向肿瘤干细胞转化,并能够增强肿瘤抗凋亡能力和血管形成能力。     

FOX03a在三氧化二砷影响大肠癌细胞β—catenin表达中的作用

目的探究三氧化二砷（As2O3）对侵袭相关因子β—catenin表达的影响是否与FOXO3a有关。方法采用脂质体转染siRNA以及LY294002药物改变大肠癌SW620细胞中FOXO3a的表达,Western blot检测FOXO3a、β—catenin蛋白表达水平,RT—PCR检测FOXO3a、β—catenin mRNA表达水平。结果As2O3增加SW620细胞中FOXO3a蛋白及mRNA的表达,同时降低β—catenin蛋白及mRNA表达（P〈0．05）。FOXO3a基因干扰后,β—catenin蛋白及mRNA的表达上调（P〈0．05）。LY294002药物处理后,β—catenin表达下调（P〈0．05）。结论As2O3对人大肠癌SW620细胞中β—catenin表达的抑制作用可能与其增强FOXO3a的活性有关。     

大肠癌细胞中Oct4与CD133的表达及意义

目的探讨大肠癌细胞中转录因子Oct4及干细胞标志物CD133抗原的表达情况及相关意义。方法采取术后大肠癌石蜡包埋的组织标本30例,应用免疫组化的方法分别检测癌组织及癌灶外邻近正常组织中Oct4及CD133抗原的表达情况。结果其中83.3%(25/30)的癌细胞标本中检测到Oct4+细胞,73.3%(22/30)检测到CD133+细胞。而且标本中CD133+细胞的比例与Oct4+细胞的比例呈正相关(r=0.586,P<0.05)。癌灶外邻近正常组织中检测到CD133+细胞与Oct4+细胞均显著少于癌组织(P<0.01)。结论大肠癌细胞中均有Oct4与CD133的表达,两者呈现正相关性,提示两者间可能存在相互调节的机制,其关系及相关意义有待进一步研究。     

沉默CD133基因对CD133+肝癌干细胞放射敏感性的影响

目的 研究沉默CD133基因对人肝癌CD133+-HepG2干细胞放射敏感性的影响.方法 免疫磁珠分选HepG2细胞;流式细胞术检测分选前后CD133表达率;NOD/SCID小鼠成瘤实验验证其干性;靶向沉默CD133基因并分组(空白组、阴性感染组、阳性感染组);RT-PCR和Western blot检测各组CD133基因mRNA和蛋白表达;克隆形成实验检测各组细胞经不同剂量照射后的克隆形成率及存活率,绘制存活曲线并计算各组细胞放射生物学参数Do、Dq、N及放射增敏比(SER);流式细胞术检测各组细胞周期及凋亡情况.结果 流式细胞术检测结果显示,分选前后CD133表达率分别为(1.36±0.20)％和(87.62±1.92)％.CD133+细胞在细胞数为1×103/ml时即可形成皮下移植瘤.RT-PCR和Western blot检测结果显示,阳性感染组CD133 mRNA和蛋白表达均受到明显抑制.流式细胞术检测结果显示:阳性感染组G1、S 期减少G2期增加,细胞凋亡率明显增加.克隆形成实验显示阳性感染组D0、Dq、N值与SF2均减小,放射敏感性明显增强,其SER为(1.37±0.02),差异均具有统计学意义(P＜0.05).结论 CD133作为肝癌干细胞的表面标志物之一,可能成为肝癌干细胞放射治疗增敏的靶点.