抑制Akt通路提高视网膜母细胞瘤对卡铂敏感性的实验研究

目的 探讨抑制Akt信号通路活性能否提高视网膜母细胞瘤（RB）SO-Rb50细胞对卡铂的敏感性。设计 实验研究。研究对象 SO-Rb50细胞株。方法 CCK-8法检测卡铂作用于细胞的IC50值;蛋白印迹法检测Akt、p-Akt、caspase 3、bax、p21蛋白在药物作用前后表达量的改变;流式细胞仪法检测药物作用前后细胞周期的改变。主要指标 IC50值,蛋白表达量,细胞周期中各期细胞百分比。 结果 卡铂作用于SO-Rb50细胞48小时的IC50值为（30.1±5.9）mg/L;分别用5 μM和10 μM的LY294002抑制细胞Akt信号通路的活性后,卡铂作用于SO-Rb50细胞的IC50值分别为（16.3±0.83）mg/L和（8.64±0.11）mg/L。用卡铂（30 mg/L）、LY294002（5 μM和10 μM）单独或联合作用于SO-Rb50细胞48 h后,细胞Akt活性随LY294002浓度的增加而降低,caspase-3蛋白生成增加,bax蛋白生成增加,p21蛋白在卡铂作用下生成显著增加;LY294002对细胞周期的进程无明显影响,卡铂使G0/G1期细胞百分比从（57.89±2.16）%下降至（12.11±2.87）%,G2/M期细胞从（0.34±0.34）%增加至（43.62±11.01）%,S期细胞无明显变化;两种药物联合作用并未改变卡铂对细胞周期的影响。结论 抑制Akt信号通路可提高SO-Rb50细胞对卡铂的敏感性,抑制Akt信号通路可能是提高RB化疗疗效的一个靶点。     

砷剂诱导人视网膜母细胞瘤Y79细胞系P16基因去甲基化及转录

目的 探讨三氧化二砷(As2O3 )诱导人视网膜母细胞瘤（RB）Y79细胞系P16基因去甲基化及转录激活的可能机制。方法四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT）法检测As2O3对Y79细胞生长和增生的抑制作用;流式细胞仪DNA含量分析法探讨As2O3对Y79细胞周期的影响;巢式甲基特异性聚合酶链反应法(n-MSP)及DNA克隆测序分析法检测As2O3作用前后Y79细胞P16基因甲基化状态;逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测P16基因、DNA甲基转移酶 (DNMT3A、DNMT3B)基因mRNA的表达。结果 As2O3 能明显抑制Y79细胞生长,使细胞阻滞于G0~G1期;未处理组细胞P16基因不表达,As2O3作用48 h后P16基因表达增强,甲基化程度减弱,甲基转移酶DNMT3A、DNMT3B mRNA 表达下降。结论 RB Y79细胞系存在P16基因高甲基化,As2O3通过抑制DNA甲基转移酶mRNA表达诱导P16基因去甲基化,显著上调P16基因mRNA表达,将细胞阻滞于G0~G1期, 抑制Y79细胞增生。     

C57BL/6小鼠形觉剥夺性近视视网膜Pax6的表达及其启动子区域CpG岛甲基化的改变

目的研究C57BL/6小鼠形觉剥夺性近视形成和恢复期视网膜Pax6 mRNA表达及其启动子区域CpG岛甲基化水平的变化情况。方法实验研究。采用单眼形觉剥夺（MD）建立C57BL/6小鼠近视动物模型和恢复期动物模型,将入选的小鼠按随机数字表法分为：MD 4周实验组（12只）、同龄对照组（12只）;MD 4周再恢复1周实验组（6只）、同龄对照组（NC,6只）。实验前后分别用红外偏心摄影验光仪检测小鼠眼球的屈光状态,光学相干断层扫描（OCT）检测小鼠的眼轴长度和玻璃体腔深度。RT-PCR检测视网膜 Pax6 mRNA表达水平;用硫化测序聚合酶链式反应（BSP）检测C57BL/6小鼠视网膜Pax6启动子区CpG岛甲基化水平。实验组形觉剥夺眼（MD-T）与对侧眼（MD-C）比较采用配对t检验,不同组小鼠比较采用独立样本t检验。结果MD 4周后,MD-T屈光度[（-3.27±0.52）D]与MD-C[（1.13±1.17）D]（t=-12.726,P<0.01）、NC[（1.65±1.69）D]（t=-6.832,P<0.01）相比明显向近视方向漂移。MD 4周再恢复1周后,实验性近视完全恢复。MD 4周后,MD-T相对定量值（0.495±0.247）相比MD-C（1.011±0.477）（t=-3.16,P<0.05）、NC（1.071±0.401）（t=-2.99,P<0.05）Pax6 mRNA表达水平明显下降;而恢复1周后Pax6 mRNA表达水平恢复到正常对照水平。MD 4周后,MD-T Pax6启动子区CpG岛甲基化水平与MD-C、NC比较,差异无统计学意义。结论形觉剥夺性近视C57BL/6小鼠视网膜Pax6 mRNA表达明显下降,启动子区CpG岛的甲基化水平无明显变化,提示近视形成可能和Pax6的下降相关,但这一改变可能不是由视网膜Pax6启动子区CpG岛的甲基化变化引起。     

microRNA-125b对人视网膜母细胞瘤多药耐药性影响的实验研究

目的 探讨microRNA-125b（miR-125b）在人视网膜母细胞瘤细胞中多药耐药的作用及其机制。设计 实验研究。 研究对象 人视网膜母细胞瘤SO-RB50细胞。方法 用RT-PCR方法检测miR-125b视网膜母细胞瘤细胞株SO-RB50和耐药细胞株SO-Rb50/VCR中的表达变化;化学合成的miR-125b过表达（miR-125mimic 组）和抑制载体（miR-125inhibitor组）转染SO-Rb50细胞株,用MTT法和Annexin V-FITC法检测在药物长春新碱、依托泊苷和卡铂,依次作用上述转染细胞后,细胞增生力和细胞凋亡的变化;用蛋白印迹法检测miR-125b过表达和抑制表达后细胞株SO-RB50中 MAGE-A/P53蛋白的表达变化。主要指标 细胞存活率和细胞凋亡率。结果 SO-Rb50/VCR组与SO-RB50组相比,miR-125b的表达显著增高（P=0.002）;长春新碱、依托泊苷和卡铂依次作用于转染后的SO-RB50细胞株后,miR-125mimic组与miR-125inhibitor组相比,细胞存活率显著增高（P=0.000）,细胞凋亡率显著下降（P=0.000）,P53蛋白表达水平显著下降（P=0.001）,MAGE-A蛋白表达水平显著增高（P=0.004）。结论 在SO-RB50细胞中,下调miR-125b后提高肿瘤细胞对化疗药物敏感性,且miR-125b可能是通过MAGE-A/P53通路调控视网膜母细胞瘤多药耐药性。     

CIZ1基因通过调控MEK-ERK1-2信号通路影响视网膜母细胞瘤细胞增殖和凋亡的实验研究

目的探讨锌指蛋白(CIZ)1基因影响视网膜母细胞瘤(RB)细胞增殖和凋亡的机制。 方法RB组织芯片购自西安艾丽娜生物科技有限公司，人神经母细胞瘤细胞系Y79购自美国ATCC公司。应用免疫组化方法检测CIZ1基因在RB肿瘤组织和正常视网膜组织中的表达情况；应用荧光定量聚合酶链式反应(PCR)和Western blot方法检测CIZ1基因在RB细胞中信使核糖核酸(mRNA)和蛋白的表达水平。选取RB细胞系Y79细胞，采用数字表法随机分为对照组、干扰CIZ1基因组(shCIZ1)-1及shCIZ1-2等3组。采用不同的慢病毒分别感染阴性对照组和两组shCIZ1基因组细胞。应用荧光定量PCR及Western blot方法检测敲低效率；应用细胞增殖测量试剂盒(CCK8)方法检测细胞的生长、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)3-7的活性和细胞凋亡相关蛋白表达的情况；通过Western blot方法检测丝裂原活化蛋白激酶激酶(MEK)-细胞外调节蛋白激酶(ERK)1-2信号通路相关蛋白的表达变化。CIZ1的基因表达量、蛋白表达水平、RB细胞的增殖倍数、Caspase3-7、MEK、p-MEK、ERK及p-ERK蛋白的表达水平，采用单样本K-S拟合优度法进行正态性检验，符合正态分布者以均数±标准差进行描述。多组样本间不同组间均数的比较采用重复测量资料的方差分析，采用LSD检验进行两两比较。 结果与正常视网膜组织相比，CIZ1基因在RB肿瘤组织中的表达水平显著上调；在RB细胞中，CIZ1基因mRNA水平及蛋白水平均显著高于正常人视网膜色素上皮细胞(ARPE)，Y79细胞、人神经母细胞瘤细胞系(WERI-Rb)-1细胞中mRNA相对表达量分别为(0.061±0.001)、(0.041±0.001)，与ARPE19细胞中mRNA相对表达量(0.025±0.001)相比，差异均具有统计学意义(t＝41.58，18.68；P<0.05)；慢病毒干扰CIZ1基因的表达可以显著降低CIZ1的mRNA与蛋白表达水平，shCIZ1-1组和shCIZ1-2 CIZ1组mRNA的相对表达量分别为(0.015±0.008)和(0.008±0.003)，与对照组mRNA的相对表达量(0.032±0.003)相比，差异均具有统计学意义(t＝3.72，5.357；P<0.05)；敲低CIZ1基因可以显著抑制RB细胞的增殖，也可以抑制增殖相关基因即细胞周期蛋白(Cyclin)D1蛋白的表达，与对照组相比差异有统计学意义(t＝21.18，21.80；P<0.05)；同时还可以抑制增殖相关基因Cyclin E1蛋白的表达，与对照组相比差异有统计学意义(t＝17.26，16.41；P<0.05)。敲低CIZ1可以显著增强细胞凋亡相关蛋白Caspase3-7的活性，上调Caspase-3和Caspase-7蛋白的表达。Western blot检测敲低CIZ1基因对MEK-ERK1-2信号通路影响的结果显示，CIZ1下调可以显著抑制磷酸化的MEK的表达水平，与对照组相比差异具有统计学意义(t＝3.925，8.461；P<0.05)；CIZ1下调可抑制ERK1-2蛋白的磷酸化水平，与对照组相比差异具有统计学意义(t＝14.12，28.36；P<0.05)。 结论敲低CIZ1基因可以通过抑制MEK-ERK1-2信号通路抑制RB的生长。     

精子蛋白32/OY-TES-1在视网膜母细胞瘤中的表达

　　目的　观察精子蛋白（SP）32/OY-TES-1在视网膜母细胞瘤(RB)组织中的表达。方法　病理科收检并经病理学检查确诊的30例RB患儿的石蜡标本纳入研究。采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测15例RB组织、12例非肿瘤病变视网膜组织及22例眼部正常组织中SP32/OY-TES-1 mRNA的表达;免疫组织化学技术对30例RB组织和24例正常视网膜组织中SP32/OY-TES-1蛋白的表达进行检测,对比分析SP32/OY-TES-1 mRNA和蛋白表达与RB患儿年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤分化程度和临床分期的相互关系。结果　RB组织、非肿瘤病变视网膜组织、眼部正常组织SP32/OY-TES-1 mRNA的表达率分别为86.7%、16.7%和36.4%。不同性别（χ²=0.744）、年龄≤2岁和＞2岁（χ²=1.178）、临床分期（χ²=1.188）、肿瘤大小（χ²=0.216）、肿瘤分型（χ²=1.885）之间SP32/OY-TES-1基因阳性表达率比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。SP32/OY-TES-1蛋白在RB中的表达率为73.3%,在正常视网膜组织中则不表达。不同性别（χ²=1.000）、年龄≤2岁和＞2岁（χχ²=0.403）、不同肿瘤大小（χ²=2.274）、不同肿瘤分型（χ²=0.138）之间SP32/OY-TES-1蛋白阳性表达率比较,差异无统计学意义（P＞0.05）;不同临床分期（χ²=6.193）、视神经是否浸润（χ²=4.535）之间SP32/OY-TES-1蛋白阳性表达率比较,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论　SP32/OY-TES-1高表达于RB组织中;SP32/OY-TES-1蛋白在RB组织中的表达率与视神经浸润和临床分期存在密切的关系。      

RAS相关区域家族1A和死亡相关蛋白激酶基因启动子在视网膜母细胞瘤中的甲基化状态

目的 研究肿瘤抑制基因RAS相关区域家族1A(RASSFIA)和死亡相关蛋白激酶(DAPK)基因启动子在视网膜母细胞瘤(RB)组织和外周血的甲基化状态.方法 对RB石蜡组织切片进行实验研究,对RB患者和正常人进行病例对照研究,应用甲基化特异性聚合酶链式反应技术检测28例RB组织、9例RB患者外周血中RASSF1A和DAPK基因启动子的甲基化状态,分别收集年龄、性别相匹配的5例角膜捐赠者死亡后获取的正常视网膜、5例健康志愿者的血清作为对照,采用Fisher确切概率法比较两组间甲基化率的差异.结果 RB组织中RASSF1A基因启动子的甲基化率为60.7%(17/28),高于正常人视网膜组织0%(0/5)或瘤旁组织17.9%(5/28),差异有统计学意义(P<0.01),且单侧RB组织的甲基化率(72.7%)高于双侧(16.7%).另外在2例(2/9)RB患者外周血中检测到RASSF1A基因启动子的高甲基化.而DAPK基因启动子在RB组织及患者外周血中均未发生甲基化.结论 RASSF1A基因启动子高甲基化是RB中一种常见频发的表观遗传修饰.(中华眼科杂志,2009,45:631-635)     

视网膜母细胞瘤PAX6、Ki-67和MMP-9的表达及其与组织病理学的关系

目的 检测PAX6、Ki-67及MMP-9在视网膜母细胞瘤（RB）中的表达,探讨其与RB临床组织病理学特征之间的关系及临床意义。设计实验性研究。研究对象石蜡包埋RB组织40例,其中〈3岁组27例,≥3岁组13例。方法 采用免疫组织化学Elivision法检测PAX6、Ki-67及MMP-9在40例RB组织中的表达情况,分析该3种蛋白表达与患者性别、眼别、年龄、视神经受侵情况以及是否化疗等临床组织病理学特征的关系,并分析3种蛋白表达之间的相关性。主要指标RB组织中PAX6、Ki-67、MMP-9的表达及临床组织病理学特征。结果 40例RB组织中,PAX6、Ki-67及MMP-9的阳性表达率分别为52.5%、55.0%、57.5%。Ki-67在年龄大于3岁组的阳性表达率高于年龄小于3岁组（χ^2=6.825,P=0.016）,PAX6（χ^2=0.631,P=0.511）及MMP-9（χ^2=0.129,P=1.000）的表达与年龄无显著相关性。3种蛋白的表达均与性别及眼别无显著相关性。PAX6、Ki-67及MMP-9在球后视神经受侵袭组的阳性表达率均高于未受侵袭组（χ^2=14.401,P=0.017;χ^2=11.831,P=0.046;χ^2=13.961,P=0.038）。PAX6及Ki-67在未化疗组的阳性表达率均高于化疗组（χ^2=8.120,P=0.010;χ^2=6.465,P=0.025）。PAX6和Ki-67的表达呈正相关（r=0.347,P=0.028）。结论 PAX6的高表达促进了RB细胞的增生;PAX6、Ki-67和MMP-9的高表达与RB的侵袭有一定的相关性;化疗对RB中PAX6和Ki-67的表达有一定的抑制作用,在一定程度上可以降低RB侵袭转移的风险。     

视网膜母细胞瘤组织中热休克蛋白与Survivin表达关系及其对肿瘤细胞增生活性的影响

目的 探讨视网膜母细胞瘤（RB）组织中热休克蛋白（HSP）70、90的表达及其与凋亡调控因子Survivin表达关系,以及两者共同表达对RB细胞增生活性的影响。方法 采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶免疫组织化学法检测43例RB及6例正常视网膜石蜡组织切片HSP70、HSP90、Survivin和Ki-67蛋白表达水平,以Ki-67蛋白标记指数作为肿瘤细胞增生活性标志,结合病理学特征分析HSPs-Survivin协同表达与肿瘤细胞增生活性关系。结果 43例RB组织中HSP70阳性表达28例,占65.12%,HSP90阳性表达37例,占86.05%,Survivin阳性表达27例,占62.79%;6例正常视网膜组织中均无HSP70、HSP90及Survivin表达;HSP90阳性表达组中Survivin阳性表达率明显高于阴性表达组（P＜0.05）;HSP90阳性表达组及Survivin阳性表达组Ki-67蛋白标记指数均较表达阴性组明显增高（P＜0.05）,HSP90-Survivin共同阳性表达组Ki-67蛋白标记指数较HSP90-Survivin共同表达阴性或表达不一致组明显增高（P＜0.05）。但HSP70表达与Survivin相关性无统计学意义（P＞0.05）,且对Ki-67蛋白标记指数无明显影响（P＞0.05）;HSPs、Survivin表达及Ki-67蛋白标记指数与RB组织学分型无关（P均＞0.05）。结论 RB组织中HSP90与Survivin表达存在明显相关性,HSP90-Survivin共同阳性表达可能在RB细胞增生机制中具有重要意义。     

SO-Rb 50克隆株生物学及分子生物学特性动态观察

目的 研究SO-Rb50细胞系三个克隆株MC 2、MC 3、MC 4第11代和MC 3 -138代染色体畸变的差异及Rb-1基因突变的情况。 方法 对SO-Rb50建立的三个克隆细胞株第11代进行G-显带核型分析；用常规方法抽提三个细胞株的第11代和MC 138代基因组DNA，用PCR联合SSCP法，逐个外显子筛查其Rb1基因编码区及启动子。 结果 1. 三个克隆株细胞的染色体数目和结构均有异常，出现不同类型的染色体畸变，13号染色体畸变仅见于个别核型且在三个克隆株中畸变情况不同。发现5个标记染色体M1，M2，M3，M4和M5，其中标记染色体M1出现频率最高，是由1号染色体长臂部分重复构成［t(1;１)qter-p35∷124-ter］。M4和M5为2号染色体的变化，是在该细胞系染色体变化动态研究中首次发现。2. 外显子24的SSCP电泳结果显示，MC4-11代细胞第2条单链泳动率比正常对照标本增快，单链数相同；MC4-138代细胞比对照多一条链。 结论 SO-Rb50细胞系至少存在两个不同克隆株，同一克隆株不同代数的细胞生物学特性有动态变化。13号染色体的畸变不是RB发生的唯一原因；1号染色体的变化与本细胞系的永生关系密切，其与RB发生、发展的关系值得深入研究。 (中华眼底病杂志, 1999, 15: 146-148)     

Impaired expression and promotor hypermethylation of O6-methylguanine-DNA methyltransferase in retinoblastoma tissues

PURPOSE: To investigate the role of epigenetic changes in the promoter region of tumor-suppressor genes in the retinoblastoma genome and to study the disruption of expression of O6-methylguanine-DNA Methyltransferase (MGMT) due to aberrant methylation and its association with retinoblastoma. METHODS: A series of 23 retinoblastoma tissue specimens and 2 retinoblastoma cell lines (Y79 and WERI-Rb1) were subjected to methylation-specific PCR (MSP) analysis of hypermethylated genes identified in human cancers, including p14(ARF), p15(INK4b), p16(INK4a), VHL, and MGMT. Further, the expression of MGMT was studied by immunohistochemistry and, when fresh tissue was available, by Western blot analysis and RT-PCR. RESULTS: Aberrant methylation of at least one MGMT locus was detected in 8 of the 23 tumors (35%), all of which (100%) had impaired or absent expression of MGMT. The remaining 15 tumor specimens were nonmethylated, and, among them, 7 (43%) showed defective expression. No methylation of tumor DNA was found on the p14(ARF), p15(INK4b), p16(INK4a), and VHL genes. Hypermethylation in the MGMT promoter was found to be prominently present in retinoblastoma with poor tissue differentiation, and was more frequently detected among patients with bilateral disease. Production of MGMT was consistent with expression of mRNA. No methylation of MGMT promoter was detected in the two retinoblastoma cell lines (Y79, WERI-Rb1). CONCLUSIONS: The data show a clear association between impaired production of MGMT and hypermethylation of the MGMT promoter, which appeared to relate to early onset and poor differentiation, suggesting that epigenetic silencing of MGMT by methylation of the promoter and reduced expression of MGMT may play an important role in the development and progression of retinoblastoma.     

改良Wies法治疗退行性下睑内翻的一年疗效

目的 探讨改良Wies法治疗退行性下睑内翻的疗效。设计 回顾性病例系列。研究对象 北京同仁医院眼科中心27例（31眼）退行性下睑内翻患者。方法 27例（31眼）均采用改良Wies法（横行切透下睑,将下睑缩肌前徙固定于皮肤及睑板）。观察术前术后患者眼睑形态、睑缘位置等,随访（14.6±3.5）个月（12~17个月）。主要指标 眼睑形态、睑缘位置、有无溢泪。结果 术前1例复发患者,在术后14个月,双眼再次内翻复发。其余26例患者,在随访期间均未见过矫或复发,睑缘位置形态好,无不适主诉。结论 改良Wies法简单快速易重复效果好,对于治疗退行性下睑内翻建议优先考虑。     

Beta-lapachone inhibits proliferation and induces apoptosis in retinoblastoma cell lines

AIMS: To investigate the cytotoxicity of beta-lapachone, a potent agent that may selectively target tumour cells, in retinoblastoma (RB) cell lines.METHODS: Growth inhibitory effects of beta-lapachone were evaluated in Y79, WERI-RB1, and RBM human retinoblastoma cell lines. Pro-apoptotic effects of beta-lapachone were evaluated in Y79 cells by detection of caspase 3/7 activity, by enzyme-linked immunosorbent assay for nucleosome fragments, and by cellular morphological analysis.RESULTS: Beta-lapachone induced significant dose-dependent growth inhibitory effects in all three retinoblastoma cell lines. The 50% growth inhibitory concentration (IC(50)) of this agent was 1.9 microM in Y79 cells, 1.3 microM in WERI-RB1 cells, and 0.9 microM in RBM cells. Beta-lapachone also induced proapoptotic effects in RB cells. Treatment of Y79 cells with 1.9 microM beta-lapachone (IC(50)) resulted in a peak, fourfold induction of caspase 3/7 activity at 72 h post-treatment; a peak, 5.6-fold increase in nucleosome fragments at 96 h post-treatment; and a peak, 1.7-fold increase in the frequency of apoptotic cells at 48 h post-treatment, relative to vehicle-treated controls.CONCLUSION: Beta-lapachone induced potent cytotoxic effects in RB cell lines at low micromolar concentrations, suggesting this agent could be useful in the clinical management of RB.     

视网膜母细胞瘤细胞株SO-Rb50及SO-Rb70对六种抗癌药物敏感性测定

目的 利用体外培养的视网膜母细胞瘤（retinoblastoma,Rb）细胞株筛选对Rb敏感的化疗药物。方法 采用噻唑蓝（3,-4,5 Dimethyliazol tetrazolium bromide,MTT）法对SO-Rb50和SO-Rb70瘤细胞株进行更生霉素、长春新碱、鬼臼噻吩甙、柔红霉素、顺氯氧铂、平阳霉素6种药物体外敏感实验．结果 6种药物作用于SO-Rb5048小时50％抑制浓度（50％ inhibitory concenrtation,IC50）值（μg／ml）分别为0.0004、0.0016、0.0389、0.047、0.29、0.44．72小时分别为0.00025、0.00081、0.0151、0.0192、0.097、0.11,作用于SO-R5048小时IC50值分别为0.00065、0.00149、0.0282、0.043、0.37、0.215,72小时分别为0.00042、0.00082、0.0146、0.0176、0.035、0.084．结论 SO-Rb50和SO-RS70瘤细胞对于上述6种化疗药物均敏感,根据其IC50值．药物敏感性顺序依次为更生霉素、长春新碱、鬼臼噻吩甙、柔红霉素、顺氯氨铂、平阳霉素。     

miR-373在视网膜母细胞瘤Y79细胞中的表达及其抑制侵袭及迁移能力的实验研究

目的　观察miR-373在视网膜母细胞瘤（retinoblastoma,RB）细胞中的表达及其对RB Y79细胞侵袭及迁移能力的影响和相关机制。方法　采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测miR-373在RB细胞系RB Y79、SO-RB50和人正常视网膜血管内皮细胞系ACBRI-181中的表达水平,并应用脂质体转染法将miR-373 抑制物（miR-373抑制物组）和阴性对照（NC组）分别转染至Y79细胞,Transwell实验检测Y79细胞侵袭和迁移能力的变化,Western blot检测Y79细胞中上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）相关标志物E-Cadherin、Vimentin和N-Cadherin蛋白的表达变化。结果　qRT-PCR 结果显示,RB细胞系Y79、SO-RB50中miR-373的相对表达量分别为6.21±0.34、5.40±0.38,明显高于人正常视网膜血管内皮细胞系ACBRI-181中miR-373的相对表达量（1.02±0.04）（均为P＜0.05）。Transwell实验显示,miR-373抑制物组迁移细胞数（74±13）个,明显低于NC组（180±17）个（P＜0.05）,miR-373抑制物组侵袭细胞数（51±9）个明显低于NC组（113±14）个（P＜0.05）。Western blot结果显示,miR-373抑制物组E-Cadherin蛋白的表达（0.40±0.08）明显高于NC组（0.20±0.06）（P＜0.05）,Vimentin蛋白的表达（0.17±0.06）也明显低于NC组（0.51±0.10）（P＜0.05）,N-Cadherin蛋白的表达（0.12±0.06）也明显低于NC组（0.33±0.08）（P＜0.05）。结论　miR-373在RB细胞中表达异常增高,降低miR-373的表达能够通过调控EMT抑制RB Y79细胞的侵袭和迁移能力,为RB的靶向治疗提供了新的潜在靶点。     

小干扰RNA技术下调视网膜母细胞瘤细胞株SO-Rb50中Survivin基因表达的研究

目的 应用RNA干扰(RNAi)技术沉默视网膜母细胞瘤细胞株SO-Rb50中凋亡抑制因子Survivin的表达,观察其干扰效果及对细胞的影响.方法 实验研究.体外化学法合成针对人Survivin基因的特异性小干扰RNA(siRNA)和对Survivin基因无沉默效果的阴性对照siRNA,利用转染试剂分别将siRNA转入SO-Rb50细胞株,通过半定量RT-PCR和Western blot检测其对SO-Rb50细胞中Survivin基因和蛋白表达的抑制作用,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测不同浓度siRNA对细胞增殖抑制率,流式细胞仪检测转染后细胞凋亡率和细胞周期改变,荧光显微镜下观察细胞凋亡形态.对多组间数据比较采用单因素方差分析,处理组与对照组比较采用Dunnett-t检验.结果 Survivin特异性siRNA转染细胞24 h后Survivin mRNA和蛋白表达水平明显下调,对照组中其表达则无明显改变.MTT法结果显示Survivin特异性siRNA浓度为35、70、100 nmol/L时均对SO-Rb50细胞增殖具有抑制作用(P＜0.05),且具有剂茸依赖性.流式细胞仪检测发现Survivin特异性siRNA组出现凋亡亚二倍体峰,细胞被阻滞于G0/G1期,较对照组增加了8.11%,G2/M期细胞比例减少了5.75%,S期细胞仅减少了2.26%.荧光显微镜下可见部分细胞出现染色质浓缩和凋亡小体等典型的凋亡形态学变化.结论 针对Survivin的RNA干扰技术可有效地下调SO-Rb50细胞中Survivin基因表达,进而抑制SO-Rb50细胞增殖和诱导其凋亡,为视网膜母细胞瘤的基因治疗提供了重要的途径.     

The effect of a selective cyclooxygenase-2 (COX-2) inhibitor on the proliferation rate of retinoblastoma cell lines

PURPOSE: To examine the effect of nepafenac, a selective cyclooxygenase-2 (COX-2) inhibitor, on the proliferation rate of two human retinoblastoma (Rb)cell lines. METHODS: Two human Rb cell lines (WERI-RB and Y79) were cultured. COX-2 expression in these cell lines was verified by immunocytochemical analysis of cytospin sections and Western blotting. An MTT-based proliferation assay was used to compare Rb cell growth with and without amfenac, the active metabolite of nepafenac. The averaged results per condition were recorded. The Student's t-test was used to compare results from the cells cultured with and without amfenac. RESULT: The Y79 cell line showed a higher proliferative rate than the WERI-RB cell line. Both cell lines were negative for COX-2 expression by immunocytochemical analysis; however, both cell lines were positive for COX-2 expression by Western blot. When amfenac was added to both of the cell lines, a statistically significant reduction in proliferation was observed in both cell lines. The two Rb cell lines were positive for COX-2 only in the Western blot, indicating that they probably express low levels of COX-2, which was undetectable by immunocytochemical analysis. CONCLUSION: The selective, anti-COX-2 molecule amfenac inhibited proliferation of both tested Rb cell lines. Further trials should be undertaken to study the effect of selective COX-2 inhibitors on Rb.