人瘦素基因克隆与序列测定

【目的】构建人瘦素基因cDNA克隆 ,并进行序列分析。【方法】用逆转录聚合酶链反应扩增人瘦素基因cDNA ,获得片段 (6 40bp)连接至 pUC19载体 ,并转化大肠杆菌DH5α。以末端终止法进行序列测定。【结果】所克隆的人瘦素cDNA含全长的人瘦素基因编码区 ,仅 2 87位的腺苷酸被鸟苷酸代替 ,导致 96位编码谷氨酰胺的密码子CAA改变为编码精氨酸的CGA ,其意义尚待阐明。【结论】以逆转录聚合酶链反应方法成功地构建了人瘦素基因cDNA克隆。     

丙型肝炎病毒非结构基因5b区新发现的一个移码突变

目的分析丙型肝炎病毒非结构基因５ｂ区部分核苷酸序列特征。方法以逆转录巢式聚合酶链反应获得位于７９１８位至８２９３位间的ｃＤＮＡ片段，克隆后测定重组子序列，计算机分析其特征。结论，在ＨＣＶＮＳ５ｂ区发现一个新的移码突变。     

人WAF1基因表达质粒的构建

目的：克隆人ＷＡＦ１基因,构建成ＷＡＦ１－ｐｃＤＮＡ３真核表达质粒。方法：采用逆转录聚合酶链反应从Ｈｅｌａ细胞中扩增人ＷＡＦ１基因,并克隆到ｐｃＤＮＡ３真核克隆载体中。结果：从Ｈｅｌａ细胞扩增的人ＷＡＦ１基因克隆至真核克隆表达载体ｐｃＤＮＡ３中,经ＤＮＡ直接测序,获得了ＷＡＦ１－ｐｃＤＮＡ３重组质粒。结论：成功地构建人ＷＡＦ１表达质粒ＷＡＦ１－ｐｃＤＮＡ３,为进一步研究ＷＡＦ１基因表达及生物学效应     

具有野生起点的丙型肝炎病毒RNA依赖的RNA聚合酶表达质粒的构建

目的 构建具有野生起点的丙型肝炎病毒ＲＮＡ依赖的ＲＮＡ聚合酶表达载体。方法 根据疏水性分析选定待表达的丙型肝炎病毒非结构基因５ｂ区大部分基因。以聚合酶链反应扩增泛素基因,逆转录－聚合酶链反应扩增丙型肝炎病毒ＲＮＡ依赖的ＲＮＡ聚合酶基因。限制性酶切长度多态性分析重组克隆,并以ＤＮＡ序列分析方法最终确认。     

大鼠肝再生增强因子编码区的cDNA克隆和原核表达

目的：克隆大鼠肝再生增强因子（ＡＬＲ）编码区ｃＤＮＡ并进行原核表达。方法：提取新生大鼠肝脏总ＲＮＡ为模板，以寡聚ｄＴ为引物逆转录合成第一链ｃＤＮＡ，再以我们设计的ＰＣＲ引物进行ＰＣＲ扩增获取大鼠肝再生增强因子编码区双链ｃＤＮＡ；以基因重组技术构建大鼠ＡＬＲ的原核表达质粒，然后将重组表达质粒转化至大肠杆菌内以ＩＰＴＧ诱导表达。结果：成功克隆出大鼠肝再生增强因子编码区ｃＤＮＡ，其序列与以前报道的完全一致；构建的大鼠ＡＬＲ原核表达重组质粒在大肠杆菌内高效表达ｒＡＬＲ融合蛋白，其表达量占菌体蛋白３０％。结论：大鼠肝再生增强因子编码区ｃＤＮＡ的克隆及其在大肠杆菌的高效表达为ＡＬＲ的深入研究奠定了基础。     

人I型基质金属蛋白酶基因真核表达重组质粒的构建

目的：构建人I型基质金属蛋白酶基因（MMP1）真核表达重组质粒，并进行序列分析。方法：用逆转录聚合酶链反应扩增人I型基质金属胶原酶cDNA，获得目的基因片段（1407bp）连接至pcDNA3载体，并转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆并鉴定，并对片断全长进行DNA序列测定。结果：所克隆人I型基质金属胶原酶cDNA，含全长MMP1编码区，与GeneBank公布序列比较，仅1318位的胞苷酸C突变为腺苷酸A。并成功构建了含有MMP1的真核表达质粒pcDNA3－MMPI。结论：以逆转录聚合酶链反应方法成功构建了人I型基质金属胶原酶cDNA克隆，并获得该基因真核表达质粒pcDNA3-MMP1，从而为下一步抗肝纤维化基因治疗研究提供物质基础。     

人表皮生长因子cDNA序列分析及其在大肠杆菌中的表达

应用逆转录聚合酶链反应从人脐静内皮细胞ＲＮＡ中扩增了表皮生长因子的ｃＤＮＡ，采用基因重组技术克隆到ｐＧＥＭ－３ｚｆ载体中，经全自动荧光测序仪测定了其序列。在ＰＣＲ扩增引物上分别加有起始密码子和终止密码子，以利于原核表达。经亚克隆，ＥＧＦｃＤＮＡ克隆到表达载体ｐＢＶ２２０的Ｅｃｏ ＲＩ，ＳｍａⅠ位点上，在大肠杆菌ＤＨ５α中进行表达。     

单克隆抗体可变区DNA序列的测定

采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）方法获得单克隆抗体重、轻链的可变区基因，并进行了ＰＣＲ产物直接ＤＮＡ序列测定，或将扩增产物分别插入ｐＵＣ１８质粒，筛选出阳性克隆，用末端终止法进行ＤＮＡ序列测定。得到大约３５０ｂｐ可变区基因，符合Ｉｇ可变区基因编码。直接法简便可靠，节省时间和试剂；而克隆法带有酶切位点，有利于基因工程抗体的构建和表达。     

人绒毛膜促性腺激素β亚基cDNA的克隆初步报告

用新鲜的人绒毛膜组织，抽提组织总ＲＮＡ并通过逆转录反应合成ｃＤＮＡ第一链。利用人工合成的一对寡核苷酸引物，采用ＰＣＲ技术特异性地扩增ｈＣＧ－β－ｃＤＮＡ。琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增片段大小为５００ｂｐ，同预计的片段长度相符。将此片段利用Ｔ－Ａ载体克隆至ＰＣＲⅡ质粒上并进行全序列分析，结果显示克隆片段包含ｈＣＧ－βｃＤＮＡ５’端和３’端非编码区及完整的编码区。     

人绒毛膜促性腺激素β亚基cDNA的克隆初步报告

用新鲜的人绒毛膜组织，抽提组织总ＲＮＡ并通过逆转录反应合成ｃＤＮＡ第一链。利用人工合成的一对寡核苷酸引物，采用ＰＣＲ技术特异性地扩增ｈＣＧ－β ｃＤＮＡ。琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增片段大小为５００ｂｐ，同预计的片段长度相符。将此片段利用Ｔ－Ａ载体克隆至ＰＣＲⅡ质粒上并进行全序列分析，结果显示克隆片段包含ｈＣＧ－β ｃＤＮＡ５＇端和３＇端非编码区及完整的编码区。     

人类白细胞抗原—1类抗原B7基因cDNA克隆

采用逆转录ＰＣＲ（聚合酶链反应）技术，从人类白细胞抗原－Ｂ７（ＨＬＡ－Ｂ７）表型阳性的人外周血淋巴细胞总ＲＮＡ中克隆了ＨＬＡ－Ｂ７的ｃＤＮＡ（ｐＵＣ－Ｂ７）经地扩增和酶切片段长度多态性分析，初步判断其序列与文献报道的一致，采用平端连接针ＨＬＡ－ＢｃＤＮＡ片段插入一到ｐＵＣ１９的ＳｍａＩ位点上，保留了大部分酶切位点，为进一步克隆到表达载体上提供了极大的方便。     

抗CD4单克隆抗体可变区基因克隆及测序

目的：获取抗ＣＤ４单克隆抗体（ＭｃＡｂ）可变区基因，为构建抗ＣＤ４嵌合抗体打下基础。方法 从分泌抗人ＣＤ４ ＭｃＡｂ的杂交瘤细胞系中提取总ＲＮＡ，用家族特异性引物进行逆转录多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ），分别扩增出重链可变区（ＶＨ）基因及轻链可变区（ＶＬ）基因。将ＰＣＲ产物克隆至ｐＧＥＭ－Ｔ载体，然后转化ＪＭ１０９细菌。并用全自动 ＤＮＡ序列分析仪对ＶＨ及ＶＬ基因序列进行测定。结果：ＶＨ基因为３５１     

人Ⅰ型基质金属蛋白酶基因真核表达重组质粒的构建

[目的]构建人Ⅰ型基质金属蛋白酶基因(MMP1)真核表达重组质粒,并进行序列分析.[方法]用逆转录聚合酶链反应扩增人Ⅰ型基质金属胶原酶cDNA,获得目的基因片段(1407bp)连接至pcDNA3载体,并转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆并鉴定,并对片断全长进行DNA序列测定.[结果]所克隆人Ⅰ型基质金属胶原酶cDNA,含全长MMP1编码区,与GeneBank公布序列比较,仅1318位的胞苷酸C突变为腺苷酸A.并成功构建了含有MMP1的真核表达质粒pcDNA3-MMP1.[结论]以逆转录聚合酶链反应方法成功构建了人Ⅰ型基质金属胶原酶cDNA克隆,并获得该基因真核表达质粒pcDNA3-MMP1,从而为下一步抗肝纤维化基因治疗研究提供物质基础.     

人分泌型肿瘤坏死因子相关激活诱导因子基因的克隆及测序

目的 克隆人分泌型肿瘤坏殛因子相关激活诱导因子（ｓＴＲＡＮＣＥ）的编码区ｃＤＮＡ片段。方法 从人淋巴结组织提取总ＲＮＡ,利用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增人ｓＴＲＡＮＣＥ基因编码区序列,将其克隆至ｐＭＤ１８－Ｔ载体中,并行序列测定。结果 克隆获得的７４４ｂｐ片段与文献报道的人ｓＴＲＡＮＣＥ基因编码区ｃＤＮＡ序列一致。结论 本研究为进一步研究ｓＴＲＡＮＣＥ的生物学性能和用于肿瘤生物治疗的可能性打下了基础。     

人嗜酸性细胞趋化素基因cDNA的分离及序列分析

目的：分离编码人嗜酸性细胞趋化素的基因ｃＤＮＡ,并将它克隆至质粒ＰＵＣ１８中进行核苷酸序列分析。方法：采用ＴＮＦα刺激人肺上皮细胞提取总ＲＮＡ,利用ＲＴ－ＣＰＲ方法获得了ｈＥｏｔ的ＣＤＮＡ,并将其定向插入ＰＵＣ１８载体中进行核苷酸序列。结果：ＤＮＡ序列分析表明分离的ｈＥｏｔｃＤＮＡ的序列与文献报道的完全一致。结论：本研究获得了序列正确的ｈＥｏｔ基因ｃＤＮＡ,为下一步的研究打一了基础。     

人GDNF基因的克隆

目的：克隆可表达人胶质细胞源性神经营养因子的基因。方法：从脑胶质细胞瘤患者术后的脑瘤组织中提取总ＲＮＡ，以ＲＴＰＣＲ方法扩增出了一段约５５８ｂｐ的ｃＤＮＡ片段，将这一片段克隆于ｐＵＣ１８载体中，进行全序列分析。结果：证实该研究所克隆的ｃＤＮＡ是编码正确的人ＧＤＮＦ基因。与发表于ＧｅｎｅＢａｎｋ上的序列相比，发现该研究克隆的基因有一段７８ｂｐ的核苷酸序列缺失，但不影响密码子的阅读框。结论：克隆到了编码正确的人ＧＤＮＦ的ｃＤＮＡ全序列，对帕金森病基因治疗的基础研究及临床应用具有重要意义。     

人GDNF基因的克隆

克隆可表达人胶质细胞源性神经营养因子的基因。方法；从脑胶质细胞瘤患术后的脑瘤组织中提取总ＲＮＡ，以ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增出了一般约５５８ｂｐ的ｃＤＮＡ片段，将这一片段克隆于ｐＵＣ１８载体中，进行全序列分析。结果：证实该研究所克隆的ｃＤＮＡ是编码正确的ＧＤＮＦ基因。     

高亲和力IgE受体α链cDNA的克隆及序列测定

目的：为获得编码高亲和力ＩｇＥ受体（ＦｃεＲ１）α链的ｃＤＮＡ序列。方法：从正常人外周血中富集嗜碱性粒细胞,提总ＲＮＡ进行ＲＴ－ＰＣＲ,分子克隆,用自动测序及放射自显影测序。结果：分离并鉴定了该ｃＤＮＡ重组子,在１５９密码子及１８５密码子分别发现了ＣＡＣ→ＣＧＣ与ＴＡＴ→ＣＡＴ置换。结论：建立了一个编码ＦｃεＲ１膜外区α链的ｃＤＮＡ重组子克隆,它不含引导肽序列,可能是一个来自中国人的该基因的变异体     

mRNA差异显示技术在紫杉醇诱导的表达基因克隆中的应用

作者应用ｍＲＮＡ差异显著，ＤＮＡ序列分析和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交技术，对紫杉醇处理人乳癌细胞诱导的表达基因进行ｃＤＮＡ克隆研究，１２个克隆有明确的ｍＲＮＡ水平表达改变，其中６个ｃＤＮＡ克隆核苷酸序列与已知的ｃＤＮＡ序列有较高的同源性，其余６个尚无同源性基因。克隆重Ｃ３Ｐ３与人腺苷基蛋氨酸合成酶基因序列同源性达９９％，紫杉醇诱导该酶基因转录活动和基因产物活性增高，提示ｍＲＮＡ差异显著技术筛选ｍＲＮＡ水     

人降钙素基因的克隆及其序列分析

目的：克隆人降钙素基因（ｈＣＴ）并经序列分析予以确证。方法：首先自新鲜全血中用含ＴｒｉｔｏｎＸ－１００的缓冲液提取基因组ＤＮＡ，经酒精沉淀和洗涤后，作为模板，加入上下游引物，应用聚合酶链反应直接扩增出ｈＣＴ的编码序列。并将此段ＤＮＡ插入克隆载体ｐＵＣ１８的ＥｃｏＲＩ和ＳｍａＩ位点之间。最后用ＰＣＲ－双脱氧末端终止法进行序列分析。结果：成功地克隆了ｈＣＴ，证实所得ｈＣＴ基因克隆含编码人降钙素３２个氨基酸的全长ＤＮＡ序列９６ｂｐ。结论：已获得人降钙素基因克隆，为后续研究打下基础