不同方法诱导成人骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的比较

背景: 骨髓间充质干细胞可以在体外通过多种诱导剂诱导分化为神经元样细胞,不同诱导剂的细胞分化率、细胞活力以及Nestin染色阳性细胞率不同.目的: 对比多种诱导剂诱导骨髓间充质干细胞分化神经元样细胞结果,探寻一种较好的诱导剂.方法: 取健康成人骨髓于无菌层流室中,加入淋巴细胞分离液离心取白膜,将细胞置于含碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、DMEM、体积分数为10%胎牛血清的培养瓶中,37℃体积分数为5%CO2培养箱中培养,传至第3代分为β-巯基乙醇+二甲基亚砜组,脑源性神经生长因子+维甲酸组,胶质细胞源性神经营养因子+维甲酸组和碱性成纤维细胞生长因子组分别加入诱导剂,观察细胞型态变化,细胞活力测定,免疫组织化学检测神经细胞标志物.结果与结论: 锥虫蓝染色比较各组细胞活力,胶质细胞源性神经营养因子+维甲酸组细胞活力最高(P<0.05),β-巯基乙醇+二甲基亚砜组活力最低(P<0.05),脑源性神经生长因子+维甲酸组与碱性成纤维细胞生长因子组细胞活力差别无显著性意义(P>0.05).神经细胞标志物表达,胶质细胞源性神经营养因子+维甲酸组阳性率高于其余3组(P<0.05).结果提示,成人骨髓间充质干细胞可以诱导分化为神经元样细胞,胶质细胞源性神经营养因子+维甲酸组细胞活力高,神经标志物表达阳性率高(P<0.05).     

细胞密度与骨髓间充质干细胞向神经元样细胞的分化

背景:细胞种植密度是影响干细胞分化的因素之一,对于细胞种植密度在骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化过程中的作用尚缺乏深入研究.目的:观察细胞种植密度对骨髓间充质干细胞诱导向神经元样细胞分化的影响.方法:采用贴壁培养法分离大鼠骨髓间充质干细胞,传至第4代后将其按2×102,2×103,4×103,8×103,2×104,4×104/cm2种植于六孔板,每组均加入碱性成纤维细胞生长因子+表皮生长因子+维甲酸诱导向神经元样细胞分化,并通过免疫组织化学染色鉴定,计算每组细胞出现神经元样细胞的比例,比较各组的分化率.结果与结论:各组骨髓间充质干细胞加入诱导剂后均出现神经元样细胞,Nestin、NSE、GFAP细胞化学染色呈阳性.不同种植密度组出现神经元样细胞比例不同,以8×103/cm2组神经元样细胞比例最高,且神经元样存活时间最长,达7 d.结果说明骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化与细胞接种密度有关,过高或过低细胞密度均不利分化.     

碱性成纤维细胞生长因子预诱导后加入丹参酮ⅡA体外定向培养骨髓间充质干细胞向神经元样细胞的分化

背景：采用中药作为诱导剂对骨髓间充质干细胞向神经元样细胞定向诱导分化是否会有效果呢？目的：验证碱性成纤维细胞生长因子预诱导后加入中药丹参酮ⅡA体外诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的效应。方法：采用Percoll分离液密度梯度离心法获取骨髓间充质干细胞,取第3代细胞利用碱性成纤维细胞生长因子联合丹参酮ⅡA诱导其向神经元样细胞分化,全反式维甲酸无血清培养基诱导液及不进行诱导的细胞做为对照。结果与结论：①骨髓间充质干细胞能稳定表达间质细胞特异性的标记物CD44,表达阳性率为（91.00±1.58）%,但不表达CD34、CD45,流式细胞学检测其纯度高达95.5%。②诱导分化后经扫描电镜检测可观察到典型的神经元样细胞结构;免疫组织化学检测细胞表达神经元特导性烯醇化酶,神经元特导性烯醇化酶阳性率为（75.60±2.31）%,Nestin呈一过性表达增加后随着诱导时间延长逐渐减低至阴性,不表达神经胶质纤维酸性蛋白。说明经碱性成纤维细胞生长因子预诱导后加入丹参酮ⅡA能高效地定向诱导神经元样细胞的分化。     

全反式维甲酸诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化后对T细胞增殖的抑制

背景:研究表明骨髓间充质干细胞能抑制T淋巴细胞的增殖活化,发挥负性免疫调节作用.目的:利用全反式维甲酸体外定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化,并探讨分化细胞对T细胞增殖的作用.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-03在广东医学院完成.材料:4周龄雄性SD大鼠2只,由广东医学院动物中心提供.新鲜健康人血由广东医学院检验科提供.方法:通过贴壁法分离大鼠骨髓间充质干细胞,体外传代扩增.取传至5代的骨髓间充质干细胞,加入含0.3 mg/L全反式维甲酸、体积分数为10%胎牛血清的LG-DMEM液进行预诱导,24 h后吸去预诱导液,加入含0.6 mg/L全反式维甲酸的LG-DMEM液向神经元样细胞诱导分化.取新鲜健康人血制备反应细胞,大鼠骨髓间充质干细胞作为刺激细胞,进行单向混合淋巴细胞反应实验,设立4组:对照组,单纯反应细胞100 μL,细胞浓度1×109L-1;实验1组:1×104神经元样细胞+100 μL反应细胞:实验2组:1×105神经元样细胞+100 μL反应细胞:实验3组:1×106神经元样细胞+100 μL反应细胞.主要观察指标:诱导分化后细胞形态变化及神经细胞鉴定,单向混合淋巴细胞反应结果.结果:加入诱导液50 min后,光镜下骨髓间充质干细胞呈典型的核周体形态,3 h后大多数细胞转变为双极或多极神经元细胞样形态,出现胞体和突起.免疫细胞化学染色结果显示,大部分细胞呈神经元特异性烯醇化酶及巢蛋白阳性表达,而胶质纤维酸性蛋白呈阴性表达.与对照组比较,各实验组放射性核素每分钟闪烁数值均明显减少(P<0.05),且各实验组间比较差异亦有显著性意义(P<0.05),随着加入细胞数量的增多,抑制作用越明显.结论:全反式维甲酸可在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞,分化后的神经元样细胞能够抑制人淋巴细胞增殖,并呈剂量依赖性增加.     

人骨髓间充质干细胞的免疫调节作用及向神经元样细胞诱导分化

背景:骨髓间充质干细胞作为具有多向分化潜能的干细胞,属于未分化的前体干细胞,其表型分化尚不成熟,因此在同种异体移植后无排斥反应或反应较弱.但是在体外条件下通过化学和生物诱导物使骨髓间充质干细胞转化为神经元,影响骨髓间充质干细胞向神经细胞、胶质细胞系统定向分化的因素比较复杂.目的:观察人骨髓间充质干细胞的免疫调节作用,及向神经元样细胞诱导分化的能力.设计、时间及地点:对比观察,于2008-01/2009-03在无锡市第三人民医院细胞室完成.材料:骨髓来源于人髋关节手术时的松质骨碎片或髂骨游离移植.方法:首先分离和培养骨髓间充质干细胞,建立双向混合淋巴细胞反应体系,在双向混合淋巴细胞反应中,将来自2个志愿者的外周血单个核细胞(各1×10~5/孔)等比例加入96孔板中,根据不同效靶比E/T ratios(骨髓间充质干细胞/外周血单个核细胞)加入丝裂霉紊处理过的骨髓间充质干细胞.在骨髓间充质干细胞诱导分化为神经元样细胞实验中分别选择两种诱导培养基,方法1诱导:DMEM+体积分数为10%胎牛血清+1 μmol/L全反式维甲酸+20 μg/L 碱性成纤维细胞生长因子+20 μg/L表皮生长因子;方法2诱导:DMEM+2%二甲基亚砜+100 μmol/L 丁羟茴醚.主要观察指标:~3H掺入法测定淋巴细胞增殖率,观察骨髓间充质干细胞对淋巴细胞增殖的影响;通过条件培养基定向诱导,免疫荧光和免疫组织化学染色观察其分化为神经细胞的能力.结果:①骨髓间充质干细胞与混合淋巴细胞反应体系共同培养抑制了淋巴细胞增殖,其增殖抑制率与加入骨髓间充质干细胞的数量呈正比.②方法1诱导2 h后,光镜下可见骨髓间充质干细胞的细胞质向核收缩,呈典型核周体形态.3～5 h后多数细胞能形成神经元样细胞形态,但细胞数目无明显增加.3 d后大多数细胞转变为双极或多极神经元细胞样形态,部分细胞之间拉成网状.染色可见60%～70%神经元特异性烯醇化酶、45%～50%胶质纤维酸性蛋白阳性,巢蛋白阳性细胞下降为3.4%.方法2诱导2 h即可见细胞体积变小,形成双极或多极的细胞体,可持续诱导48 h,后大部分细胞浮起死亡.染色可见40%～50%神经元特异性烯醇化酶,35%～40%胶质纤维酸性蛋白阳性,巢蛋白阳性细胞在诱导2 h时一过性上升到63%,48 h时下降为1.6%.结论:骨髓间充质干细胞具有向神经细胞分化能力并且可以抑制混合淋巴细胞反应体系中淋巴细胞的增殖,对同种异体免疫反应具有负调节作用.     

骨髓间充质干细胞体外转化为神经细胞的环境特征

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养条件,体外定向诱导传代骨髓间充质干细胞向神经干细胞转化并进一步向神经细胞分化的环境,并对分化的神经元进行鉴定。方法:实验于2005-08/2007-03在南京大学医学院附属鼓楼医院科研部完成。①选用健康SD大鼠,分离纯化并培养大鼠骨髓间充质干细胞。②应用流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达,通过免疫表型鉴定骨髓间充质干细胞.③贴壁培养诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化,分为对照组和诱导剂组,对照组中不加诱导剂,诱导剂组分两步诱导:首先加入含终浓度均为10μg/L的表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子诱导分化剂,连续培养12 d:然后应用20μg/L的脑源性神经营养因子和1μmol/L的全反式维甲酸继续诱导6 d,分别收集诱导1 d,6 d,12 d,18 d的细胞进行细胞免疫荧光鉴定。结果:①传代第3代骨髓间充质干细胞为梭形成纤维样细胞,均一稳定的表达与间充质干细胞相关的表面抗原标记物CD29,CD44,CD90、阳性率分别为98.88%,96.90%.95.86%,但极少表达造血细胞标志CD34。②经碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子诱导12 d后诱导剂组巢蛋白阳性表达率为(89.24±2.12)%,而对照组细胞未表达巢蛋白。③经脑源性伸经营养因子和全反式维甲酸联合诱导6 d后,诱导剂组均可见微管相关蛋白2阳性细胞,大部分细胞转变为神经元样细胞形态;对照组微管相关蛋白2阴性.细胞形态仍为梭形成纤维样细胞。结论:实验采用并改良了全骨髓贴壁法,操作简单快速.细胞活性好,是一种较为理想的分离和纯化骨髓间充质干细胞的方法.骨髓间充质干细胞可分化成神经干细胞,进一步诱导分化为神经细胞。     

红景天苷体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞

背景：前期实验证明红景天苷能诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞定向分化,但是具体的影响方式尚不清楚。目的：以骨髓间充质干细胞为研究对象,进一步探讨红景天苷诱导其向神经元样细胞定向分化的作用方式和分子机制。方法：选取第2代Wistar大鼠骨髓间充质干细胞,按照不同的诱导剂分为维甲酸诱导组、红景天苷诱导组和对照组,通过不同的时间点对细胞进行观察。结果与结论：两诱导组细胞不同时间点神经干细胞标志物巢蛋白、神经细胞分化相关的兔抗微管蛋白和神经微管相关蛋白2表达阳性率均高于对照组（P〈0.01）;神经胶质纤维酸性蛋白阳性率维甲酸组显著高于红景天苷组（P〈0.01）。RealTime-PCR结果显示,维甲酸和红景天苷诱导不同时间,两组细胞均有神经细胞相关基因神经元特异性烯醇化酶、神经微管相关蛋白2mRNA表达,与诱导时间有关且不完全相同,两组间神经胶质纤维酸性蛋白mRNA的高丰度出现于诱导早期;诱导后两组神经元特异性烯醇化酶蛋白的表达随时间延长显著增加,兔抗微管蛋白表达出现于诱导早期。说明红景天苷能促进骨髓间充质干细胞向神经细胞分化,其诱导效应与维甲酸相似,且向神经元样细胞定向分化方面优于维甲酸。     

枸杞多糖诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞的分化

背景:近年研究表明,枸杞多糖具有很强的抗氧化作用,可以清除超氧阴离子(O2-·)和羟自由基(·OH),具备诱导剂的基本条件,但将其用作诱导剂的报道甚少.目的:以枸杞多糖作为诱导剂,探讨其体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的可行性.设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2008-09/12在辽宁医学院解剖实验室完成.材料:SD大鼠8只,由锦州医学院动物中心提供.枸杞多糖为宁夏杞瑞康有限公司产品.方法:无菌条件下取出大鼠股骨,利用贴壁筛选法体外分离培养骨髓间充质干细胞.取生长状态良好的第2代细胞进行诱导实验,将1×107L1细胞悬液1 mL接种于预先放置盖玻片的24孔板内,每孔加入1 mL预诱导液(含枸杞多糖1 g/L、体积分数为15%胎牛血清的DMEM完全培养基),置37℃、体积分数为5%的CO2孵箱内继续培养,24 h后更换诱导液(含1 g/L枸杞多糖的无血清DMEM培养基),于上述CO2孵箱内诱导.并设立添加全反式维甲酸的阳性对照组,以及空白对照组.主要观察指标:诱导过程中镜下动态观察细胞形态学变化.诱导第8,24 h采用免疫组织化学技术检测细胞内nestin,NF,GFAP的表达.结果:骨髓间充质干细胞原代培养24 h大部分贴壁生长,第3天进入指数生长期,细胞增殖加速,7～9 d接近汇合.传代细胞较原代细胞生长加快,第3代细胞纯度较高且增殖活跃,传至12代细胞仍然存活.预诱导后骨髓间充质干细胞形态无明显变化,诱导4 h后细胞变凸,从胞体伸出突起:24 h后细胞突起明显,突起相互连接呈网状,表现出典型的神经细胞形态.免疫组织化学检测结果显示,诱导后细胞浆内nestin,NF均呈阳性表达,GFAP呈阴性.结论:在体外枸杞多糖能够成功诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化神经元样细胞.     

人骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为神经元样细胞

背景:文献报道体外诱导骨髓间充质细胞定向分化为神经元样细胞多应用神经生长因子类多肽制剂,选择纯化学诱导剂尚不多见.目的:建立人骨髓间充质干细胞分离培养体系,体外定向诱导人骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞.方法:密度梯度离心、贴壁培养法和消化时间控制相结合分离纯化人骨髓间充质干细胞并鉴定,采用B一巯基乙醇和二甲基亚砜诱导分化为神经元样细胞,观察细胞形态,通过尼氏染色、NSE和NF-200免疫细胞化学染色对已分化的神经元样细胞进行鉴定和分化率分析.结果与结论:分离得到的骨髓间充质干细胞为成纤维样细胞,可见多个核仁,β-巯基乙醇和二甲基亚砜诱导后,间充质干细胞分化为神经元样细胞,伸出较长轴突样和树突样突起且有分支,诱导后的神经元样细胞胞质中存在着深蓝色颗粒状的尼氏小体,NSE、NF-200免疫荧光细胞化学染色均呈阳性,阳性率分别为(85.6±6.7)%和(73.2±5.6)%.结果证实采用密度梯度离心、贴壁培养法和消化时间控制相结合能够成功分离和培养人骨髓间充质干细胞,人骨髓间充质干细胞能够在诱导剂β-巯基乙醇和二甲基亚砜的诱导下体外诱导分化为神经元样细胞.     

音猬因子诱导恒河猴间充质干细胞向神经样细胞的分化

背景:骨髓间充质干细胞诱导分化为神经细胞,是神经系统疾病细胞治疗的有效手段,但目前的时效尚不完善.目的:应用神经发育音猬因子诱导恒河猴骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化.方法:应用经典的维甲酸方案与音猬因子方案两种方法诱导恒河猴骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞,采用密度梯度离心法分离培养恒河猴骨髓间充质干细胞,倒置相差显微镜观察生长情况,MTT法测定细胞生长曲线,流式细胞仪鉴定细胞表型,免疫组织化学鉴定分化细胞标志,透射电镜和扫描电镜观察分化细胞超微结构.结果与结论:体外分离培养的恒河猴骨髓间充质干细胞,经流式细胞仪表型鉴定,具有较高均一性.通过音猬因子诱导方案诱导处理7 d后,分化细胞多数表现为NSE、NF-M、Tau和Nestin染色阳性,经图像统计分析发现经音猬因子诱导方案神经干细胞标志物Nestin阳性率显著高于维甲酸诱导方案(P＜0.01),另一方面经维甲酸诱导方案诱导的细胞表现GFAP阳性率高于音猬因子诱导方案,差异具有显著性意义(P＜0.05).提示音猬因子诱导方案是一种诱导恒河猴骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化的有效途径.