CD14与TLR2、TLR4在天然免疫中的相互作用

CD1 4与Toll样受体 (TLRs)是天然免疫中重要的模式识别分子。CD1 4能够结合细菌内毒素脂多糖 (LPS) ,TLR2可以介导多种G+ 细菌细胞壁成分与细胞的反应 ,TLR4是介导LPS细胞内信号转导的关键分子。在天然免疫中CD1 4与TLR2 /TLR4协同作用 ,能够介导机体与多种病原体成分的反应。本文主要就CD1 4与TLR2 /TLR4的协同作用作一综述     

人正常肠上皮细胞内毒素信号转导相关受体mRNA的表达

目的 研究人正常肠上皮细胞内毒素信号转导相关受体TLR4、TLR2、CDl4和MD2 mRNA的表达情况，以及内毒素刺激对其表达的影响。方法 提取有、无内毒素刺激的培养人肠上皮细胞和阳性对照THP1细胞的总RNA，用RT—PCR方法检测TLR4、TLR2、CDl4和MD2 mRNA的表达。结果 和THP1细胞相比，人肠上皮细胞TLR4、TLR2、CDl4和MD2 mRNA的表达均较弱。内毒素刺激后，TLR4、CDl4和MD2 mRNA表达明显减弱，而TLR2的表达无显著变化。结论 人正常肠上皮细胞组成性低表达TLR4、CDl4和MD2 mRNA，且在受脂多糖(LPS)刺激后反应性下调其表达，这可能是肠上皮细胞(IEC)耐受LPS的关键机制之一，而TLR2在IEC耐受LPS的机制中可能不起主要作用。     

CD14与TLR2、TLR4在天然免疫中的相互作用

CD14与Toll样受体(TLRs)是天然免疫中重要的模式识别分子。CD14能够结合细菌内毒素脂多糖(LPS)，TLR2可以介导多种G^ 细菌细胞壁成分与细胞的反应，TLR4是介导LPS细胞内信号转导的关键分子。在天然免疫中CD14与TLR2／TLR4协同作用，能够介导机体与多种病原体成分的反应。本文主要就CD14与TLR2／TLR4的协同作用作一综述。     

阻断TLR2结合降低β2GP1-抗β2GP1复合物刺激的小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α的表达

目的探讨β2糖蛋白1(β2GP1)-抗β2GP1复合物诱导小鼠腹腔巨噬细胞表达肿瘤坏死因子α(TNF-α)中Toll样受体2(TLR2)的作用。方法用β2GP1-抗β2GP1复合物、TLR2激动剂Pam3CSK4及TLR4激动剂脂多糖(LPS)、TLR2阻断剂抗小鼠TLR2-Ig G(m TLR2-Ig G)及TLR4阻断剂TAK-242对BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞进行体外处理。用实时荧光定量PCR检测TNF-αmRNA水平,Western blot法及免疫荧光细胞化学方法检测TNF-α蛋白表达;采用流式细胞术检测小鼠腹腔巨噬细胞表面TLR2的水平。结果β2GP1-抗β2GP1复合物、Pam3CSK4及LPS均能够显著增加BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞表达TNF-αmRNA及蛋白水平,抗m TLR2-Ig G能够抑制上述刺激物促进细胞TNF-α表达的效应,但弱于TAK-242的抑制效应,抗m TLR2-Ig G与TAK-242联合使用未显示更强的抑制效应。流式细胞术结果显示,β2GP1-抗β2GP1复合物、Pam3CSK4及LPS均能增加小鼠腹腔巨噬细胞TLR2的表达,而抗m TLR2-Ig G、TAK-242以及二者联合使用均未显示对TLR2表达的抑制效应。结论TLR4、TLR2都增强β2GP1-抗β2GP1复合物对小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α的刺激作用。     

Toll样受体4信号转导研究进展

Toll样受体（Toll-like-receptors,TLRs）是一个主要分布于炎症细胞的识别病源分子的受体超家族,其中TLR4主要识别革兰阴性细菌细胞壁成分脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）。LPS与TLR4结合后活化髓样分化因子88 (myeloid differentiation factor 88, MyD88)依赖性和非依赖性两条信号途径;前者活化丝裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）和核因子-κB（nuclear factor kappa B,NF-κB）信号通路,后者活化NF-κB和干扰素调节因子-3(IFN-regulated factor-3,IRF3)信号通路。通过这些信号途径TLR4诱导炎症细胞释放炎症因子介导炎症反应;同时TLR4通过活化树突状细胞促进抗原递呈,介导先天性免疫向获得性免疫的转化。此外,TLR4能诱导磷脂酰肌醇-3激酶-蛋白激酶B（PI3K-AKT）的信号转导,LPS介导的细胞存活和增殖与TLR4活化 PI3K-AKT途径有关。     

Fasudil通过TLR4通路抑制脂多糖诱导的小鼠BV-2小胶质细胞TNF-α和IL-1β的表达

目的探讨Fasudil对脂多糖(LPS)诱导BV-2小胶质细胞系促炎细胞因子表达中的作用。方法体外培养BV-2小胶质细胞系,实验分为PBS对照组、LPS刺激组、LPS联合Fasudil干预组,ELISA检测细胞TNF-α、IL-1β的释放,Griess法检测NO释放水平,流式细胞术检测Toll样受体4(TLR4)、TLR2蛋白表达。结果 LPS刺激BV-2细胞可导致TNF-α、IL-1β和NO的释放明显增加,还可导致炎性信号通路中的受体TLR4表达明显增加。Fasudil能明显抑制炎性因子的释放和TLR4的表达。结论 Fasudil可抑制LPS诱导的小胶质细胞NO、TNF-α和IL-1β释放,其作用机制可能与Fasudil下调TLR4通路有关。     

人TLR2和TLR4胞外区cDNA的克隆

目的 从脂多糖诱导的外周血单个核细胞克隆人Toll样受体2(TLR2)和Toll样受体4(TLR4)胞外区cDNA.方法 用不同浓度脂多糖在不同时间刺激单个核细胞后提取总RNA,RT-PCR方法半定量测定TLR2和TLR4的表达,应用pUCm-T载体克隆胞外区cDNA,双酶切以及DNA测序进行鉴定.结果 单个核细胞在四种浓度脂多糖刺激3 h,6 h和12 h后.TLR2和TLR4表达并不相同.15 μg/mL脂多糖作用6 h TLR2表达最高,10 μg/mL脂多糖作用3 hTLR4表达最高.经RT-PCR扩增TLR2和TLR4胞外区cDNA分别为1 700 bp和1 900 bp,T载体克隆、酶切鉴定及测序分析后证实,目的 片段与GenBank中序列一致.结论 脂多糖的诱导对外周血单个核细胞TLR2和TLR4表达有显著影响,并且成功克隆了胞外区cDNA.     

LPS介导滋养层细胞TLR4信号传导通路对HBD-2表达的影响

目的研究LPS体外刺激滋养层细胞是否诱导表达HBD-2,并进一步探讨该表达与TLR4信号传导通路的关系。方法建立不同孕周的滋养层细胞原代培养体系,应用TLR4阻断剂预处理滋养层细胞30 min前后,给予不同质量浓度的LPS(25、50、100、200、400 ng/ml)作用72 h,采用SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR技术检测滋养层细胞HBD-2 mRNA的表达。结果 1)LPS能诱导滋养层细胞HBD-2 mRNA表达,且这种表达与其具有浓度和时间依赖性;当质量浓度为200 ng/ml,刺激24 h时,HBD-2 mRNA的相对表达量最高;2)TLR4阻断剂能抑制LPS对滋养层细胞表达HBD-2 mRNA的诱导作用,与未阻断之前相比差异具有统计学意义(P<0.01)。结论 LPS可能通过TLR4信号传导通路诱导滋养层细胞表达HBD-2 mRNA,将为宫内感染防治提供新靶点。     

栀子苷下调Toll样受体4表达并拮抗脂多糖诱导的小胶质细胞炎性反应

目的:观察栀子昔对细菌脂多糖(LPS)诱导的BV2小胶质细胞炎性反应的影响并探讨其作用机制。方法:LPS诱导BV2小胶质细胞活化,CCK-8方法检测细胞存活率,Griess法测定NO释放量,ELISA测定肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-1β(IL-1β)含量,免疫印迹检测Toll样受体4(TLR4)蛋白表达。结果:栀子苷在10～100μg/ml浓度范围内对小胶质细胞活力影响不显著,此浓度范围内,栀子苷剂量依赖性的减少LPS诱导的NO、TNF-α和IL-1β释放。此外,栀子苷还可抑制LPS诱导的BV2细胞形态活化改变,并降低LPS诱导的TLR4蛋白表达。结论:栀子苷可以拮抗LPS诱导的BV2小胶质细胞炎性反应,其机制可能与下调TLR4信号通路有关。     

LPS通过TLR4信号通路诱导人肾小管上皮细胞株(HK-2)表达hBD-2

目的研究LPS体外刺激人肾小管上皮细胞株(HK-2)是否诱导表达hBD-2,并进一步探讨该表达与TLR4/NF-κB信号传导通路的关系。方法给予不同质量浓度的LPS(0.01、0.1、1、10μg/ml)刺激HK-2细胞12 h,再应用TLR4及NF-κB阻断剂预处理HK-2细胞1 h后,给予质量浓度为1μg/ml的LPS作用12 h,采用实时荧光定量PCR检测HK-2细胞hBD-2 mRNA的表达,ELISA检测细胞上清中hBD-2的表达。结果 1)LPS能诱导HK-2细胞hBD-2 mRNA及蛋白的表达,且这种表达具有质量浓度依赖性;2)TLR4阻断剂能抑制LPS对HK-2细胞表达hBD-2的诱导作用,与未阻断之前相比差异具有统计学意义(P<0.01);3)NF-κB阻断剂能抑制LPS对HK-2细胞表达hBD-2的诱导作用,与未阻断之前相比差异具有统计学意义(P<0.01)。结论 LPS可能通过TLR4/NF-κB信号传导通路诱导HK-2细胞表达hBD-2,将为泌尿系统感染防治提供新靶点。     

Lewis肺癌细胞TLR4对Foxp3表达的调控

目的:探讨小鼠Lewis肺癌(Lewis lung cancer,LLC)细胞中TLR4对Foxp3表达的调控作用。方法:选择LPS为配体活化TLR4,采用RT-PCR方法检测LPS在不同浓度(0,1,10μg/ml)和不同时间点(12,24,36,48小时)Foxp3 mRNA的表达量的变化,流式细胞术检测有效浓度LPS 10μg/ml和最佳作用时间点24小时Foxp3蛋白和TLR4蛋白表达量的变化,RT-PCR和流式细胞术检测anti-TLR4/MD2抗体阻断TLR4后再用LPS刺激LLC细胞Foxp3表达量的变化。结果:LPS在10μg/ml浓度作用LLC细胞后可显著上调Foxp3 mRNA的表达量,与未刺激组相比差异显著(P<0.05);LPS最佳作用时间为24小时;LPS在10μg/ml浓度作用LLC细胞24小时后可显著上调Foxp3蛋白和TLR4蛋白的表达量,与对照组相比差异显著(P<0.05);阻断TLR4后再用LPS刺激LLC细胞,Foxp3的表达量较未阻断组明显降低(P<0.05)。结论:LLC细胞TLR4蛋白参与对Foxp3的表达调控,TLR4可能是Foxp3的上游信号分子。     

sTLR4 的研究进展

TLR4 是第一个被发现的哺乳动物的Toll 样受体(TLRs),广泛表达于哺乳动物细胞表面,能识别病原体的入侵,通过识别配体,激活核转录因子kappa B(NF-κB),进而触发炎症反应。近年来,在体液中发现了一种可溶性形式TLR4(sTLR4)。sTLR4 来自TLR4 mRNA 的可变剪切,广泛存在于各种体液中。sTLR4 主要通过与MD鄄2 形成复合体,抑制LPS 信号通路,从而抑制LPS 引起的炎症反应。sTLR4 作为炎症的诊断工具;作为某些炎症的拮抗剂,抑制炎症反应;替代细胞膜上TLR4受体的胞外域,用于研究信号分子与TLR4 的相互作用;作为某些癌症的预后指标。     

附睾上皮细胞表达功能性的TLR-2和TLR-4

目的:研究附睾上皮细胞中功能性TLR2和,TLR4的表达情况.方法:采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、Western blot和免疫荧光方法探索原代培养大鼠附睾上皮细胞中TLR2和,TLR4的表达情况,同时利用ELISA分别以磷壁酸(LTA)和细菌脂多糖(LPS)对附睾上皮细胞进行功能性检测.结果:TLR2和TLR4在mRNA水平、蛋白水平和细胞水平上在附睾上皮细胞均有表达,TLR2和TLR4的配体LTA和LPS均能激活附睾上皮细胞的天然免疫反应,产生炎症因子TNF-α和IL-1β,差异有统计学意义.结论:附睾上皮细胞表达功能性的TLR2和,TLR4.     

Toll样受体4和巨噬细胞移动抑制因子对血管内皮细胞生物活性的影响

目的:探讨Toll样受体4(TLR4)和巨噬细胞移动抑制因子(MIF)对ECV304内皮细胞增殖、黏附及炎症因子水平的影响。方法:ECV304细胞经TLR4 MIF单克隆抗体(mAb)和脂多糖(LPS)处理后,通过3H-TdR掺入实验、黏附实验和放射免疫分析研究细胞增殖、黏附和细胞因子水平。结果:LPS(10 mg/L)明显促进ECV304细胞TLR4的表达,而抗MIF mAb(10、50 mg/L)明显抑制其表达。抗MIF(50 mg/L)和抗TLR4mAb(1 mg/L)明显抑制了ECV304细胞的增殖,而LPS(10 mg/L)明显促进增殖。抗MIF mAb明显抑制了人外周血淋巴细胞对ECV304细胞的黏附,而LPS和抗TLR4 mAb对黏附无显著影响。抗MIF、抗TLR4 mAb明显抑制ECV304细胞TNFα的分泌,并呈剂量依赖,而LPS作用相反。与对照组相比,LPS(1 mg/L,48 h)可以促进ECV304细胞IL-8的分泌,抗MIF mAb(50 mg/L,48 h)可以明显抑制IL-8的分泌(P0.05)。但是抗TLR4 mAb(1 mg/L)对ECV304细胞IL-8的分泌无明显影响。结论:LPS、抗TLR4及抗MIF mAb对血管内皮细胞TLR4表达及活性有显著影响。     

LPS受体及其信号传导通路

细菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)可激活单核细胞、臣噬细胞及内皮细胞,引起细胞因子合成和释放,导致全身性炎症反应发生.而LPS跨膜信号转导是引起细胞效应的关键.本文主要综述与LPS的跨膜信号转导有关Toll样受体一TLR2(Toll-like receptor 2)和(TLR4Toll-like receptor4)的结构特点、配体范围、基因表达调节以及信号转导机制.正是Toll样受体直接将LPS刺激信号传入细胞内,激活NF-κB信号途径,导致效应基因的表达.     

内毒素的跨膜信号及其在失控性炎症反应发生中的作用

大约20年前,人们还曾认为LPS诱导宿主细胞的激活是由于其分子上的脂质A残基插入靶细胞浆膜内所致（2）,但这一观点随着近年来炎性细胞表面和血循环中能与LPS结合的蛋白质分子的发现已发生变化。目前普遍认为,LPS的作用是通过这些分子或受体介导的,现已发现单核/巨噬细胞表面存在多种LPS受体,如清道夫受体（scavengerreceptor,SR）、CD14、TLR2、TLR4、β2整合素、L－selectin等,这些受体构成了自身与非自身识别的重要分子基础,是机体调控LPS诱导炎症反应的始动环节。     

DC-SIGN/TLR4调控肾小管上皮细胞炎症反应研究

探讨肾小管上皮细胞天然免疫分子DC-SIGN与TLR4相互作用,以及对肾小管上皮细胞炎症反应的调控影响。采用免疫组化检测慢性肾炎患者肾组织DC-SIGN及TLR4表达;体外培养肾小管上皮细胞株(HK-2)并经LPS刺激,采用免疫共沉淀实验和荧光免疫组化检测DC-SIGN与TLR4结合及细胞表面共定位状况;ELISA检测经转染DC-SIGN siRNA后HK-2分泌IFN-β、TNF-α的变化,以及western blot检测TLR4信号通路中IKKε、p38、JNK及NF-κB的磷酸化水平。结果显示,慢性肾炎患者肾小管上皮细胞均显著表达DC-SIGN及TLR4,利用HK-2模拟炎症状态给予LPS刺激后,DCSIGN与TLR4可发生相互结合并共定位于细胞表面,且HK-2明显分泌炎症因子IFN-β、TNF-α,这一状况可被经转染DC-SIGN siRNA后予以抑制,且发现在此状态下TLR4-MyD88依赖途径信号分子p38、JNK磷酸化水平则显著上升,而TLR4-MyD88非依赖途径的IKKε、NF-κB磷酸化水平无明显变化。结果表明,肾小管上皮细胞炎症状态下可通过表达DC-SIGN,并与TLR4结合且相互作用,促进炎症因子分泌,从而调节肾小管上皮细胞炎症反应。提示可能与DC-SIGN和TLR4发生信号串话,并调控TLR4-MyD88非依赖途径有关。     

Toll样受体4信号转导研究进展

Toll样受体4(TLR4)作为LPS信号转导受体,在与LPS反应时可形成一个由TLR4和MD 2构成的复合体,其在细胞内的信号转导依赖于不同的接头蛋白。在早期反应时,TLR4依赖MyD88和Mal可导致NF кB激活;而在后期反应中,通过TRIF和TRAM可引起NF кB和IRF3的迟发激活。由此诱导细胞因子、化学趋化因子和其他转录因子的表达。     

4-1BB信号对小鼠树突状细胞表面TLR4表达的调节

目的 探讨4-1BB（CD137）激发型单克隆抗体2A对小鼠骨髓来源的树突状细胞（DC）表面TLR4表达的调节.方法 用不同剂量2A、LPS以及2A与LPS联合,或用LPS预刺激后再加入2A,以流式细胞术检测这些处理因素作用下DC表面TLR4表达情况.结果 LPS可下调DC TLR4的表达,下调作用可维持24 h,而2A可使DC TLR4的表达上调,上调作用可维持12 h,并可拮抗LPS对TLR4的下调作用.用LPS预处理DC后再加入2A,也可拮抗LPS的下调作用.结论 4-1BB信号可以上调DC表面TLR4的表达.     

人TLR4胞外段的克隆、表达及功能活性分析

目的:获得高纯度、高活性的人TLR4胞外段蛋白。方法:采用PCR方法从含人TLR4 cDNA的质粒pCDNA3-TLR4中扩增人TLR4胞外段基因片段,将其插入载体pET32a并导入大肠杆菌BL21(DE3)plysS中表达。用Ni2+-NTA琼脂糖柱纯化融合蛋白。SDS-PAGE和免疫印迹分析目的蛋白的相对分子质量和抗原性,ELISA和FCM鉴定其功能活性。结果:获得1 911 bp的人TLR4胞外段基因片段,构建成重组表达载体pET32a-TLR4并在大肠杆菌中表达。TLR4-Trx融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的12%,其纯度较高。ELISA和FCM检测显示,TLR4-TrX融合蛋白不仅与配体LPS结合,还能竞争性抑制LPS与THP1细胞结合。结论:所获TLR4-Trx融合蛋白纯度高,功能活性好,为进一步研究TLR相关的免疫调节机制提供物质基础。